假腸膜明串珠菌甘露醇脫氫酶基因的克隆及表達

程雅韻，王 新，鄭 琳，李官浩，崔虎山，金 清，*（.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 3300；.延邊大學附屬醫(yī)院西區(qū)，吉林 延吉 33000）

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假腸膜明串珠菌甘露醇脫氫酶基因的克隆及表達

程雅韻1，王 新1，鄭 琳1，李官浩1，崔虎山2，金 清1，*
（1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學附屬醫(yī)院西區(qū)，吉林 延吉 133000）

摘 要：利用聚合酶鏈式反應從假腸膜明串珠菌中擴增出甘露醇脫氫酶（mannitol dehydrogenase，MDA）基因的結構基因，克隆入表達載體pETDuet-1，構建了甘露醇脫氫酶表達質粒pETDuet-1-mdh，將其轉化進入大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達。假腸膜明串珠菌甘露醇脫氫酶結構基因長度為1 017 bp，重組甘露醇脫氫酶基因在大腸桿菌內成功表達，其蛋白質分子質量為36.0 kD；重組甘露醇脫氫酶活力為0.15 U/mg pro，高于假腸膜明串珠菌中甘露醇脫氫酶活力0.03 U/mg pro。

關鍵詞：甘露醇；甘露醇脫氫酶；假腸膜明串珠菌；基因克??；表達

引文格式：

程雅韻， 王新， 鄭琳， 等.假腸膜明串珠菌甘露醇脫氫酶基因的克隆及表達［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 153-156.

CHENG Yayun， WANG Xin， ZHENG Lin， et al.Cloning and expression of mannitol dehydrogenase gene from Leuconostoc pseudomesenteroides［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 153-156.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613027. http://www.spkx.net.cn

甘露醇（mannitol），學名己六醇，是六元糖醇的一種，別名D-甘露糖醇、木蜜醇，為山梨醇的同分異構體［1］。甘露醇具有清涼的甜味，甜度為蔗糖的60%，不易吸潮，還具有熱量低、無毒、無副作用等特點。甘露醇被人體吸收后的代謝不依靠胰島素，故不提高血糖值。甘露醇不會作為口腔微生物的營養(yǎng)源，可抑制突變鏈球菌的生長繁殖。甘露醇沒有還原基，不參與美拉德反應，不容易焦化。由于甘露醇具有特殊的物理和化學性質，甘露醇可作麥芽糖、口香糖、糕點等食品的防黏劑，也可作糖尿病、肥胖病人的低熱值食品和低糖食品的甜味劑和功能性食品添加劑等，廣泛應用于食品工業(yè)［2］。

生產(chǎn)甘露醇的方法主要有提取法、化學合成法、酶轉化法、微生物發(fā)酵法等［3-6］。其中微生物發(fā)酵法可以提高甘露醇的產(chǎn)率并且能避免山梨醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，成為甘露醇生產(chǎn)的主要發(fā)展趨勢［7］。目前已經(jīng)報道了多種微生物具有生產(chǎn)甘露醇的能力，包括霉菌、酵母菌和細菌，其中乳酸菌代謝途徑中的甘露醇脫氫酶（mannitol dehydrogenase，MDH）可有效轉化果糖生成甘露醇［8-12］。目前，已經(jīng)對短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）等乳酸菌所產(chǎn)的甘露醇脫氫酶進行了純化和特性分析，并探討了這些乳酸菌作為甘露醇生產(chǎn)菌株的可行性［11-13］，結果表明這些菌株因甘露醇轉化率低或生長速率緩慢而不適于作生產(chǎn)用菌株。

假腸膜明串珠菌作為異型發(fā)酵乳酸菌的一種，其所產(chǎn)的甘露醇脫氫酶是甘露醇生成過程中的關鍵酶，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）或煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（dihydronicotinamide adenine dinuclectide phosphate，NADPH）為輔酶催化果糖生成甘露醇［14］。近年來，假腸膜明串珠菌作為甘露醇生產(chǎn)優(yōu)良菌株受到廣泛關注［15］。為將假腸膜明串珠菌及其所產(chǎn)MDH有效應用于甘露醇生產(chǎn)，必須對其酶學特性進行分析，并提高酶的表達量。

因此，本課題組以遺傳及生理機能都被熟知的大腸桿菌作為宿主細胞，利用基因工程技術，將假腸膜明串珠菌的甘露醇脫氫酶結構基因轉入其中，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導使其異源表達，提高MDH的表達量和酶活性，為進一步研究MDH酶學特性并將假腸膜明串珠菌MDH應用于甘露醇的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

假腸膜明串珠菌KCTC3652（Leuconostoc pseudomesenteroides KCTC3652） 韓國生物資源中心（Korean Collection for Type Cultures，KCTC）；表達質粒pETDuet-1 質粒、大腸桿菌（Escherichia coli）Top10菌株和表達菌株E.coli BL21（DE3）為延邊大學食品科學系食品科學實驗室保存。

核糖核酸酶（RNaseA）、溶菌酶（lysozyme）、IPTG、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、瓊脂糖、過硫酸銨、丙烯酰胺、甘氨酸、2-巰基乙醇、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷、硼酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）metyl aminomethane，Tris）、考馬斯亮藍、乙二胺四乙酸二鈉、甘油、溴酚藍阿拉丁、核酸染料 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；磷酸二氫鉀 沈陽市華東試劑廠；D-果糖、磷酸氫二鉀、冰乙酸、甲醇、無水乙醇、鹽酸 天津科密歐化學試劑有限公司；DL15 000 DNA Marker、T4 DNA連接酶、堿性磷酸酶、限制性內切酶SacⅠ和EcoRⅠ、HSTMMix、蛋白質標準Marker 日本TaKaRa公司；NADH 美國Sigma公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、膠提取試劑盒、DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒 美國Omega公司。

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SX-700高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；U3900紫外-可見光分光光度計 日本日立公司；Z400K高速冷凍離心機 德國Hermle公司；JYD-150智能型超聲波細胞粉碎機 上海信之儀器有限公司；TU-100恒溫金屬浴上海一恒科技有限公司；EPS-300電泳儀 上海天能科技有限公司；ZWY-100H/240恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；GelDoc2000凝膠成像儀、1658001 SDS-PAGE電泳儀 美國Bio-Rad公司；PTC-225 PCR儀 美國MJ Research公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

假腸膜明串珠菌KCTC3652的基因組DNA提取步驟按DNA提取試劑盒操作步驟進行，提取基因組總DNA經(jīng)驗證后置于－20 ℃條件下保存。

1.3.2 表達載體pETDuet-1-mdh的構建

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫中MDH基因序列信息（該基因序列已經(jīng)在歐洲分子生物學實驗室（The European Molecular Biology Laboratory，EMBL）核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中報道，登錄號為AJ486977）設計引物Lpmdh-FEcoRⅠ（5′-TTGAATTCAATGGAAGCACTTGTGTTAA CT-3′）和Lpmdh-R-SacⅠ（5′-TTGAGCTCTTATGCCT CTTCGCCAC-3′）后，以假腸膜明串珠菌KCTC3652基因組DNA為模板，進行MDH結構基因的PCR擴增［16］。PCR反應體系如下：HSTMMix 25 μL；Lpmdh-FEcoRⅠ、Lpmdh-R-SacⅠ各1 μL（終濃度1 μmol/L）；假腸膜明串珠菌KCTC3652基因組DNA提取液1 μL；加雙蒸水至50 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR反應液進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對擴增片段進行膠回收提取純化后進行EcoR I和SacⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接到同樣雙酶切的pETDuet-1載體連接，構建一個新的重組質粒pETDuet-1-mdh。重組質粒轉化到E.coli Top10感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，并經(jīng)PCR擴增和酶切進行鑒定，將鑒定正確的重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。將基因測序正確的重組質粒pETDuet-1-mdh轉化表達宿主E.coli BL21（DE3）。

1.3.3 表達載體pETDuet-1-mdh的誘導表達

將重組質粒pETDuet-1-mdh 2 μL轉入E.coli BL21（DE3）進行轉化，將轉化后的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中（終質量濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素），在37 ℃振蕩培養(yǎng)，直至OD600 nm值達到0.6時加入1 mmol/L 的IPTG，20 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，采集菌體懸浮液［17］。將菌體懸浮液在4 ℃、8 000×g條件下離心5 min 收集菌體，用生理鹽水清洗菌體2 次，再加入發(fā)酵液初始體積的1% pH 7.0 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體，超聲波裂解菌體細胞直至菌體溶液澄清，得到菌體裂解液。將菌體裂解液在4 ℃、15 000×g離心30 min，對菌體裂解液和離心后上清液蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析［18］。

1.3.4 MDH活性測定

MDH活性測定溶液包括100 mmol/L pH 6.0磷酸鉀緩沖液，200 mmol/L NADH和200 mmol/L D-果糖，加入上述上清液作為重組酶粗提液起始反應。MDH的活性通過測定NADH在340 nm波長處的吸光度變化測得［19］。酶活力單位定義為1 min消耗1 mol NADH所用的酶量。

2 結果與分析

2.1 甘露醇脫氫酶生物學信息

根據(jù)EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫提供的生物學信息（圖1），假腸膜明串珠菌mdh基因片段大小為1 017 bp，編碼338 個氨基酸，蛋白質分子質量大小為36.0 kD。

2.2 mdh基因的克隆和表達載體構建

以假腸膜明串珠菌基因組DNA為模板，使用Lpmdh-F-EcoRⅠ和Lpmdh-R-SacⅠ為引物，進行mdh基因的PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，擴增產(chǎn)物在約1 000 bp處有明顯的擴增條帶，同預期目的片段（1 017 bp）大小相符（圖2）。擴增片段膠回收提取純化后經(jīng)EcoR Ⅰ和SacⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物連接到同樣雙酶切的pETDuet-1載體連接，構建表達載體pETDuet-1-mdh（圖3）。轉化E.coli Top10感受態(tài)細胞篩選陽性單克隆菌，在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質粒進行EcoR Ⅰ和SacⅠ雙酶切鑒定，結果如圖4所示，雙酶切產(chǎn)生5 420 bp和1 000 bp兩條條帶，分別對應線性表達載體和插入目的基因大小，且該陽性克隆質粒經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證序列正確、無突變現(xiàn)象，表明mdh基因的表達載體成功構建。將基因測序正確的重組質粒pETDuet-1-mdh轉化至表達宿主E.coli BL21（DE3）。

2.3 表達載體pETDuet-1-mdh的誘導表達

分別將pETDuet-1和pETDuet-1-mdh轉入E.coli BL21（DE3）培養(yǎng)，對兩種菌株的全菌體蛋白和菌體破碎上清液進行了SDS-PAGE分析，結果如圖5所示。泳道1和2的pETDuet-1轉化菌株全菌體蛋白和上清液蛋白在36.0 kD處無蛋白條帶，而泳道3和4的表達載體pETDuet-1-mdh轉化菌株在36.0 kD處有明顯的表達蛋白條帶且與預測MDH大小相當，破碎液上清液中檢測出同樣蛋白條帶，說明重組菌株表達了MDH且表達可溶。

2.4 MDH的活性分析

重組質粒pETDuet-1-mdh轉化菌株粗酶液中MDH活力為0.15 U/mg pro，高于假腸膜明串珠菌中MDH活力（0.03 U/mg pro），而pETDuet-1轉化菌株粗酶液中未測定出酶活力，說明重組菌株成功表達了MDH且活性較高。

3 結 論

大腸桿菌是應用最為廣泛的蛋白表達系統(tǒng)之一。假腸膜明串珠菌作為異型發(fā)酵乳酸菌的一種，產(chǎn)生MDH，在NADH或NADPH為輔酶催化果糖生成甘露醇，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇的關鍵酶。本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)探索了高效表達假腸膜明串珠菌中MDH的方法，首先利用PCR從假腸膜明串珠菌中擴增出mdh的結構基因，然后克隆入表達載體pETDuet-1，構建了MDH表達質粒pETDuet-1-mdh，將其轉化進入E.coli BL21（DE3），經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達。重組甘露醇脫氫酶基因在大腸桿菌內成功表達且表達可溶，其蛋白質分子質量為36.0 kD，活力為0.15 U/mg pro，高于假腸膜明串珠菌中MDH活力0.03 U/mg pro。今后通過對轉化pETDuet-1-mdh的重組大腸桿菌菌株培養(yǎng)條件和IPTG誘導條件的優(yōu)化，進一步提高假腸膜明串珠菌mdh基因在大腸桿菌中的表達量，提高酶的活性，為研究其酶學特性和將假腸膜明串珠菌MDH應用于甘露醇的生產(chǎn)奠定基礎。

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中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0153-04

收稿日期：2016-01-25

基金項目：國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31260362）；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（吉教科合字［2015第40號］）

作者簡介：程雅韻（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：1748731183@qq.com

*通信作者：金清（1971—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：jinqing@ybu.edu.cn

Cloning and Expression of Mannitol Dehydrogenase Gene from Leuconostoc pseudomesenteroides

CHENG Yayun1， WANG Xin1， ZHENG Lin1， LI Guanhao1， CUI Hushan2， JIN Qing1，*
（1.Agricultural College of Yanbian University， Yanji 133002， China；2.West District of Affiliated Hospital of Yanbian University， Yanji 133000， China）

Abstract:The structural gene encoding mannitol dehydrogenase （MDH） from Leuconostoc pseudomesenteroides was amplified by PCR and cloned into the vector pETDuet-1.As a result， the plasmid pETDuet-1-mdh was constructed and transformed into E.coli BL21（DE3） for MDH expression induced by isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG）.The length of the mdh structural gene was l 017 bp.The recombinant mdh gene was successfully expressed in Escherichia coli and the molecular weight of the expressed protein was 36.0 kD.The activity of recombinant mannitol dehydrogenase was 0.15 U/mg pro， which was higher than the MDH activity of Leuconostoc pseudomesenteroides （0.03 U/mg pro）.

Key words:mannitol； mannitol dehydrogenase； Leuconostoc pseudomesenteroides； gene cloning； expression