雙歧桿菌BB12對便秘大鼠的通便作用及對胃腸激素的調(diào)節(jié)

田 穎，戴倩倩，時明慧，孟嬋芳，黃玉軍，顧瑞霞（1.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 517；.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 517）

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雙歧桿菌BB12對便秘大鼠的通便作用及對胃腸激素的調(diào)節(jié)

田 穎1，2，戴倩倩2，時明慧2，孟嬋芳2，黃玉軍1，2，顧瑞霞1，2
（1.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225127；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

摘 要：目的：研究雙歧桿菌BB12對便秘大鼠的通便作用及對相關(guān)胃腸激素的調(diào)節(jié)。方法：將48 只Wistar大鼠按性別分開，雌雄各半。按體質(zhì)量隨機分為正常對照組、陽性對照組、模型對照組、雙歧桿菌BB12低、中、高劑量組，每組4 只。造模后灌胃相應(yīng)受試樣品，記錄各組大鼠每日進食量、飲水量、體質(zhì)量、排便粒數(shù)，測定糞便含水量、小腸炭末推進率、血清胃泌素、胃動素、P物質(zhì)、生長抑素含量。結(jié)果：雙歧桿菌BB12能顯著減少便秘大鼠的飲水量，增加便秘大鼠的排便粒數(shù)、小腸炭末推進率、血清胃動素和P物質(zhì)含量，降低生長抑素含量，且作用具有一定的性別差異和劑量相關(guān)性。對便秘大鼠的進食量、體質(zhì)量、糞便含水量、血清胃泌素含量無明顯作用。結(jié)論：雙歧桿菌BB12對便秘大鼠具有通便作用，其作用機制與其調(diào)節(jié)胃腸激素的分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞：雙歧桿菌；便秘；胃腸激素

引文格式：

田穎， 戴倩倩， 時明慧， 等.雙歧桿菌BB12對便秘大鼠的通便作用及對胃腸激素的調(diào)節(jié)［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 204-208.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613037. http://www.spkx.net.cn

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便秘是常見的胃腸道功能失調(diào)問題，長期便秘還與結(jié)直腸癌、急性心腦血管等疾病有密切關(guān)系［1］。流行病學資料顯示，女性便秘患病率高于男性（男女患病率之比為1∶2.1），各年齡人群均可患?。?］。我國便秘發(fā)生率為3%～17%，并且隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變、精神心理和社會因素的影響，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，嚴重影響到人們的健康及生活質(zhì)量［3-4］。對于便秘的治療，目前普遍采用潤腸性或刺激性的藥物促進排便，但長期使用會造成依賴，副作用較大［5］，并增加了患者的經(jīng)濟負擔［6］。

研究發(fā)現(xiàn)，便秘與腸道微生物有關(guān)［7］，便秘人群易出現(xiàn)腸道菌群紊亂，有害菌數(shù)量增加，使腸道生態(tài)平衡失調(diào)，從而加重有害菌產(chǎn)生毒素的吸收［8］。Meta分析研究結(jié)果顯示，與其他乳酸菌相比，雙歧桿菌能更加顯著增加便秘患者的排便次數(shù)、降低糞便在腸道的存留時間、改善糞便的性狀［9-10］，且副作用低。雙歧桿菌BB12是目前文獻記錄最多的雙歧桿菌，已在臨床實驗中進行了25 a以上的檢測，具有改善腸道運動的功能［11-12］，并于2011年被國家衛(wèi)生和計劃生育委員會列入《可用于嬰幼兒配方食品的菌種名單》中［13］。雖然國內(nèi)外對雙歧桿菌BB12的研究報道很多，但僅限于對其功能和效果的觀察，而對其作用機制鮮有深入探討［14］。雙歧桿菌BB12通過改善腸道運動功能來改善便秘情況，與增加機體的胃腸動力有直接關(guān)系。但具體是通過何種途徑來增加胃腸動力，作用效果是否具有性別差異、是否與攝入量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，目前尚未見報道。本實驗通過建立便秘大鼠模型，研究雙歧桿菌BB12對便秘大鼠的通便作用，并進一步探討該菌對大鼠血液胃腸激素水平的作用，分析該作用是否具有劑量相關(guān)性及性別差異，為雙歧桿菌BB12在治療便秘方面的作用機制研究和開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

番瀉葉、鹽酸洛哌丁胺 市售；雙歧桿菌BB12江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室；胃泌素（gastrin，Gas）、胃動素（motilin，MTL）、P物質(zhì)（substance P，SP）、生長抑素（somatostatin，SS）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國RB公司。

SW-CJ-IF型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；智能恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；全自動高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；臺式冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；電熱鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；ELX800全自動酶標儀 美國BioTek公司。

健康成年Wistar大鼠48 只，雌雄各半，體質(zhì)量178～210 g，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供。標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.3 受試樣品的配制

雙歧桿菌BB12菌懸液制備：將濃度達到1.0×109CFU/mL的雙歧桿菌BB12培養(yǎng)液于4 ℃、2 500 r/min離心5 min，去除上清液，加入適量生理鹽水后混勻，重復3 次。最后一次離心后用生理鹽水將雙歧桿菌BB12分別稀釋為1.0×1010CFU/mL（高）、1.0×109CFU/mL（中）、1.0×108CFU/mL（低）3 個劑量菌懸液。

番瀉葉浸劑制備：稱取番瀉葉5.0 g，加入100 mL沸水中浸泡25 min，冷卻后以紗布過濾藥液，棄藥渣不用，將濾液定量至1 000 mL，得到含生藥5 mg/mL的番瀉葉浸液，115 ℃、15 min滅菌后放置4 ℃冰箱備用［15］。

1.4 動物實驗

據(jù)反腐期刊《廉政 瞭 望》介紹，在民政系統(tǒng)，鮑學全擁有不一般的能量。據(jù)介紹，鮑學全早年從軍，后來當過醫(yī)生。進入官場后，在國家中醫(yī)藥管理局工作10年，官至正處。1996年之后，鮑學全進入國務(wù)院辦公廳，8年內(nèi)成為正廳級官員。2004年，鮑學全出任福彩中心副主任。

1.4.1 大鼠便秘模型的制作

將24 只雄性Wistar大鼠稱體質(zhì)量，隨機將其中4 只作為正常對照組給予生理鹽水，其余20 只每天灌胃1 mL鹽酸洛哌丁胺生理鹽水溶液（按3.0 mg/kg體質(zhì)量將鹽酸洛哌丁胺溶于1 mL 0.9%生理鹽水）5 d制造便秘大鼠模型［16-17］。雌性大鼠的造模方法同雄性。

1.4.2 實驗大鼠的分組及處理

將造模成功的20 只雄性大鼠隨機平均分為5 組：模型對照組、陽性對照組（番瀉葉組）、雙歧桿菌BB12低劑量組、中劑量組、高劑量組，正常對照組大鼠不變，總共6 組。其中正常對照組和模型對照組按2.0 mL/（kg·d）的劑量持續(xù)灌胃0.9%生理鹽水9 d，其余4 組以相同劑量和途徑給予相應(yīng)的實驗樣品。雌性大鼠的分組及處理方法同雄性。

1.4.3 糞便含水量的計算

記錄大鼠各實驗階段的每日進食量、飲水量、體質(zhì)量增加量、糞便粒數(shù)、糞便鮮質(zhì)量與干質(zhì)量，來計算糞便含水量，按式（1）計算。

式中：mf為糞便鮮質(zhì)量/g；md為糞便干質(zhì)量/g。

1.4.4 小腸推進實驗

第9次給予受試樣品后，所有大鼠禁食不禁水24 h后，每只大鼠灌胃1.0 mL炭末液（3.0 g炭末溶于50.0 mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液），10 min后心臟取血處死，剖腹，將消化道幽門至回盲瓣部分完全取出，測量小腸全長及從幽門到炭末前沿的“炭末推進長度”，按式（2）計算小腸炭末推進率。

1.4.5 血液胃腸激素含量檢測

第9次給予受試樣品后，所有大鼠禁食不禁水24 h，心臟取血，2 500 r/min離心5 min取血清，按ELISA試劑盒說明書操作測定胃泌素、胃動素、P物質(zhì)、生長抑素。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌BB12對大鼠進食量、飲水量、體質(zhì)量增加量的影響

注：a.與正常對照組比較，差異顯著（P＜0.05）；b.與模型對照組比較，差異顯著（P＜0.05）；c.與陽性對照組比較，差異顯著（P＜0.05）；d.雌性與雄性比較，差異顯著（P＜0.05）。下同。

由表1可知，與模型對照組、陽性對照組相比，低、中、高劑量組雄性大鼠的進食量均無顯著性差異（P＞0.05）。3 個劑量組雌性大鼠的進食量與模型對照組、正常對照組相比，均無顯著性差異（P＞0.05）。說明雙歧桿菌BB12不能增加便秘大鼠的進食量。從飲水量的結(jié)果可知，隨著菌懸液劑量的增高，雌、雄大鼠的飲水量均有下降趨勢，中、高劑量組大鼠的飲水量均比模型對照組顯著減少（P＜0.05），與正常對照組相比無顯著差異，說明中、高劑量雙歧桿菌BB12能減少便秘大鼠的飲水量，該作用無性別差異。由體質(zhì)量增加量結(jié)果可見，3 個劑量組雌、雄大鼠與模型對照組、陽性對照組均無顯著性差異，說明雙歧桿菌BB12對便秘大鼠的體質(zhì)量無明顯作用。

2.2 雙歧桿菌BB12對大鼠排便的影響

表 2 雙歧桿菌BB12對大鼠排便粒數(shù)和糞便含水量的影響（x±s，n=4）Table 2 Effect ofBifidobacteriumBB12 on fecal number and watercontent of rats （x±s，n=4）組別 糞便粒數(shù) 糞便含水量/%雄性 雌性 雄性 雌性正常對照組 98.22±6.70 76.78±6.53d56.87±3.78 56.42±1.54陽性對照組 110.67±23.12b63.78±11.97ad62.24±3.01a58.20±4.52b模型對照組 79.44±13.96ac63.56±6.15ad61.51±3.99a62.58±5.49a低劑量組 73.44±21.10ac65.22±11.41 60.94±3.72 63.53±8.33ac中劑量組 70.11±7.20ac93.56±7.73abcd63.42±4.25a66.30±4.58ac高劑量組 123.89±25.32ab94.44±12.27abcd62.65±2.58a62.93±3.27ac

由表2可知，模型對照組雌、雄大鼠的每日排便粒數(shù)均顯著低于正常對照組（P＜0.05），說明造模成功。雙歧桿菌BB12高劑量組雄性大鼠的每日排便粒數(shù)比模型對照組、正常對照組顯著增高（P＜0.05），并與陽性對照組相當；雌性大鼠中劑量組的排便粒數(shù)與高劑量組一致，均顯著高于模型對照組、正常對照組和陽性對照組（P＜0.05）。說明中、高劑量雙歧桿菌BB12能顯著增加便秘大鼠的每日排便量，且作用具有一定的性別差異：高劑量對雄性大鼠有效，中、高劑量對雌性大鼠均有效，且作用效果無差別，并優(yōu)于陽性對照藥番瀉葉。糞便含水量的結(jié)果顯示，3 個劑量組的雌、雄大鼠與模型對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），說明雙歧桿菌BB12對便秘大鼠的糞便含水量無影響。

2.3 雙歧桿菌BB12對大鼠小腸炭末推進率的影響

表 3 雙歧桿菌BB12對大鼠小腸炭末推進率的影響（x±s，n=4）Table 3 Effect ofBifidobacteriumBB12 on gastrointestinal transit of rats （x± s， n= 4）組別 炭末推進率/%雄性 雌性正常對照組 28.16±7.92 23.77±7.00陽性對照組 19.77±5.01b14.45±3.13a模型對照組 11.13±2.94a14.42±0.69a低劑量組 9.75±0.37a18.71±2.83bcd中劑量組 12.28±0.65a17.66±5.42bc高劑量組 19.07±8.39b18.31±1.47bc

由表3可知，高劑量組雄性大鼠的小腸炭末推進率顯著高于模型對照組（P＜0.05），與陽性對照組無差異；3 個劑量組雌性大鼠的炭末推進率均顯著高于模型對照組和陽性對照組（P＜0.05），且劑量組間作用效果無差異（P＞0.05）。說明雙歧桿菌BB12能增加便秘大鼠的小腸運動能力，但作用具有性別差異：對雄性大鼠僅高劑量作用顯著；對雌性大鼠低、中、高劑量作用效果均同樣顯著，并優(yōu)于陽性對照藥番瀉葉。

2.4 雙歧桿菌BB12對大鼠血液胃腸激素水平的影響

表 4 雙歧桿菌BB12對大鼠血液胃腸激素水平的影響（x±s，n=4）Table4 Effect ofBifidobacteriumBB12 on gastrointestinal hormonesin blood of rats （x± s， n= 4）ng/L組別胃泌素 胃動素 P物質(zhì) 生長抑素雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性正常對照組 96.16±7.67105.34±17.97 262.00±11.49 324.76±14.45d134.47±15.88 139.25±16.32 357.69±13.60 418.46±23.54d陽性對照組 97.82±11.50 106.06±9.65 302.63±23.00a339.13±21.51bd169.36±16.19a174.24±11.83a447.31±18.80a437.21±27.53模型對照組 94.20±6.13107.95±10.38 267.63±31.57 293.56±22.18ac169.70±11.41a150.17±10.67d464.13±50.06a440.10±22.50低劑量組 99.38±15.07 102.86±13.21 312.00±2.65ab329.38±10.25b221.72±13.61abc187.27±30.71abd391.54±10.27abc385.29±13.72bc中劑量組 98.93±15.79 114.02±13.85d342.63±15.24abc369.41±31.79abc204.55±30.03abc222.03±24.98abc373.75±28.80bc380.00±13.60bc高劑量組 109.70±19.57 101.29±12.42 361.69±25.50abc388.56±43.46abc166.74±16.54a172.02±20.65ab301.15±9.68abc389.23±29.74bcd

由表4血清胃泌素結(jié)果可知，除中劑量組雌性大鼠顯著高于雄性大鼠（P＜0.05）外，其余各組血清胃泌素水平均無顯著性差異（P＞0.05）。由血清胃動素結(jié)果可知，3 個劑量組的雌、雄大鼠均顯著高于模型對照組（P＜0.05），作用隨劑量增高有增加趨勢，且中、高劑量組顯著高于陽性對照組（P＜0.05），說明雙歧桿菌BB12能顯著提高便秘大鼠血清胃動素水平，且作用具有劑量相關(guān)性，無性別差異。由血清P物質(zhì)結(jié)果可知，雄性大鼠3 個劑量組均顯著高于正常對照組，低、中劑量組顯著高于模型對照組、陽性對照組（P＜0.05），且隨作用劑量增加血清P物質(zhì)水平有下降趨勢。雌性大鼠3 個劑量組均顯著高于模型對照組、正常對照組，且中劑量組顯著高于陽性對照組（P＜0.05）。說明雙歧桿菌BB12能顯著提高便秘大鼠血清P物質(zhì)水平，且對不同性別大鼠作用有差異：對雄性大鼠低劑量菌懸液作用最顯著，而對雌性大鼠中劑量作用最顯著。由血清生長抑素結(jié)果可知，雌、雄大鼠的3 個劑量組均顯著低于模型對照組、陽性對照組（P＜0.05），雄性大鼠隨菌懸液劑量增高呈下降趨勢，雄性高劑量組顯著低于正常對照組，雌性3 個劑量組與正常對照組之間無顯著性差異（P＞0.05）。說明雙歧桿菌BB12能顯著降低便秘大鼠血清生長抑素水平，該作用對雄性大鼠具有劑量相關(guān)性，對雌性大鼠則相關(guān)性不明顯。

3 討 論

造成便秘的原因有多種，其中由于結(jié)腸動力障礙，導致腸道內(nèi)容物排出緩慢或滯留于結(jié)腸而引起的傳輸型便秘的發(fā)病率最高［3］。本實驗造模所用的鹽酸洛哌丁胺是通過抑制腸道平滑肌收縮，減少腸蠕動，延長腸道內(nèi)容物的滯留時間，并減少消化液分泌來引起大鼠排便困難［18-19］，與傳輸型便秘的臨床癥狀接近。實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠的排便粒數(shù)和小腸炭末推進率均顯著低于正常對照組，說明鹽酸洛哌丁胺明顯抑制了大鼠的腸道運動，造模成功。由于造模后停止給予洛哌丁胺，而給予便秘大鼠灌胃生理鹽水、番瀉葉或菌懸液，在一定程度上緩解了洛哌丁胺的抑制腸蠕動作用，使消化液分泌增加，大鼠消化能力增強，進食代償性增加，以彌補造模期進食不足，因此各組雄性大鼠進食量均顯著高于正常對照組。但雌性大鼠進食量無顯著性變化，具體原因尚不清楚，或與洛哌丁胺抑制雌性大鼠消化液分泌作用更持久有關(guān)，還需進一步進行研究。另外，由于洛哌丁胺能促進水和電解質(zhì)的吸收，會產(chǎn)生口干等不良反應(yīng)［16］，導致飲水量增加，因此模型組的飲水量顯著高于正常對照組，用雙歧桿菌BB12干預(yù)后，中、高劑量組大鼠的飲水量明顯減少，說明雙歧桿菌BB12能緩解洛哌丁胺的口干副作用。由于鹽酸洛哌丁胺造模后，大鼠飲水量增加，使各造模組的糞便含水量反而升高，均高于正常對照組。雙歧桿菌BB12干預(yù)后，雖然飲水量減少，但由于緩解了洛哌丁胺抑制腸液分泌的作用［15］，使腸液分泌增加，因此糞便含水量與模型對照組相比沒有顯著變化。

便秘的發(fā)病率具有性別差異，女性明顯高于男性［20］，這與女性體內(nèi)的孕激素水平高、腸神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)差異等原因有關(guān)［21］。為比較雙歧桿菌BB12對不同性別便秘大鼠的作用差異，本研究同時設(shè)置了雌、雄兩個性別組。結(jié)果中糞便粒數(shù)、小腸炭末推進率等指標均顯示出性別差異，即雙歧桿菌BB12對雌性大鼠的通便、促進腸動力作用敏感度更高。為進一步探究造成該結(jié)果的原因，本課題進一步對大鼠血液中的胃腸激素水平進行了檢測分析。

胃腸激素是由胃腸道黏膜層和胰腺的內(nèi)分泌細胞分泌的高效能生物活性物質(zhì)，對胃腸道運動功能的調(diào)控具有興奮和抑制兩種作用［22-23］，起主要作用的有胃泌素、胃動素、P物質(zhì)、生長抑素4 種激素。其中，前3 種激素能刺激消化液分泌、收縮胃腸道平滑肌、促進胃腸內(nèi)容物運行，對胃腸道運動起興奮作用；而生長抑素則抑制消化液分泌、抑制消化道平滑肌收縮、抑制胃腸排空［24-25］。本實驗結(jié)果顯示，雙歧桿菌BB12主要通過增加大鼠體內(nèi)胃動素、P物質(zhì)，降低生長抑素水平來促進通便，且作用具有一定的性別差異：雌、雄大鼠血液P物質(zhì)、生長抑素含量對菌懸液的劑量敏感性不同。雄性大鼠血液P物質(zhì)水平對低劑量菌懸液敏感，而雌性大鼠對中劑量敏感。雄性大鼠血液生長抑素水平對高劑量最敏感，而雌性大鼠對3 個劑量的敏感度相同。雌、雄大鼠血液胃動素水平對菌懸液的劑量敏感度無性別差異，均對高劑量最敏感。將以上結(jié)果綜合分析可見，雄性大鼠血液胃腸激素僅對高劑量菌懸液的敏感度最高，而雌性大鼠則對中、高劑量均敏感，這是造成大鼠糞便粒數(shù)、小腸炭末推進率具有性別差異的原因。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613037

中圖分類號：R33；TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0204-05

收稿日期：2015-09-10

基金項目：江蘇省重點實驗室開放課題（K13055）

作者簡介：田穎（1978—），女，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)學。E-mail：tianyingjob@126.com

Bifidobacterium BB12 Promotes Defecation and Regulates Gastrointestinal Hormones in Constipated Rats

TIAN Ying1，2， DAI Qianqian2， SHI Minghui2， MENG Chanfang2， HUANG Yujun1，2， GU Ruixia1，2
（1.Jiangsu Province Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control， Yangzhou 225127， China；2.School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou 225127， China）

Abstract:Objective: To investigate the effects of Bifidobacterium BB12 on promoting defecation and regulating gastrointestinal hormones in constipated rats.Methods: Totally 48 Wistar rats， half male and half female， were divided randomly into control group， positive control group， model group， Bifidobacterium BB12 low-， middle-， and high-dose groups.Rat models of loperamide hydrochloride-induced constipation were established and the rats from each group were treated with corresponding drugs.During the experiment， daily food intake， water intake， body weight， fecal number， fecal water content， gastrointestinal transit， and the contents of gastrin， motilin， substance P and somatostatin in serum were measured.Results: Fecal number， gastrointestinal transit， and the serum contents of motilin and substance P increased significantly， while water intake and somatostatin content decreased significantly in response to the administration of Bifidobacterium BB12.These effects were dependent on gender and dose.There was no signifcant difference in food intake，body weight， fecal water content and serum gastrin.Conclusion: The laxative effect of Bifidobacterium BB12 is confrmed and the underlying mechanism is related to regulating some gastrointestinal hormones.

Key words:Bifidobacterium； constipation； gastrointestinal hormone