熱射病后不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞計數(shù)的變化①

萬明勝，張云，吳士文，

熱射病后不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞計數(shù)的變化①

萬明勝1，張云2，吳士文1，2

目的觀察熱射病后大鼠海馬組織CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量隨時間的變化。方法Sprague-Dawley大鼠分為對照組（n=5）和熱射病組（n=14），后者又分為7 d、21 d兩個亞組，每亞組7只。熱射病組建立熱射病模型，于預定各個時間點取大鼠腦組織進行尼氏染色，計數(shù)海馬CA1區(qū)存活錐體細胞。結(jié)果熱射病組海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)明顯減少（F=11.80，P＜0.01），其中21 d亞組低于7 d亞組（P＜0.05）。結(jié)論熱射病后海馬組織CA1區(qū)錐體神經(jīng)細胞隨時間減少，可能是導致學習、記憶受損的原因之一。

熱射?。缓ｑR；錐體細胞；大鼠

［本文著錄格式］萬明勝，張云，吳士文.熱射病后不同時間點大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞計數(shù)的變化［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（7）:793-796.

CITED AS:Wan MS，Zhang Y，Wu SW.Variability of pyramidal neurons in hippocampal CA1 area with time after heat stroke in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:793-796.

熱射?。╤eat stroke，HS）是中暑中最為嚴重的類型，是指高熱（核心體溫＞40℃）伴神志障礙。腦是熱射病早期最易受損的器官，尤以小腦和海馬損害為甚。隨著全球氣候逐漸變暖，熱浪天氣頻繁發(fā)生［1］，高溫所致的熱射病給人類健康帶來嚴重威脅，熱射病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害具有很高的致死率和致殘率。

既往已有多項研究發(fā)現(xiàn)，熱射病后海馬組織細胞數(shù)量減少，但缺乏定量研究。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，熱射病后存在學習、記憶功能受損［2］。

本文觀察熱射病后不同時間大鼠海馬組織CA1區(qū)錐體細胞數(shù)，探討熱射病后學習、記憶能力受損的機制，并探討可能的評價腦組織損傷嚴重程度的方法。

1材料與方法

1.1主要實驗試劑及儀器

戊巴比妥鈉：SIGMA公司。尼氏染色液試劑盒：北京雷根生物技術(shù)有限公司。PowerLab/4SP多通道生理記錄儀：ADInstruments公司。XMZ404電子溫度傳感器、動脈壓力傳感器：成都儀器廠。冰凍切片機：德國徠卡公司。DP70顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.2實驗動物及分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠19只，8周齡，體質(zhì)量260～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。每籠5～6只飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（25±0.5）℃，12 h晝夜周期，自由飲食。適應環(huán)境5 d。實驗過程中對動物的處置符合醫(yī)學倫理學標準。

大鼠分為對照組（Sham，n=5）和熱射病組（HS，n= 14），其中熱射病組又分為熱射病后7 d組（HS7）和熱射病后21 d組（HS21），均7只。

1.3模型建立

3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉。

Sham組股動脈插管，監(jiān)測動脈壓。置于溫度（25± 0.5）℃、濕度25%環(huán)境中。蘇醒后獨籠飼養(yǎng)在（25± 0.5）℃動物房內(nèi)，12 h晝/夜周期，自由飲食。

HS組股動脈插管，監(jiān)測動脈壓及直腸溫度，置于溫、濕度控制箱中，暴露于（39.5±0.2）℃、濕度13.5%環(huán)境中，約90～120 min，大鼠核心體溫≥42℃或平均動脈壓降至50 mmHg后，迅速拔出股動脈插管，予4℃涼水沖洗10 min。蘇醒后獨籠飼養(yǎng)在（25± 0.5）℃動物房內(nèi)，12 h晝/夜周期，自由飲食。

1.4病理切片制備

1.4.1取材與切片

各組大鼠于預定時間，Sham組于術(shù)后第2天，予3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于鼠板上，灌注用輸液瓶高于操作臺約1.5 m。大鼠左側(cè)胸骨旁線剪開胸腔，暴露心臟和左側(cè)胸腔，從左心室插入灌注針至主動脈根部，注意勿損傷室間隔；縫線固定針頭，夾閉胸主動脈，剪開右心耳，灌入4℃預冷生理鹽水約100 ml，直至大鼠眼球、雙前肢變白，右心耳流出清亮灌注液體；繼以4℃預冷4%多聚甲醛灌注固定約100 ml，先快后慢，至大鼠前肢、后頸部肌肉僵硬為止。斷頭，取出全腦，4℃4%多聚甲醛浸泡固定48 h。固定后的腦組織于視交叉與四疊體間切取4 mm腦片，20%、30%梯度蔗糖溶液脫水至沉底。OCT膠包埋，液氮預冷的異戊烷速凍，置-80℃冰箱中保存。冰凍切片機切取視神經(jīng)交叉后約3 mm的海馬組織，厚10 μm，貼于黏附載玻片上，室溫風干，密閉置-80℃冰箱中保存以備染色。

1.4.2尼氏染色及計數(shù)

切片滴焦油紫液（試劑A）3～4滴，置濕盒中，56℃溫箱中染色1 h，蒸餾水洗凈染液；分化液（試劑B）中分化1～3 min，顯微鏡下觀察至背景接近無色或淺藍色為止；蒸餾水沖洗凈分化液，無水乙醇迅速脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片。10×40倍光鏡下分別對每側(cè)海馬CA1區(qū)錐體細胞層選取3個視野（圖1），每張切片獲取6個視野，每只大鼠取連續(xù)3張切片，共獲取18個視野。盲法用Image-Pro Plus 6.0測量每張圖片中錐體細胞條帶長度，人工計數(shù)細胞膜、核膜完整，核仁清楚的存活錐體細胞數(shù)，換算成錐體細胞數(shù)/mm，作為切片的計數(shù)結(jié)果。取3張切片的平均值作為每只標本的計數(shù)結(jié)果。

圖1　CA1區(qū)計數(shù)框的選取方法（尼氏染色，40×）

1.5統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

CA1區(qū)錐體細胞數(shù)各組間有非常顯著性差異（P＜0.01）。與Sham組比較，HS7組和HS21組存活錐體細胞數(shù)目減少（P＜0.05），HS21組低于HS7組（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1　　各組海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)（/mm）

圖2　各組海馬CA1區(qū)尼氏染色（400×）

3討論

中暑是指在高溫、高濕環(huán)境下，機體產(chǎn)熱、散熱失衡，體溫調(diào)節(jié)中樞功能障礙，汗腺功能衰竭和水、電解質(zhì)喪失過多而出現(xiàn)的相關臨床表現(xiàn)。依據(jù)發(fā)病時臨床表現(xiàn)的不同，可將中暑分為熱痙攣、熱衰竭和熱射病。

熱射病為中暑最嚴重的表現(xiàn)。依據(jù)發(fā)病時的狀態(tài)和發(fā)病機制，可將熱射病分為非勞力性熱射病（nonexertional heat stroke）和勞力性熱射?。╡xertional heat stroke）。前者又稱經(jīng)典型熱射病，是由于體溫調(diào)節(jié)功能障礙，散熱減少引起，常發(fā)生在炎熱天氣中久坐不動的人群，多數(shù)是老年人；后者是由于機體產(chǎn)熱過多引起，常見于參加運動的人群，因此可發(fā)生于非炎熱天氣時。兩者均具有致命性，病死率20%～70%，50歲以上人群更高達80%；勞力性熱射病也是運動員第3位引起死亡的原因［3］。

熱射病的定義是高熱（核心體溫＞40℃）伴神志障礙，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀尤為突出，可出現(xiàn)譫妄、驚厥、昏迷、共濟失調(diào)、記憶障礙等，即使經(jīng)及時降溫等治療而存活的個體，也有近30%遺留永久性神經(jīng)功能損害［4］；在永久性功能損害的患者中，神經(jīng)功能損害占76%～100%［5-7］。

腦是熱射病早期最易受損的器官。對熱射病患者死后的尸檢發(fā)現(xiàn)，腦部存在水腫、局灶性出血和點狀梗死［8］；隨著熱打擊程度加重，腦水腫加重，逐漸出現(xiàn)神經(jīng)元變性、壞死等［9-10］，尤以小腦Purkinje細胞病變較為突出，因此常發(fā)生構(gòu)音障礙、共濟失調(diào)和辨距不良等小腦癥狀，影像學檢查也可發(fā)現(xiàn)小腦進行性萎縮，灰白質(zhì)界限不清等。

既往的臨床和基礎研究主要聚焦于小腦損害，對海馬的損害關注較少。雖然海馬組織對熱打擊不如小腦敏感［11］，但也存在一定程度損害，臨床上可發(fā)現(xiàn)熱射病患者存在認知功能障礙、記憶力減退、注意力不集中等，影像學也可發(fā)現(xiàn)熱射病后海馬存在異常信號［12-14］。

海馬是腦參與學習、記憶功能最重要的區(qū)域，海馬損傷可引起學習、記憶功能受損［15］。在海馬結(jié)構(gòu)中，CA1區(qū)對缺血等損傷因素具有選擇易感性，而CA3區(qū)及齒狀回相對穩(wěn)定［16］，因此大部分對海馬損傷的研究都集中在CA1區(qū)。本課題組前期的實驗證明，熱射病7 d后，大鼠存在學習記憶功能障礙［2］。進一步研究顯示，熱射病后21 d，學習、記憶能力仍低于正常，遺留有遠期損害，但程度較7 d時有所好轉(zhuǎn)［17］。已有研究顯示，高溫可致海馬神經(jīng)細胞損傷，主要方式是細胞凋亡［18］。本研究顯示，熱射病后錐體細胞數(shù)有所減少，這可能是引起認知功能損害的原因之一。研究表明，成年大鼠海馬齒狀回顆粒細胞終生具有生成新神經(jīng)元的能力，顆粒細胞下層能產(chǎn)生新的顆粒細胞，形成新的突觸聯(lián)系，這對學習、記憶功能有至關重要的作用［19］，這也可解釋熱射病大鼠后期學習、記憶能力能夠部分恢復的現(xiàn)象。

熱射病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷的原因主要來源于兩個方面：一是高熱可直接造成細胞損傷，引起酶變性、線粒體功能障礙、細胞膜穩(wěn)定性喪失和有氧代謝途徑中斷；二是由內(nèi)毒素血癥、炎癥因子和其他免疫介質(zhì)誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征對組織造成的損傷。已有多項研究也證實，白細胞介素-1α、1β，腫瘤壞死因子-α等炎癥因子在熱打擊后顯著升高［20］，這也可以解釋為什么停止熱打擊后，組織損傷仍然繼續(xù)并遺留長期后遺癥。

腦缺血、缺氧是熱射病主要的病理生理基礎，既往對熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究多停留在形態(tài)學觀察，進行定量研究的較少，且缺乏敏感及可重復的對損傷嚴重程度進行評價的指標。由于健康Sprague-Dawley大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列相對均一；在遭受諸如缺血等損傷后，即使在同一CA1區(qū)，細胞密度也不均勻，計數(shù)位置的選取對結(jié)果影響較大，損傷急性期尤為明顯。因此計數(shù)時不能局限在單個區(qū)域，應分散至多個區(qū)域或?qū)φ麄€CA1區(qū)進行計數(shù)［21］。本研究對每只大鼠腦組織同一冠狀切面進行切片，減小了取材導致的個體間差異。選取7 d和21 d相當于熱射病急性后期和恢復期，并分別于左、右海馬CA1區(qū)隨機選取多個視野，計數(shù)錐體細胞及細胞條帶長度，減小了細胞密度不均一對結(jié)果的影響。這種計數(shù)辦法或許可以成為一種可行的評價熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴重程度的方法，同時對于干預措施效果評定的研究也有一定的意義。

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Variability of Pyramidal Neurons in Hippocampal CA1Area with Time after Heat Stroke in Rats

WAN Ming-sheng1，ZHANG Yun2，WU Shi-wen1，2
1.The Clinical College of the General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Anhui Medical University，Beijing 100039，China；2.the General Hospital of Chinese People'sArmed Police Forces，Beijing 100039，China
Correspondence to WU Shi-wen.E-mail:neurowu@gmail.com

Objective To observe the pyramidal neurons in the hippocampal CA1 area varying with time after heat stroke in rats.Methods Sprague-Dawley rats were divided into sham group（n=5）and heat stroke group（n=14），and the heat stroke group was divided into 7-day subgroup and 21-day subgroup（n=7 at each group）after heat stroke.Heat stroke group was established model of heat stroke.The brain tissues of rats were observed with Nissl staining to count the living pyramidal neurons in hippocampal CA1 area.Results The number of living pyramidal neurons in hippocampal CA1 area decreased in the heat stroke group（F=11.80，P＜0.01），and decreased more in the 21-day subgroup than in the 7-day subgroup（P＜0.05）.Conclusion Pyramidal neurons in hippocampal CA1 area decrease with time after heat stroke，which may be associated with the learning and memory impairment.

heat stroke；hippocampus；pyramidal neuron；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.011

R594.1

A

1006-9771（2016）07-0793-04

國家發(fā)改委衛(wèi)星專項基金項目（No.發(fā)改辦高技［2013］2140）。

1.安徽醫(yī)科大學武警總醫(yī)院臨床學院，北京市100039；2.武警總醫(yī)院，北京市100039。作者簡介：萬明勝（1988-），男，漢族，湖南岳陽市人，碩士研究生，主要研究方向：熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。通訊作者：吳士文，男，博士，副教授、碩士研究生導師。E-mail: neurowu@gmail.com。

2016-02-03

2016-03-04）