粉紅香水百合離體培養(yǎng)與植株再生

涂紅艷，肖　望，華秀香，梁什娟

(廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 廣東 廣州 510303)

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粉紅香水百合離體培養(yǎng)與植株再生

涂紅艷，肖望*，華秀香，梁什娟

(廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 廣東 廣州 510303)

摘要:以粉紅香水百合花絲、花柱和子房為外植體進(jìn)行了離體培養(yǎng)，研究了不同外植體和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生的影響.結(jié)果表明：三種外植體中，花絲愈傷組織誘導(dǎo)率最高，在光照條件下為40%，在黑暗條件下為50%.培養(yǎng)基中含有2.0 mg/L picloram有利于進(jìn)行愈傷組織增殖，增殖倍數(shù)高達(dá)6.29；愈傷組織分化成小鱗莖最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；在MS+1.5 mg/L NAA+ 0.1% 活性炭的生根培養(yǎng)基中，生根效果最好.再生植株經(jīng)過(guò)馴化移栽到室外，30 d后成活率為90%.

關(guān)鍵詞:粉紅香水百合；離體培養(yǎng)；植株再生

0引言

香水百合(LiliumcasaBlanca)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)東方百合雜交系統(tǒng)的多年生草本植物.香水百合花朵碩大，花色美麗，香氣芬芳四溢，深受人們喜愛(ài).香水百合的生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，約110d，品種豐富，顏色有白色、粉紅色、紫色，白色帶紅色斑點(diǎn)，紅色帶紫色斑點(diǎn)等，目前已成為花卉市場(chǎng)上的暢銷(xiāo)品種之一[1-4].香水百合為雜交種，有性繁殖后代易出現(xiàn)性狀分離，并且播種苗的生育周期較長(zhǎng).通常采用分鱗莖、分珠芽、扦插的無(wú)性繁殖方法進(jìn)行繁殖[4]，但繁殖系數(shù)比較低，而且長(zhǎng)期的無(wú)性營(yíng)養(yǎng)繁殖易感染病毒，導(dǎo)致品種優(yōu)良種性退化，影響產(chǎn)量和質(zhì)量[5-6].利用組織培養(yǎng)技術(shù)，既可加快繁殖速度，消除病毒在體內(nèi)的積累，還可以與基因工程相結(jié)合，為百合育種提供新方法.目前，對(duì)香水百合的組織培養(yǎng)主要是以鱗片為外植體誘導(dǎo)再生植株[1-7]，以花器官為外植體進(jìn)行植株再生的試驗(yàn)較少[8-9].

本實(shí)驗(yàn)以粉紅色香水百合(簡(jiǎn)稱(chēng)粉紅香水百合)的花絲、花柱和子房為外植體，研究了不同種類(lèi)和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在粉紅香水百合愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、分化以及鱗莖苗生根中的影響，建立穩(wěn)定的快速繁殖體系，為香水百合的規(guī)?；缂斑M(jìn)一步生物技術(shù)研究提供技術(shù)支持.

1材料與方法

1.1材料

供試材料粉紅香水百合(LiliumcasaBlanca) 于2012年12月購(gòu)于廣東嶺南花卉市場(chǎng).

2方法

1.2.1粉紅香水百合愈傷組織的誘導(dǎo)

取粉紅香水百合剛現(xiàn)蕾的小花苞(長(zhǎng)度3～5cm)，用自來(lái)水沖洗30min去除表面污物，于超凈工作臺(tái)上用75%酒精進(jìn)行表面消毒30s，再用0.1%HgCl2消毒10min，無(wú)菌水洗滌5～6次.除去花苞外層花瓣，用剪刀和鑷子把花冠切開(kāi)，將花絲、花柱和子房分離出，切成0.5cm長(zhǎng)的小段，分別接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.0mg/Lpicloram(毒莠定)，進(jìn)行光照和黑暗培養(yǎng).30d后記錄外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率.

誘導(dǎo)率(%)= (產(chǎn)生愈傷組織的外植體個(gè)數(shù) / 接入外植體個(gè)數(shù))× 100%

1.2.2愈傷組織的增殖

挑選0.7g色澤鮮黃、顆粒狀的愈傷組織接種在不同的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1.黑暗條件下培養(yǎng)60d后取出稱(chēng)重，記錄愈傷組織的增殖倍數(shù)及增殖過(guò)程中的形態(tài)變化.

愈傷組織增殖倍數(shù) = 新生愈傷組織的質(zhì)量(g) / 接種愈傷組織的質(zhì)量(g).

表1愈傷組織增殖培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的組成

培養(yǎng)基picloram(mg/L)2,4-D(mg/L)control00P11.0P22.0D11.0D22.0

注：愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基

1.2.3愈傷組織的分化

選擇增殖獲得的質(zhì)地均一、致密塊狀愈傷組織接種在含不同濃度6-BA(0、1.0、2.0、3.0mg/L)的MS+0.2mg/LNAA的分化培養(yǎng)基中，分別在光照、黑暗+光照兩種條件下進(jìn)行培養(yǎng).黑暗+光照培養(yǎng)時(shí)，愈傷組織10d后移出到光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)15d，25d后統(tǒng)計(jì)光照和黑暗+光照培養(yǎng)下愈傷組織分化所得小鱗莖數(shù)目.

1.2.4生根培養(yǎng)和移栽

取分化得到的長(zhǎng)勢(shì)一致小鱗莖,接種到添加不同濃度NAA(0、0.5、1.0、1.5mg/L)的MS+0.1% 活性炭的生根培養(yǎng)基上.每個(gè)處理15個(gè)重復(fù)，30d后觀察并統(tǒng)計(jì)根系的生長(zhǎng)狀況.

選擇具有良好根系、鱗莖健壯的幼苗(高3cm以上)作為移栽苗.移栽前，瓶苗置室內(nèi)靠窗自然散射光下煉苗2～3d，打開(kāi)瓶蓋繼續(xù)煉苗4～5d.將苗輕輕移出，用流水沖洗掉附著在苗上的培養(yǎng)基，移栽至經(jīng)過(guò)高溫滅菌的營(yíng)養(yǎng)土:泥土(體積比1∶1)的基質(zhì)中.用1/4MS營(yíng)養(yǎng)液澆透保濕，每天噴霧一次，每周用1/4MS營(yíng)養(yǎng)液澆一次，觀察其生長(zhǎng)情況，30d后統(tǒng)計(jì)成活率.

1.2.5培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)處理

以上所有培養(yǎng)基都采用固體形式，含蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8.培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照培養(yǎng)為每天光照16h，光照強(qiáng)度為2000lx，黑暗培養(yǎng)采用完全黑暗條件.所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.用SPSS13.0 數(shù)據(jù)處理軟件分析各處理之間的差異顯著性.

2結(jié)果與分析

2.1外植體和培養(yǎng)條件對(duì)粉紅香水百合愈傷組織誘導(dǎo)的影響

花絲在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)15d，大部分外植體膨大，部分外植體切口處開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織；30d后，在光照培養(yǎng)下，誘導(dǎo)出瘤狀和根莖狀，顏色為綠色的愈傷組織(圖1-a)，愈傷組織誘導(dǎo)率為40%；在黑暗培養(yǎng)下，所誘導(dǎo)的愈傷組織呈疏松顆粒狀，顏色有黃白色、乳白色和淺黃色(圖1-b)，愈傷組織誘導(dǎo)率為50%.

花柱和子房接入培養(yǎng)基后，只出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，沒(méi)有誘導(dǎo)出愈傷組織，隨后絕大部分外植體壞死.

圖1　在不同培養(yǎng)條件下從花絲誘導(dǎo)出的愈傷組織

2.2不同種類(lèi)和濃度的激素對(duì)愈傷組織增殖的影響

將在黑暗培養(yǎng)條件下從花絲誘導(dǎo)出的黃色、疏松顆粒狀愈傷組織接種到繼代增殖培養(yǎng)基中. 在含picloram的培養(yǎng)基中，愈傷組織20d左右恢復(fù)生長(zhǎng)，之后快速增殖，60d左右達(dá)到增殖高峰，但愈傷組織形態(tài)沒(méi)有明顯變化，仍然呈黃色、疏松顆粒狀.當(dāng)picloram濃度為1.0mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)為5.67，當(dāng)picloram濃度為2.0mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)高達(dá)6.29(表2所示).而在含2,4-D的增殖培養(yǎng)基中，愈傷組織需30d左右恢復(fù)生長(zhǎng)，增殖速度較慢，并且隨著2,4-D濃度的增加，增殖倍數(shù)逐漸降低，當(dāng)2,4-D濃度為2.0mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)只有2.89倍，但愈傷組織形態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生了黃色、致密塊狀的愈傷組織，部分愈傷組織長(zhǎng)出少許白色小鱗莖和根毛.

綜上所述，當(dāng)培養(yǎng)基中含有2.0mg/L的picloram，愈傷組織的增殖速度最快。

表2　植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織增殖的影響

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.不同小寫(xiě)字母(p<0.05)表示差異顯著，下同.

2.36-BA的濃度和培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織分化的影響

將所獲得的質(zhì)地均勻、致密塊狀的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中促進(jìn)其進(jìn)一步分化，發(fā)現(xiàn)6-BA濃度對(duì)愈傷組織分化成小鱗莖影響較大(表3).隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織分化形成的小鱗莖數(shù)目逐漸增加，當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L時(shí)，分化形成的小鱗莖數(shù)目最多，從每克愈傷組織可獲得51.9個(gè)小鱗莖；但隨著6-BA濃度進(jìn)一步升高為3.0mg/L時(shí)，分化形成的小鱗莖數(shù)目減少.

表36-BA和培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織分化的影響

6-BA/(mg/L)小鱗莖數(shù)(個(gè)/g愈傷組織)光照黑暗+光照027.7±12.95b12.8±6.59c1.036.4±9.13a28.0±6.02b2.038.1±8.18a51.9±4.97a3.015.7±1.46c37.8±5.57b

注：黑暗+光照條件為先在黑暗條件下培養(yǎng)

10d，再轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)15d.

培養(yǎng)條件對(duì)小鱗莖的形成和品質(zhì)有一定影響.在黑暗條件下，培養(yǎng)7d時(shí)從愈傷組織分化出白色的小鱗莖，10d后將白色粗壯的小鱗莖(圖2-b)轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，小鱗莖逐漸轉(zhuǎn)綠， 25d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，從每克愈傷組織最高可獲得51.9個(gè)小鱗莖，小鱗莖生長(zhǎng)正常，在生根培養(yǎng)基中可發(fā)育為健壯的試管苗.在光照條件下，培養(yǎng)15d后愈傷組織逐漸分化出綠色的小鱗莖(圖2-a)，25d后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，從每克愈傷組織最高可獲得38.1個(gè)小鱗莖，部分小鱗莖外層鱗片發(fā)育成葉片狀，在生根培養(yǎng)基中不能展開(kāi)發(fā)育成正常的試管苗. 綜上所述，從愈傷組織分化小鱗莖的最適培養(yǎng)基組成為MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，黑暗培養(yǎng)10d后再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)條件.

圖2　在光照(a) 或黑暗(b)培養(yǎng)條件下愈傷　　　　　　　組織分化形成的小鱗莖

2.4NAA對(duì)小鱗莖生根的影響

將分化所得的小鱗莖接種到不同的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，7d后小鱗莖開(kāi)始生根、長(zhǎng)葉，鱗莖增大變粗，一定濃度的NAA有利于試管苗生根.如表4所示，隨著NAA濃度的增加，鱗莖苗不僅生根多，而且葉片逐漸展開(kāi)，苗變得健壯，當(dāng)NAA濃度為1.5mg/L時(shí)，鱗莖苗生根最多，根長(zhǎng)而粗，苗最健壯.而在不含NAA的培養(yǎng)基中，鱗莖苗根細(xì)弱，葉片卷縮，無(wú)法展開(kāi)，部分葉片黃化.

表4NAA濃度對(duì)小鱗莖生根的影響

NAA/(mg/L)株高(cm)根數(shù)根長(zhǎng)(cm)03.57±0.20b3.60±0.33b1.79±0.23b0.53.57±0.23b4.44±0.80a1.88±0.20b1.03.64±0.48b3.82±0.46b2.38±0.19b1.54.90±0.33a4.92±0.77a4.92±0.77a

將具有良好根系、鱗莖健壯的再生植株(高3cm以上)煉苗后移栽在花盆中，7d后幼苗開(kāi)始長(zhǎng)出新葉和幼根，30d后統(tǒng)計(jì)其成活率為90%.

3討論

外植體的生理狀態(tài)對(duì)百合愈傷組織的形成和植株再生影響很大，取材部位和發(fā)育階段不同，再生能力存在較大差異.Arzate等[10]以麝香百合(Lilium longiflorum)的花絲為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)愈傷組織分化再生植株.Nhut等[11]用麝香百合的花梗、花托、花瓣、花柱等外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果花托最易成活，且誘導(dǎo)率最高.柳玉晶等[12]以東方百合(Lilium‘Orientalhybrid’)的花柱、花絲、花瓣為外植體誘導(dǎo)愈傷組織分化再生植株, 只有花絲可以產(chǎn)生大量?jī)?yōu)質(zhì)的胚性愈傷組織.本實(shí)驗(yàn)以粉紅香水百合的花絲、子房和花柱等為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有花絲能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，這與文獻(xiàn)報(bào)道的情況一致.

有研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素picloram在百合屬植物愈傷組織誘導(dǎo)和保持方面起重要生理作用[13-14].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中含生長(zhǎng)素picloram時(shí)，粉紅香水百合不僅愈傷組織誘導(dǎo)率高，而且增殖速度快，愈傷組織形態(tài)沒(méi)有明顯變化，呈疏松顆粒狀，多次繼代也能維持良好狀態(tài)，這與張藝萍等人[15]的研究一致.但實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)當(dāng)愈傷組織在含2,4-D的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，增殖速度慢，形態(tài)卻發(fā)生了轉(zhuǎn)變，由疏松顆粒狀轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅軌K狀，將這些致密塊狀的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中能很快分化出小鱗莖. 2,4-D在粉紅香水百合愈傷組織狀態(tài)改變上所起的作用有待進(jìn)一步的探討.

Ishimori等[16]認(rèn)為紅點(diǎn)百合(Lilium rubellum)在黑暗條件下誘導(dǎo)出的試管鱗莖數(shù)量最多.孫紅梅等[17]認(rèn)為亞洲百合(LiliumAsiatichybrid)光培養(yǎng)誘導(dǎo)出試管小鱗莖的數(shù)目要多于暗培養(yǎng)，但小鱗莖的直徑要小于暗培養(yǎng). 在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)光暗培養(yǎng)結(jié)合對(duì)粉紅百合小鱗莖的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，分化出的小鱗莖數(shù)量最多且鱗莖粗壯.本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)較低濃度的生長(zhǎng)素有利于百合生根從而有利于獲得良好的再生植株[18-19].

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收稿日期：2016-03-11

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030302097)；廣東省創(chuàng)新強(qiáng)校工程省級(jí)重大項(xiàng)目(自然科學(xué)類(lèi)，2014KZDXM076)；廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014J4100151)；廣東省高等院校學(xué)科與專(zhuān)業(yè)建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2013KJCX0137)

作者簡(jiǎn)介：涂紅艷，女，江西吉安人，廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院講師.

*通訊作者：肖望，女，湖北潛江人，廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院教授，博士.

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 943.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-3798(2016)03-0075-05

A Study on in vitro Culture and PlantRegenerationofLiliumcasaBlanca

TUHong-yan，XIAOWang*，HUAXiu-xiang，LIANGShen-juan

(BiologyandFoodEngineeringInstitute,GuangdongUniversityofEducation,Guangzhou，Guangdong， 510303，P.R.China)

Abstract:Using the filaments, styles and ovaries of Lilium casa Blanca as the explants to in vitro culture, the effect of callus induction and plant regeneration of different explants and different plant growth regulators were studied in this paper. The results indicated that in three types of explants, the ability of inducing calli from filaments was the best, the inducing rates of filaments was 40% in light culture and 50% in dark culture. The calli being cultured on MS medium with 2.0 mg/L picloram was helpful for proliferation of calli, the callus proliferation times was 6.29. The optimum medium for bulblets formation was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The optimum medium for rooting culture was MS+1.5 mg/L NAA+ 0.1% activated carbon. Regenerated plantlets were acclimatized and transplanted outdoors, the survival rate was 90% in a month.

Key words:Lilium casa Blanca; in vitro culture; plant regeneration