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    苦丁冬青苦丁茶咖啡??崴犷愇镔|與a-淀粉酶的相互作用特性

    2016-08-10 07:24:30徐冬蘭王晴川曾曉雄南京農業(yè)大學食品科技學院江蘇南京210095
    食品科學 2016年13期
    關鍵詞:相互作用淀粉酶

    徐冬蘭,王晴川,曾曉雄,孫 怡*(南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇 南京 210095)

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    苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸類物質與a-淀粉酶的相互作用特性

    徐冬蘭,王晴川,曾曉雄,孫 怡*
    (南京農業(yè)大學食品科技學院,江蘇 南京 210095)

    摘 要:探討苦丁冬青苦丁茶中咖啡??崴幔╟affeoylquinic acids,CQA):3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA對α-淀粉酶的體外抑制活性,并采用熒光光譜法和圓二色譜法分析CQA與α-淀粉酶的相互作用特性,使用修正后的Stern-Volmer方程與van't Hoff方程探討CQA-酶之間的結合常數、結合位點數及熱力學參數。結果表明:3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA對α-淀粉酶均有較強的抑制作用,半抑制濃度(IC50)分別為1.54、1.05、1.28、0.96、0.33、0.64 mg/mL;CQA與α-淀粉酶發(fā)生結合反應,生成穩(wěn)定的復合物,從而造成酶分子內部熒光發(fā)生猝滅;熱力學參數分析表明CQA與α-淀粉酶主要靠疏水作用力結合,反應自發(fā)進行。此外,圓二色譜結果顯示CQA的結合引起α-淀粉酶二級結構的變化,破壞了酶蛋白的天然構象,從而降低了酶的催化活性。

    關鍵詞:α-淀粉酶;咖啡??崴?;熒光光譜;圓二色譜;相互作用

    引文格式:

    徐冬蘭, 王晴川, 曾曉雄, 等.苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸類物質與α-淀粉酶的相互作用特性[J].食品科學, 2016,37(13): 6-12.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613002. http://www.spkx.net.cn

    XU DongLan, WANG Qingchuan, ZENG Xiaoxiong, et al.Interaction properties of caffeoylquinic acid derivatives from Ilex kudingcha C.J.Tseng with α-amylase[J].Food Science, 2016, 37(13): 6-12.(in Chinese with English abstract)

    隨著現代生活水平的提高和飲食習慣的改變,2型糖尿病和肥胖癥的發(fā)病率日益增高,其預防和治療方法成為了人們關注的焦點。已有研究表明餐后血糖濃度過高成為2型糖尿病和肥胖癥發(fā)生的重要因素[1-2]。胰α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)作用于淀粉或糖原分子內部的α-1,4-糖苷鍵,最終生成麥芽糖、低聚糖、糊精和少量葡萄糖,是消化系統中的一個關鍵酶[3-4]。抑制α-淀粉酶的活性可以減緩淀粉的水解過程,從而控制餐后血糖水平的升高[5-6]。因此,有效和無毒的α-淀粉酶抑制劑對于2型糖尿病和肥胖的預防和治療具有重要的意義。

    近年來,多酚類物質對α-淀粉酶的抑制活性被廣泛探討。Fei Qunqin等[7]利用酶抑制動力學探討了烏龍茶多酚及其單體表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、甲基化EGCG(EGCG3''Me)對胰α-淀粉酶體外活性的影響,表明烏龍茶多酚對胰α-淀粉酶具有顯著的抑制效果,抑制類型為競爭性抑制。Miao Ming等[8]的研究表明葡萄皮中的白藜蘆醇具有較強的α-淀粉酶抑制活性,同時熒光實驗發(fā)現白藜蘆醇能以靜態(tài)猝滅的方式與酶發(fā)生結合。阮妙蕓等[9]采用體外模擬淀粉消化實驗表明茶多酚在低濃度下便能對淀粉酶具有明顯的抑制作用。

    苦丁茶是我國南部和東部地區(qū)居民長期飲用的一種代用茶,也是傳統的藥用植物,其富含多酚類、萜類、黃酮類、多糖等活性物質,具有抗氧化、降血壓以及降脂減肥等功效[10-12]。本課題組前期建立了苦丁茶中多酚類物質的分離、純化以及高效液相色譜分析方法,表明苦丁茶中的主要多酚類物質為咖啡??崴幔╟affeoylquinic acids,CQA)類衍生物,并通過柱層析和半制備色譜制備得到了6 種物質,包括3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA[13-15]。CQA類衍生物被證明具有較強的α-淀粉酶抑制活性[16],然而關于其與α-淀粉酶的相互結合作用機理卻未見報道。因此,在前期的研究基礎上,本實驗擬采用熒光光譜法研究CQA與α-淀粉酶的相互作用特性,為闡明CQA對α-淀粉酶的抑制機理提供信息,并為天然α-淀粉酶抑制劑的開發(fā)提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    咖啡??崴幔?-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA,按照食品與納米生物技術實驗室之前報道的方法自制[13-15],純度均大于95%。

    淀粉天青、豬胰α-淀粉酶、Tris-HCl緩沖溶液(pH 6.9、0.05 mol/L)、醋酸 美國Sigma公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司;DELTA 320 pH計 德國Mettler-Toledo公司;Genius 3旋渦混勻器德國IKA公司;TDL-5型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;Synergy-2酶標儀 美國Biotek公司;F-7000型熒光分光光度計 日本Hitachi公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋江蘇國華電器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 CQA對α-淀粉酶活性的抑制作用

    參照Hansawasdi等[17]的方法并稍作修改:用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液配制質量濃度為10 mg/mL的淀粉天青底物溶液,并于沸水浴中助溶5 min,之后置于37 ℃條件下預熱備用。將0.2 mL不同質量濃度的樣品溶液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)分別與0.1 mL α-淀粉酶溶液(2.2 U/mL)充分混合,37 ℃預熱10 min后加入0.2 mL底物溶液,充分混勻后于37 ℃反應10 min。最后各加入0.5 mL 50%醋酸溶液終止反應。將反應混合液于4 ℃、3 000 r/min離心5 min,取上清液,測定其在595 nm波長處的吸光度。每組實驗重復3 次,按下式計算不同樣品對α-淀粉酶的抑制率。

    式中:Ac+為不加樣品但含酶的對照組在595 nm波長處的吸光度;Ac-為不加樣品也不含酶的空白組在595 nm波長處的吸光度;As為既加樣品也含酶的樣品組在595 nm波長處的吸光度;Ab為加入樣品但未加酶的樣品對照組在595 nm波長處的吸光度。

    1.3.2 CQA與α-淀粉酶相互作用特性的熒光光譜法分析

    熒光猝滅作用:將3.0 mL 0.05 mg/mL的α-淀粉酶溶液準確移入離心管中,用移液槍分別加入不同的樣品溶液(5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA或4,5-diCQA),使其終質量濃度為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 mg/mL,在設定溫度(293、310 K)條件下于恒溫水浴中保溫0.5 h。使用1.0 cm的石英比色皿,固定激發(fā)波長(λex)為280 nm、發(fā)射波長(λem)290~450 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm,掃描速率1 200 nm/min,在熒光分光光度計上恒溫掃描α-淀粉酶及反應混合物的熒光光譜。

    結合常數及熱力學相關參數的計算:固定激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射波長為340 nm,記錄α-淀粉酶及反應混合物在293、310 K溫度條件下的熒光強度,所得實驗數據用于結合常數和相關熱力學參數的計算。

    3D熒光光譜分析:設定激發(fā)波長與發(fā)射波長的掃描范圍均為200~600 nm,狹縫寬度為5 nm,掃描α-淀粉酶及反應混合物的3D圖譜。

    1.3.3 圓二色譜(circular dichroism,CD)掃描

    α-淀粉酶及其與樣品反應混合液的CD光譜在Jasco-810圓二色譜儀上進行。用緩沖液配制α-淀粉酶與樣品體系,使體系中蛋白質質量濃度始終固定為0.5 mg/mL,而樣品(5-CQA、3,5-diCQA)質量濃度分別為0.01、0.02 mg/mL。在室溫條件下反應0.5 h后,分別測定α-淀粉酶原液及反應混合液在200~250 nm波長范圍內遠紫外CD光譜。每個實驗樣品重復掃描3 次。采用CDpro軟件中Selcon3算法分析取得的CD數據,得到關于α-淀粉酶二級結構的信息。

    2 結果與分析

    2.1 CQA對α-淀粉酶的抑制作用

    以樣品質量濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標,繪制抑制曲線,結果如圖1所示,隨著樣品質量濃度的增大,抑制率明顯升高,當3,5-diCQA的質量濃度為1.0 mg/mL時,抑制率接近100%,表明6 種CQA對α-淀粉酶的活性均有較強的抑制作用。通過線性擬合計算出不同樣品對α-淀粉酶的半抑制濃度(IC50),結果顯示3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA的IC50分別為1.54、1.05、1.28、0.96、0.33、0.64 mg/mL,抑制能力由強到弱的順序為:3,5-diCQA>4,5-diCQA>3,4-diCQA>4-CQA>5-CQA>3-CQA。雙取代咖啡??崴岬囊种菩Ч黠@優(yōu)于單取代咖啡酰奎尼酸,咖啡?;龆啵种苹钚栽鰪?,表明結構中的咖啡酰基是主要的活性基團,對抑制活性貢獻最大。

    2.2 CQA對α-淀粉酶熒光光譜的猝滅效應

    藥物小分子與蛋白質的相互結合作用通常會降低蛋白質內部的熒光強度,稱為熒光猝滅效應[18]。胰α-淀粉酶由496 個氨基酸殘基組成,包括17 個色氨酸,因此在激發(fā)波長280 nm處能夠檢測到內源性熒光[19-20]。實驗中固定激發(fā)波長為280 nm,掃描α-淀粉酶及CQA與α-淀粉酶反應混合物在300~450 nm波長范圍內的發(fā)射光譜,結果如圖2所示。隨著4 種CQA質量濃度不斷增大,α-淀粉酶的熒光強度逐漸降低,熒光光譜發(fā)生明顯猝滅。此外,α-淀粉酶在340 nm波長處具有最大熒光發(fā)射峰,隨著CQA的加入,最大發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移(5-CQA,從340 nm移至360 nm;3,4-diCQA,從340 nm移至358 nm;3,5-diCQA,從340 nm移至362 nm; 4,5-diCQA,從340 nm移至365 nm)。這些結果表明CQA小分子與α-淀粉酶之間發(fā)生了結合作用,形成了復合物,使得酶蛋白內部結構發(fā)生改變,發(fā)色團所處微環(huán)境的極性增強,疏水性發(fā)生變化[21],最終改變了α-淀粉酶與作用底物之間的親和作用,導致催化活性下降。

    2.3 結合常數及熱力學相關參數的分析

    根據熒光猝滅數據,當熒光供體分子與猝滅劑受體分子發(fā)生結合時,熒光猝滅強度和猝滅劑濃度之間的關系符合修正后的Stern-Volmer方程[22]:

    式中:F0、F分別為樣品加入前后α-淀粉酶的相對熒光強度;Ka為結合常數;n為結合位點數;[Q]為樣品質量濃度/(mg/mL)。

    以lg[Q]為橫坐標,lg[(F0-F)/F]為縱坐標作圖,可得一組直線(圖3)。由直線的截距和斜率可以求出不同CQA與酶相互作用的結合常數Ka和結合位點數n(表1)。

    小分子與蛋白質之間可通過范德華力、氫鍵、靜電引力以及疏水性作用力相互作用。根據CQA和α-淀粉酶結合過程中的反應焓變(ΔH)和熵變(ΔS)可確定兩者之間的結合類型。根據van't Hoff方程,可計算出ΔH 和ΔS。

    式中:K為相應溫度條件下(293、310 K)熒光物質與猝滅劑之間的結合常數;R為氣體常數(8.314 J/(mol·K));T為反應溫度/K,當溫度變化不大時,反應的焓變可以看作常量。

    根據公式(3)、(4)計算得到ΔH和ΔS,再由式(5)可計算得到CQA與α-淀粉酶結合過程的吉布斯自由能(ΔG),結果列于表1。

    據文獻[23]報道,茶多酚與蛋白之間的結合常數通常為1.0×104~1.0×105L/mol。由表1可知,4 種CQA物質與α-淀粉酶的結合常數為1.65×106~2.18×107L/mol,表明兩者之間存在較強的結合作用,雙取代咖啡??崴岬慕Y合常數略大于5-CQA,表明咖啡?;脑龆嗵岣吡私Y合能力,與抑制活性實驗結果相一致。此外還可發(fā)現,在293 K和310 K溫度條件下,結合常數隨著溫度的升高而增大,說明溫度升高增加了CQA與α-淀粉酶之間的親和性,提高了CQA-酶復合物的穩(wěn)定性,從而說明在人體體溫條件下更利于CQA抑酶活性的發(fā)揮。表1結果顯示n值約為1,表明4 種CQA與α-淀粉酶之間均存在一個結合位點。

    Ross等[24]根據大量實驗總結了水相中小分子與生物大分子結合的熱力學參數與主要作用力之間的關系:1)當ΔH>0、ΔS>0時,兩者間為疏水作用力;2)當ΔH<0,ΔS<0時,則為氫鍵和范德華力;3)當ΔH≈0,ΔS>0,則為靜電引力。根據表1結果可知,4 種CQA與α-淀粉酶結合反應的ΔH和ΔS均大于0,表明兩者之間主要靠疏水作用力相互結合,同時,CQA與α-淀粉酶分子結構中均含有較多的羥基基團,因此氫鍵的作用仍然不可忽視。此外,結合過程中的ΔG小于0,表明CQA與α-淀粉酶之間的相互作用是自發(fā)進行的。

    2.4 3D熒光光譜猝滅分析

    3D熒光光譜是近年來發(fā)展起來的熒光分析技術,不僅具有靈敏度高和選擇性強的特點,還能全面展現蛋白質的熒光特性[25]。α-淀粉酶具有內源熒光發(fā)色基團(主要為色氨酸、酪氨酸和脯氨酸),因此可采用3D熒光光譜有效表征CQA與α-淀粉酶相互作用后酶蛋白構象和空間分子結構的變化。

    如圖4所示,CQA在測定范圍內無熒光發(fā)射,對結果不會造成干擾。α-淀粉酶在激發(fā)波長為200~300 nm,發(fā)射波長為300~400 nm范圍內具有兩個強熒光峰,標為峰1(230 nm/340 nm,λex/λem)和峰2(280 nm/340 nm,λex/λem),其中峰1是與酶蛋白多肽鏈的骨架結構相關,反映蛋白質二級結構變化,而峰2反映的主要是酶分子中色氨酸殘基的熒光行為[26]。從圖中可以看出,加入CQA后α-淀粉酶的兩個峰明顯被猝滅,其中3,4-diCQA和4,5-diCQA的猝滅效果最好,與常規(guī)熒光猝滅分析結果一致,再次證明雙取代咖啡??崴釋Ζ?淀粉酶有較強的結合作用。據報道,相對分子質量較大的多酚-蛋白質形成復合物的結合常數比相對分子質量較小的多酚-蛋白質復合物的結合常數要大,這可能是由于相對分子質量較大的多酚中存在更多羥基基團,與蛋白質分子之間形成更多的氫鍵,從而增加了復合物的穩(wěn)定性[27]。CQA與α-淀粉酶相結合,由此導致酶蛋白空間構象以及所處微環(huán)境疏水性的變化,最終表現為對酶活性的抑制作用。

    2.5 CQA對α-淀粉酶圓二色譜的影響

    圓二色譜是一種特殊的吸收譜,它利用蛋白質等生物大分子具有的圓二色性得到關于生物大分子的二級結構信息。圓二色譜遠紫外區(qū)段(178~250 nm)的主要生色團是肽鏈,這一波長范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構象的信息[28-29]。為了進一步理解CQA與α-淀粉酶之間的結合機制,探討其對酶蛋白二級結構產生的影響,本實驗采用遠紫外CD光譜分析5-CQA和3,5-diCQA結合后α-淀粉酶的構象變化。如圖5所示,α-淀粉酶在208 nm 和222 nm波長左右有兩個負峰,這是由肽鏈中的α-螺旋結構發(fā)生n-π*躍遷而產生的,即負Cotton效應[30]。加入樣品(5-CQA或3,5-diCQA)后,α-淀粉酶的CD光譜發(fā)生了較大的變化。隨著樣品質量濃度的增加,α-淀粉酶在208 nm和222 nm波長處的兩個負峰信號變弱,并且位置發(fā)生明顯移動,表明酶蛋白二級結構中的α-螺旋含量降低。并且從圖中可以看出,3,5-diCQA對α-淀粉酶二級結構的影響要大于5-CQA,這表明CQA結構中的咖啡?;谂cα-淀粉酶的結合過程中發(fā)揮了重要作用。

    為了進一步定量分析CD圖譜數據,本實驗采用CDpro軟件中的Selcon3算法對α-淀粉酶分子中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲結構的相對含量進行預測,結果列于表2。α-淀粉酶二級結構中包含17.6%的α-螺旋,19.2% 的β-折疊,8.2%的β-轉角和55%的無規(guī)卷曲。5-CQA、3,5-diCQA與酶結合后使其4 種二級結構含量均發(fā)生變化,主要表現為α-螺旋含量降低,β-轉角含量增多,說明酶蛋白的天然空間構象受到破壞,穩(wěn)定性下降。

    表2a-淀粉酶及a-淀粉酶與CQA結合后的二級結構含量Table2 Secondary structuralanalysisofa- amylaseandtheCQA-enzyme systems%樣品 α-螺旋 β-折疊 β-轉角 無規(guī)卷曲α-淀粉酶 17.6 19.2 8.2 55.0 α-淀粉酶+5-CQA(0.01 mg/mL) 16.7 43.1 9.2 31.0 α-淀粉酶+5-CQA(0.02 mg/mL) 11.9 29.9 21.0 37.2 α-淀粉酶+3,5-diCQA(0.01 mg/mL) 9.3 24.8 32.7 33.2 α-淀粉酶+3,5-diCQA(0.02 mg/mL) 3.4 15.8 32.7 48.1

    3 結 論

    本研究探討了苦丁冬青苦丁茶中CQA類物質對α-淀粉酶的抑制作用,并采用熒光光譜法和圓二色譜法研究了兩者之間相互作用的機理。結果表明CQA類物質能夠抑制α-淀粉酶的活性,抑制能力由大到小為:3,5-diCQA>4,5-diCQA>3,4-diCQA>4-CQA>5-CQA>3-CQA。雙取代咖啡??崴岬囊种菩Ч麖娪趩稳〈Х弱?崴幔f明分子中的咖啡?;l(fā)揮了主要作用。CQA與α-淀粉酶的相互作用引起酶蛋白熒光光譜的猝滅,造成酶內部基團所處微環(huán)境的疏水性減弱。CQA與酶之間主要依靠疏水性作用力結合,并且只具有一個結合位點,所有反應均自發(fā)進行。CD光譜結果表明,CQA與α-淀粉酶形成穩(wěn)定的復合物后使酶蛋白的二級結構發(fā)生變化,破壞了酶分子的空間構象,從而有效抑制了酶的催化活性。因此,本研究為探究苦丁茶中CQA類物質作為天然α-淀粉酶抑制劑的開發(fā)提供了理論基礎,在糖尿病和肥胖癥的預防和治療中具有一定意義。

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    中圖分類號:TS272;TS201.3

    文獻標志碼:A

    文章編號:1002-6630(2016)13-0006-07

    收稿日期:2016-01-14

    基金項目:國家自然科學基金面上項目(31171666);江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目

    作者簡介:徐冬蘭(1990—),女,碩士研究生,研究方向為食品生物技術。E-mail:2013108031@njau.edu.cn

    *通信作者:孫怡(1966—),女,高級實驗師,博士,研究方向為食品生物技術。E-mail:sunyi01@njau.edu.cn

    Interaction Properties of Caffeoylquinic Acid Derivatives from Ilex kudingcha C.J.Tseng with α-Amylase

    XU Donglan, WANG Qingchuan, ZENG Xiaoxiong, SUN Yi*
    (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

    Abstract:The inhibitory effects of six caffeoylquinic acid (CQA) derivatives (3-CQA, 4-CQA, 5-CQA, 3,4-diCQA,3,5-diCQA and 4,5-diCQA) against α-amylase were studied comparatively by inhibitory activity assay.Furthermore, the potential interaction mechanisms between CQA derivative and α-amylase were investigated by fluorescence quenching and circular dichroism (CD) spectroscopy.The binding parameters were calculated according to modified Stern-Volmer equation,and the thermodynamic parameters were determined by the van't Hoff equation.The results showed that all CQA derivatives exhibited inhibitory effects on α-amylase and the half inhibitory concentrations (IC50) were 1.54, 1.05, 1.28, 0.96, 0.33 and 0.64 mg/mL, respectively.CQA derivatives interacted with α-amylase, forming stable complexes and leading to fluorescence quenching.Thermodynamic analysis indicated that the interaction process was spontaneous, and hydrophobic force might be primarily responsible for the interaction.In addition, the CD spectra suggested that the binding of CQA derivatives to the enzyme induced the change of protein structure, thus destabilizing the enzyme and reducing its activity.

    Key words:α-amylase; caffeoylquinic acid; fluorescence spectroscopy; circular dichroism spectrum; interaction

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