小麥單片葉片DNA 提取及SSR-PCR

丁 晨

(大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院，黑龍江大慶 163712)

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小麥單片葉片DNA 提取及SSR-PCR

丁 晨

(大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院，黑龍江大慶 163712)

[目的]使用PCR擴增鑒定哪些微衛(wèi)星引物可用于鑒定小麥遺傳背景下的黑麥遺傳成分。[方法]以小麥單片葉片為材料，采用CTAB法提取DNA，以獲得的DNA為模板進行SSR-PCR擴增，再進行普通小麥與黑麥之間多態(tài)性引物篩選，篩選出可用于鑒定小麥遺傳背景下的黑麥遺傳成分的引物。[結(jié)果]在所研究的20對SSR引物中，有 18 對在普通小麥與黑麥之間擴增出的產(chǎn)物有差異，引物發(fā)生變化的比例為90%。這些產(chǎn)生差異帶的多態(tài)性引物大體可劃分為兩大類：一類是在黑麥與普通小麥之間均出現(xiàn)一種或者多種具有差異的產(chǎn)物帶，如SCM2、SCM109、SCM180、SCM304，另一類是在黑麥上能擴增但在普通小麥上卻未能擴增或者擴增的條帶不清晰，如SCM101、SCM120、SCM138、SCM268。[結(jié)論]以上這2種情況下的引物均可用于鑒定小麥遺傳條件下的黑麥遺傳成分。

小麥；單葉片；CTAB 法；SSR-PCR

黑麥在抗病性、抗逆性和產(chǎn)量方面均優(yōu)于小麥，將控制黑麥優(yōu)異性狀的基因探索出來并導(dǎo)入小麥基因中對小麥育種具有重要意義。張曉祥等[1]采用改良CTAB法、改良SSD法以及沸水浴法進行對比，結(jié)果表明，改良的CTAB法提取的DNA純度和濃度最好，且該方法提取的DNA在凝膠電泳時產(chǎn)生的條帶清晰度和亮度較高且一致，DNA完整性較好。李莉等[2]以山東省小麥作為研究材料，采用SSR法對其DNA指紋數(shù)據(jù)庫進行構(gòu)建，且驗證了SSR法比RFLP法和RAPD法產(chǎn)生的基因多樣性更多。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于小麥品種指紋圖譜繪制、種質(zhì)資源遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選及品種純度檢測等領(lǐng)域。迄今為止尚未見利用小麥單片葉片提取DNA并用以檢測小麥遺傳背景下黑麥遺傳成分的相關(guān)報道。筆者采用CTAB法提取小麥單片葉片中的DNA，再使用PCR擴增來鑒定哪些微衛(wèi)星引物可用于鑒定小麥遺傳條件下的黑麥遺傳成分，旨在利用所篩選的引物鑒定小麥-黑麥代換系5R/5A/與6R/6A雜交的高代材料。

1　材料與方法

1.1材料供試材料為小麥-黑麥代換系5R/5A/與6R/6A雜交的高代材料，品系為14-1，14-2，14-3，14-4，14-5，14-6。

1.2方法

1.2.2SSR-PCR擴增[3]。擴增反應(yīng)使用的儀器為Thermal Cycler 9600 PCR。PCR程序:95 ℃,6 min，55～60 ℃，30 s，溫度以引物而定，72 ℃,1 min, 循環(huán)40次，然后在72 ℃下繼續(xù)擴增 10 min。擴增結(jié)束后，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

對供試材料進行SSR分析的微衛(wèi)星引物共20對，由大連寶生物公司合成，這些引物分布在黑麥5R和6R染色體上。引物的退火溫度等詳細信息見表1[4-5]。

1.2.3擴增產(chǎn)物檢測。擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺非變性凝膠上穩(wěn)壓120 V電泳，銀染顯色，最后照相觀察。

1.2.4硝酸銀染色步驟[6]。①電泳完成后，將膠塊放于搖床上固定液中固定 30 min；②迅速用去離子水沖洗 2～3 次，每次30～40 s；③在搖床上用銀染液染色30 min；④重復(fù)步驟②，在搖床上放入顯影液中顯影至第一條清晰可見的泳帶出現(xiàn)；⑤最后放入停影液中停影。

2　結(jié)果與分析

2.1SSR反應(yīng)體系探索了DNA質(zhì)量(RNA含量、DNA長度、DNA濃度)對SSR-PCR擴增的影響，SSR-PCR反應(yīng)體系對DNA質(zhì)量影響最小且可使DNA性質(zhì)保持最為穩(wěn)定的反應(yīng)體系(25 μL)：TaqE(5 U/μL)0.2 μL，引物1和引物2(2.5 μmol/L)均為0.7 μL ，DNA (40n g/μL)2.0μl，10×Buffer 2.5 μL，無菌水 16.9 μL。

2.2普通小麥與黑麥之間多態(tài)性SSR引物的篩選結(jié)果由于篩選的引物主要鑒定小麥-黑麥代換系5R/5A與6R/6A雜交的高代材料，因此，選取20對存在于黑麥R基因組5R、6R染色體上可能提供非同源小片段的SSR引物，所供試的 20對SSR 引物見表1，利用SCM編號的引物和Xgwm編號的引物鑒定小麥遺傳背景中的黑麥遺傳成分，普通小麥與黑麥的多態(tài)性篩選結(jié)果見表2。用引物Xgwm 335進行了擴增，結(jié)果條帶豐富，清晰可辨，效果較好(圖1)。

表1　SSR引物詳細信息

表2　普通小麥與黑麥多態(tài)性 SSR 引物的篩選結(jié)果

20對SSR引物中除SCM 28、SCM 306這2種引物未能在普通小麥與黑麥中出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，大多數(shù)引物均能在黑麥與普通小麥間或者其中一種上出現(xiàn)一條以上的擴增產(chǎn)物。在20對SSR引物中，有 18對在普通小麥與黑麥之間擴增出的產(chǎn)物有差異，引物發(fā)生變化的比例為90%。這些產(chǎn)生差異帶的多態(tài)性引物大體可以歸類劃分為兩大類：一類是在黑麥與普通小麥中均出現(xiàn)一種或多種產(chǎn)物帶，此產(chǎn)物帶差異的原因是擴增產(chǎn)物的長度不同，如SCM 2、SCM 109、SCM 180 、SCM 304均在普通小麥上產(chǎn)生長度明顯差異但表觀清晰的條帶，此類引物可以利用；還有一種是在黑麥上能擴增但在普通小麥上卻未能擴增或擴增的條帶不清晰，此類引物也可以利用，如SCM 101、SCM 120、SCM138、SCM 268可以在黑麥上擴增出條帶，但在普通小麥ABD染色體組上卻未見清晰的條帶。這2種情況下的引物均可用于鑒定小麥遺傳條件下的黑麥遺傳成分。

注：M.Marker；1.普通小麥；2.黑麥。Note: M. Marker 1. Common wheat；2. Rye.圖1　引物Xgwm 335 SSR擴增結(jié)果Fig. 1 SSR amplification results of primer Xgwm 335

3　結(jié)論

位于黑麥基因組的SCM 2、SCM 109、SCM 180、SCM 304、SCM 101、SCM 120、SCM138、SCM 268引物，可用于鑒定小麥遺傳條件下的黑麥遺傳成分。目前所開發(fā)出來的黑麥特異引物還很少，對于鑒定小麥遺傳條件下的黑麥遺傳成分有一定限制。小麥ABD組染色體上也含有該試驗所使用的Xgwm編號引物，且該引物最初是開發(fā)定位在小麥微衛(wèi)星圖譜上的，普通小麥和黑麥之間使用Xgwm引物擴增出的產(chǎn)物有差異，這表明理論上也可用于鑒定小麥遺傳條件下的黑麥遺傳成分。

[1] 張曉祥，王玲,壽路路，等.一種快速提取小麥基因組DNA的改良CTAB方法[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28(36)：46-49.

[2] 李莉，王俊峰，顏廷進.基于SSR標(biāo)記的山東省小麥DNA指紋圖譜的構(gòu)建[J].植物遺傳資源學(xué)報，2013，14(3)：537-541.

[3] 丁海燕，邢璐璐，張海濤，等. 小麥-黑麥易位系的研究[J].植物研究，2009(1):22-24.

[4] SAAL B，WRICKE G. Development of simple sequence repeat markers in rye (SecalecerealeL.)[J].Genome,1999，42: 964-972.

[5] KHLESTKINA E K,MA HLA MYINT THAN,PESTSOVA E G，et al.Mapping of 99 new microsatellite-derived loci in rye (SecalecerealeL.) including 39 expressed sequence tags[J].Theor Appl Genet, 2004,109:725-732.

[6] 丁海燕，鄭茂波，徐英博，等. 一個大穗型小麥-黑麥異代換系的細胞學(xué)和SSR鑒定[J].麥類作物學(xué)報，2008(2):51-54.

DNA Extraction and SSR-PCR of Single Leaves of Wheat

DING Chen

(College of Biological Engineering, Daqing Normal University, Daqing, Heilongjiang 163712)

[Objective] To find the micro-satellite primers obtained by PCR amplification, which was suitable for the identification of rye genetic component under wheat genetic background. [Method] With wheat single leaf as the test material, DNA was extracted by CTAB method. SSR-PCR amplification was carried out with the obtained DNA as the template. Screening of pleomorphic primer was carried out between common wheat and rye, so as to find the primer of rye genetic component suitable for the identification of wheat genetic background. [Result] From 20 pairs SSR primers, 18 pairs of SSR primers could amplify the different sites between common wheat and rye. The percentage of primer change was 90%. These polymorphic primers could be divided into two types. There were one or more product bands with differences between common wheat and rye, such as SCM2, SCM109, SCM180 and SCM304. The other type could amplify in rye but could not amplify in common wheat or the band was unclear, including SCM 101, SCM120, SCM138 and SCM268. [Conclusion] Under the above two cases, primers can be used to authenticate genetic constitution of rye under common wheat.

Wheat; Single leaf; CTAB; SSR-PCR

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510235036)。

丁晨(1994- ),男,安徽亳州人,本科生,專業(yè):生物技術(shù)。

2016-03-30

S 512.1

A

0517-6611(2016)17-175-02