大果榕果實乙醇提取物抗氧化活性及對a-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶抑制活性

譚 琳，鄭曉燕，王甲水，馬伏寧，康由發(fā)，臧小平，馬蔚紅（.中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚?，海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 ?？?5700；.海南大學城西校區(qū)管委會，海南 海口 570）

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大果榕果實乙醇提取物抗氧化活性及對a-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶抑制活性

譚 琳1，鄭曉燕1，王甲水1，馬伏寧1，康由發(fā)2，臧小平1，馬蔚紅1
（1.中國熱帶農業(yè)科學院海口實驗站，海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 海口 570102；2.海南大學城西校區(qū)管委會，海南 海口 571101）

摘 要：研究大果榕果實的多酚含量及其抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶抑制活性，為其進一步開發(fā)利用奠定基礎。以采自海南保亭七仙嶺的大果榕果實為實驗材料，用體積分數65%的乙醇提取大果榕果實多酚，采用Folin-酚法測定總酚含量。對獲得的大果榕果實多酚進行1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基、羥自由基（·OH）清除率以及α-葡萄糖苷酶抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性測定。結果表明：大果榕果實多酚含量較高，達1.92 mg/g（以干質量計），其對DPPH自由基、ABTS+·和·OH均具有顯著的清除活性，且呈質量濃度依賴性，IC50值分別為141.25、91.20、45.71 μg/mL；大果榕果實多酚對α-葡萄糖苷酶抑制活性強于陽性對照阿卡波糖，且呈現明顯的質量濃度依賴性，IC50值為102.33 μg/mL；同時大果榕果實多酚對乙酰膽堿酯酶也具有一定的抑制活性，IC50值為 4.9 mg/mL。研究結果表明大果榕果實多酚具有良好的抗氧化性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性。

關鍵詞：大果榕；果實多酚；抗氧化活性；自由基清除活性；α-葡萄糖苷酶抑制活性；乙酰膽堿酯酶抑制活性

引文格式：

譚琳， 鄭曉燕， 王甲水， 等.大果榕果實乙醇提取物抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶抑制活性［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 77-81.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613014. http://www.spkx.net.cn

TAN Lin， ZHENG Xiaoyan， WANG Jiashui， et al.Antioxidant activity and inhibitory activity of ethanol extract from Ficus auriculata fruits against α-glucosidase and acetylcholine esterase［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 77-81.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613014. http://www.spkx.net.cn

近年來許多研究表明植物多酚不僅具有良好的抗氧化性，同時還具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性。如桑椹果實多酚［1］、黑加侖果實多酚［2］等是α-葡萄糖苷酶極好的抑制劑，蘋果多酚［3］、桃金娘果實多酚［4］、野生藍莓多酚［5］對乙酰膽堿酯酶具有顯著的抑制活性，這為人們通過膳食營養(yǎng)預防和治療糖尿病及阿爾茨海默癥提供了理論指導，也為開發(fā)相關的健康食品提供了實驗依據。因此，從可食性植物尤其是水果中探尋具有α-葡萄糖苷酶抑制活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性的多酚化合物已成為近年來食品營養(yǎng)學研究的熱點。

大果榕（Ficus auriculata）為?？疲∕oraceae）榕屬（Ficus）植物，俗稱饅頭果、大無花果，分布于我國海南、云南、廣西、貴州等地。大果榕果實成熟時清香微甜，可食用［6］?！赌纤巿@植物名錄》記載大果榕的果實具有祛風宣肺、補腎益精作用，主治肺熱咳嗽、遺精、吐血［7］。近年來的研究表明大果榕葉具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病和保肝作用［8］，同時還具有很強的抑菌活性［9］。目前關于大果榕果實多酚抗氧化性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究尚無報道。本研究旨在測定大果榕果實的多酚含量、多酚的抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性，以期為大果榕果實的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果榕果實：于2014年10月30日采于海南省保亭七仙嶺國家森林公園，經中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所王祝年教授鑒定為大果榕Ficus auriculata Lour.。

4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenylβ-D-galactopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB）、碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide，ATCI） 美國Sigma公司；石杉堿甲（高效液相色譜純度＞98%） 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設備

IKA/RV10數顯型旋蒸儀 德國IKA公司；Thermo/ SPD1010真空離心濃縮儀、Thermo Multiskan FC全自動酶標儀 美國Thermo Scientifc公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大果榕果實多酚的提取

在劉曉麗［10］的方法的基礎上稍作改動：將大果榕整果洗凈，置于40 ℃烘箱烘干，用粉碎機將其粉碎，過100 目篩。稱取5 g粉末樣品，加入65%乙醇溶液200 mL，在40 ℃條件下水浴振蕩提取3 h，過濾，濾渣重復上述步驟3 次，合并3 次提取的濾液，進行旋轉蒸發(fā)和45 ℃真空濃縮揮去乙醇，得到大果榕果實浸膏。

1.3.2 總酚含量的測定

采用Folin-酚比色法［11］，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線。精確稱取大果榕果實浸膏，用無水乙醇稀釋至1 mg/mL得到母液，測定提取物的總酚含量。取0.2 mL稀釋的提取物加入0.5 mL蒸餾水和125 μL的Folin-Ciocalteu試劑，反應6 min后依次加入4 mL質量分數2%的碳酸鈉溶液和1 mL蒸餾水，混勻，避光反應90 min后于760 nm波長處測定其吸光度。各提取物總酚含量以沒食子酸（gallic acid，GA）為標準進行定量，最終的總酚含量以每克干粉所含的沒食子酸當量表示（mg GAE/g）。

1.3.3 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定

參考文獻［12］的方法，并做適當改動：將大果榕多酚用100%的乙醇分別配制成0.125、0.25、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL的樣品液，取0.2 mL不同質量濃度的樣品液添加到2 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇中，混合，振蕩，在室溫條件下放置30 min，然后在517 nm波長處檢測吸光度（Ai），以1.5 mL 95%的乙醇加入1.5 mL蒸餾水調零作為空白。IC50值為自由基清除率達到50%時的樣品的質量濃度。 ［14］的方法：精確稱取大果榕果實多酚提取物（浸膏），用水充分溶解，配制成質量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL的溶液，分別取不同質量濃度的多酚樣品0.2 mL，各加入1.9 mL ABTS+·工作液，準確反應6 min后于734 nm波長處測量吸光度（Ai），同時以VC作為陽性對照，重復3 次，結果取平均值，按下式計算ABTS+·清除率。

式中：Ac為對照組（2 mL DPPH溶液+0.1 mL蒸餾水）在517 nm波長處的吸光度；Aj為0.1 mL樣品液+ 2 mL 95%乙醇在517 nm波長處的吸光度；Ai為0.1 mL樣品液+2 mL DPPH溶液在517 nm波長處的吸光度。

1.3.4 羥自由基（·OH）清除能力的測定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［13］測定樣品的·OH清除能力：在試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL、0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）1 mL、蒸餾水1 mL、0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻，再加入0.01% H2O21 mL，混合溶液在37 ℃水浴反應60 min，于536 nm波長處測吸光度（A損，損傷管），以VC作為陽性對照，每組實驗平行3 次，取其平均值。

式中：A空為以蒸餾水替代H2O2反應體系的吸光度；A樣為以樣品替代蒸餾水反應體系的吸光度。

1.3.5 2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基清除能力的測定

式中：Aj為以超純水替代ABTS+·工作液反應體系的吸光度；A0為以超純水替代樣品溶液反應體系的吸光度。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照Li Ting［15］和康文藝［16］等的方法，先制作標準曲線，然后測定α-葡萄糖苷酶抑制活性：在96 孔板中加入112 μL磷酸鉀緩沖液（pH 6.8）、20 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶、8 μL樣品，37 ℃恒溫反應15 min后加入2.5 mmol/L PNPG 20 μL，37 ℃恒溫反應15 min。再加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液，于405 nm波長處測定吸光度（A樣），每個樣品平行測定3 次。同時設定相同條件下以磷酸鉀緩沖液替代α-葡萄糖苷酶的樣品空白組（A樣空），不加樣品的陰性對照組（A陰），不加樣品、酶與底物的空白對照組（A空）以及以阿卡波糖為抑制劑的陽性對照組（A陽）。按照下式計算α-葡萄糖苷酶活性抑制率，并求出相應IC50值。

1.3.7 乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定

參照劉海元等［17］的方法，用PBS將大果榕多果實酚配制成12.5、10、7.5、5、2.5 mg/mL的溶液，在96 孔板中加入pH 7.4的PBS 50 μL、各質量濃度樣品25 μL，1.0 μg/mL乙酰膽堿酯酶25 μL。在4 ℃保持20 min。加入0.30 mg/mL ATCI 25 μL、0.59 mg/mL DTNB 125 μL（整個反應體系體積為250 μL），37 ℃恒溫孵育20 min，用酶標儀在405 nm波長處測定吸光度（A樣），以石杉堿甲為陽性對照，重復3 次取平均值。

式中：A樣底為樣品本底組（用pH 7.4的PBS替代酶溶液）的吸光度；A空為空白組（用含1% DMSO的pH 7.4的PBS替代樣品）的吸光度；A空底為空白本底組（用pH 7.4 的PBS替代空白組中的酶溶液）的吸光度。

2 結果與分析

2.1 總酚含量測定結果

采用Folin-酚比色法測定總酚含量，沒食子酸對照品在20～100 μg的范圍內線性良好，標準曲線方程為Y=0.000 7X+0.059（R2=0.999 2），測定得到大果榕整果多酚的多酚含量為1.92 mg/g（以干質量計）。

2.2 DPPH自由基清除能力

如圖1所示，大果榕果實多酚質量濃度為2.5～25 μg/mL時，其清除 DPPH自由基的能力較弱，與VC相比差異顯著（P＜0.05），然而隨著質量濃度的增大，大果榕果實酚對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，當大果榕果實多酚質量濃度達到500 μg/mL時，其對DPPH自由基清除率達到了（71.2±2.2）%，大果榕果實多酚清除DPPH自由基的IC50值為141.25 μg/mL。

2.3 ·OH清除能力

如圖2所示，大果榕果實多酚質量濃度為50 μg/mL時，已具有一定的·OH清除活性，其清除能力與對照VC差異不大（P＞0.05），隨著大果榕果實多酚質量濃度的增大，其對·OH的清除率呈上升趨勢，當質量濃度達到600 μg/mL時，大果榕果實多酚對·OH的清除率達到（96.61±1.28）%，比VC的·OH清除率更高（P＜0.05），大果榕果實多酚清除·OH的IC50值為45.71 μg/mL。

2.4 ABTS+·清除能力

如圖3所示，大果榕果實多酚質量濃度為50 μg/mL時，對ABTS+·的清除能力較弱，與VC的ABTS+·清除能力有顯著差異（P＜0.05），但是隨著質量濃度的增大，其ABTS+·清除能力顯著增強，當質量濃度為200 μg/mL時，大果榕果實多酚對ABTS+·的清除率達（97.17±1.37）%，并趨于飽和，大果榕果實多酚清除ABTS+·的IC50值為91.20 μg/mL。

2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性

如圖4所示，大果榕果實多酚在低質量濃度（62.5 μg/mL）時，抑制α-葡萄糖苷酶的活性較低（30.5%），但隨著其質量濃度的增加，抑制活性顯著增強，并且比陽性對照阿卡波糖表現出更強的抑制活性（P＜0.05），當質量濃度為1 000 μg/mL時，大果榕果實多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率達到（94.56±1.77）%，之后趨于飽和，大果榕果實多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性IC50值為102.33 μg/mL。

2.6 乙酰膽堿酯酶抑制活性

如圖5所示，大果榕果實多酚具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性，當其質量濃度為1 mg/mL時，對乙酰膽堿酯酶活性的抑制率達到（32.45±1.50）%。在一定質量濃度范圍內，大果榕果實多酚對乙酰膽堿酯酶活性的抑制率呈現質量濃度依賴性，但活性不高（IC50值為4.9 mg/mL），與陽性對照石杉堿甲相比有顯著差異（P＜0.05）。

3 討 論

本研究以體積分數65%的乙醇提取了大果榕果實多酚，Folin-酚法測定其總酚含量為1.92 mg/g。獲得的大果榕果實多酚對DPPH自由基、ABTS+·和·OH均具有顯著的清除活性，并且隨著多酚質量濃度的增加，其清除能力也隨之增強，IC50值分別為141.25、91.20、45.71 μg/mL。Shi Yinxian等［18］報道了大果榕葉提取物的抗氧化性，其清除DPPH自由基的IC50值為290 μg/mL，清除ABTS+·的IC50值為250 μg/mL，這也表明大果榕果實乙醇提取物較大果榕葉片乙醇提取物具有更強的抗氧化活性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制小腸內各種α-葡萄糖苷酶，減慢淀粉類分解為葡萄糖的速率，從而減緩腸道內葡萄糖的吸收，降低餐后血糖水平的升高，目前已廣泛應用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治［19］?；瘜W合成藥物常常存在一定的毒副作用，因此有必要從天然產物中尋找具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的物質［20］。本研究測定了大果榕果實多酚的α-葡萄糖苷酶抑制活性，發(fā)現其活性比陽性對照阿卡波糖更高，這與常美芳等［19］得到的研究結果一致。但大果榕果實多酚中究竟是哪種化學成分在發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制活性，尚有待進一步研究。

乙酰膽堿與學習和記憶有著密切關系，乙酰膽堿酯酶抑制劑可以抑制乙酰膽堿酯酶對乙酰膽堿的分解而提高乙酰膽堿的水平，從而被廣泛應用于阿爾茨海默癥的治療［21］。目前臨床使用的乙酰膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊存在引起心血管疾病、誘發(fā)病人狂躁等副作用［22-23］，利斯的明則會引起惡心、嘔吐、頭疼等癥狀［24］，還存在引起心血管疾病的風險［25］。因此，尋找具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的天然產物對于阿爾茨海默癥的預防和治療具有重要意義。本研究結果顯示，大果榕果實多酚具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性，這為其用于開發(fā)增強記憶力的保健產品奠定了理論基礎。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613014

中圖分類號：S663.9

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0077-05

收稿日期：2015-08-13

基金項目：中國熱帶農業(yè)科學院海口實驗站科研啟動項目（HKZKY140204）；農業(yè)部財政項目

作者簡介：譚琳（1974—），女，副研究員，博士，主要從事分子營養(yǎng)學研究。E-mail：tanlin7402@126.com

Antioxidant Activity and Inhibitory Activity of Ethanol Extract from Ficus auriculata Fruits against α-Glucosidase and Acetylcholine Esterase

TAN Lin1， ZHENG Xiaoyan1， WANG Jiashui1， MA Funing1， KANG Youfa2， ZANG Xiaoping1， MA Weihong1
（1.Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 570102， China； 2.Management Committee of Chengxi Campus， Hainan University， Haikou 571101， China）

Abstract:Total phenolics were extracted from Ficus auriculata fruits using 65% ethanol and quantified by the Folin phenol method.The antioxidant activity of the ethanol extract was assessed by DPPH， ABTS and hydroxyl radical scavenging assays and its inhibitory activity against alpha-glucosidase and acetylcholine esterase was also evaluated.Results showed that the fruit extract contained high levels of total phenolics （1.92 mg/g DW） and could scavenge DPPH， ABTS and hydroxyl radicals effectively in a concentration dependent manner with IC50of 141.25， 91.20 and 45.71 μg/mL， respectively.It also exhibited strong inhibitory activity against α-glucosidase in a concentration dependent manner with IC50of 102.33 μg/mL.Similarly， it showed inhibitory activity against acetylcholine esterase with IC50of 4.9 mg/mL.Therefore， the polyphenolrich extract from Ficus auriculata fruits has strong antioxidant potential and inhibitory activity against α-glucosidase and acetylcholine esterase.

Key words:Ficus auriculata； fruit polyphenols； antioxidant activity； radical scavenging activity； α-glucosidase inhibitory activity； acetylcholine esterase inhibitory activity