缺氧微環(huán)境下人肺腺癌A549細(xì)胞的microRNA基因芯片結(jié)果分析*

耿瑩，鮑永霞，肖景濱，葛冬杰，梁錚

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院 呼吸科，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江省軍區(qū)醫(yī)院 首長(zhǎng)保健室，黑龍江 哈爾濱 150009；3黑龍江省哈爾濱市第一醫(yī)院 呼吸科，黑龍江 哈爾濱 150010）

?

論著

缺氧微環(huán)境下人肺腺癌A549細(xì)胞的microRNA基因芯片結(jié)果分析*

耿瑩1，鮑永霞1，肖景濱2，葛冬杰3，梁錚1

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院 呼吸科，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江省軍區(qū)醫(yī)院 首長(zhǎng)保健室，黑龍江 哈爾濱 150009；3黑龍江省哈爾濱市第一醫(yī)院 呼吸科，黑龍江 哈爾濱 150010）

摘要：目的研究缺氧對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞中microR NA（miR NA）表達(dá)譜的影響，分析靶基因參與的生物學(xué)功能和通路。方法基于miR NA芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，分析缺氧條件和正常氧條件下培養(yǎng)的A549細(xì)胞中差異表達(dá)的miR NA，并預(yù)測(cè)該miR NA的靶基因，分析靶基因參與的生物學(xué)功能和通路。結(jié)果本研究共篩選出14個(gè)差異表達(dá)miR NA，包括9個(gè)在缺氧細(xì)胞中上調(diào)miR NA和5個(gè)下調(diào)miR NA。上調(diào)和下調(diào)miR NA的靶基因都參與DNA轉(zhuǎn)錄、核染色質(zhì)修飾等功能，并且都參與Wnt信號(hào)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路。結(jié)論缺氧的肺腺癌A549細(xì)胞中miR NA表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，一些差異表達(dá)miR NA對(duì)某些基因具有調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：肺腺癌；A549細(xì)胞；芯片；缺氧；差異表達(dá)microR NA

肺癌是世界人口中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居腫瘤死亡率之首，盡管其發(fā)生的蛋白和基因組圖譜已經(jīng)部分闡明，但是其發(fā)病率仍逐年升高，缺乏有效的早期診斷和治療手段是主要原因。MicroRNAs （miRNA）是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-2]，其廣泛存在于真核生物體中，是一類高度保守、長(zhǎng)度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，約18～24個(gè)堿基，通過(guò)抑制mRNA的翻譯和降解靶mRNA來(lái)調(diào)控生物體中基因的表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。miRNA具有組織特異性，與肺組織相關(guān)的包括Let-7、Let-34、Let-21、Let-143、Let-145、Let-31、Let-146等40余種，其在肺癌組織表達(dá)中降低或升高，以癌基因或抑癌基因樣作用調(diào)解轉(zhuǎn)錄后翻譯，促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

有研究表明，缺氧可以引起肺癌中一些基因和miRNA表達(dá)水平的變化[3-4]。盡管人們對(duì)肺癌細(xì)胞缺氧引起的分子生物學(xué)變化已經(jīng)有一定的了解，但是其中的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，還有很多可能發(fā)生重大變化的基因、miRNA和相關(guān)的生物學(xué)通路等還未被發(fā)現(xiàn)。因此，還需進(jìn)一步的深入研究，而目前還沒(méi)有關(guān)于缺氧對(duì)肺癌細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜影響的報(bào)道。

本研究利用缺氧培養(yǎng)箱對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行缺氧處理，采用miRNA芯片技術(shù)分析缺氧處理的A549細(xì)胞和正常氧狀態(tài)下的A549細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA，并利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因，分析靶基因所參與的生物學(xué)功能和通路。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞系

本研究選取人肺腺癌A549細(xì)胞為研究材料，該細(xì)胞系購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌A549細(xì)胞系冷凍存于液氮中，取出后置于37℃電熱恒溫水浴箱中快速解凍復(fù)蘇。1 000 r/min離心10 min，棄上清液，更換新鮮的培養(yǎng)基。細(xì)胞在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，正常條件下的培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳CO2；缺氧條件則使用缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、1%氧氣O2。選擇缺氧狀態(tài)下（1%O2）和正常條件下培養(yǎng)8 h的A549細(xì)胞用于miRNA芯片分析。

1.3芯片數(shù)據(jù)分析

將上述培養(yǎng)好的兩組A549細(xì)胞交給哈爾濱欣科瑞經(jīng)貿(mào)有限公司做miRNA芯片分析。

1.4差異表達(dá)miRNA的篩選

基于倍數(shù)法篩選兩組樣本的差異表達(dá)miRNA。計(jì)算兩組間芯片miRNA表達(dá)值的差異倍數(shù)，將滿足差異倍數(shù)>2的miRNA識(shí)別為差異表達(dá)的miRNA。

1.5預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因

利用數(shù)據(jù)庫(kù)Target Scan，預(yù)測(cè)得到差異表達(dá)miRNA調(diào)控的所有靶基因。該數(shù)據(jù)庫(kù)是目前利用理論方法預(yù)測(cè)miRNA靶基因較為理想的數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分別使用基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，利用Fisher精確檢驗(yàn)和多重比較檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)功能的顯著性水平（P值），并用Benjamini-Hochberg法[5]校正P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1差異表達(dá)miRNA的統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，本研究共篩選14個(gè)在缺氧A549細(xì)胞和正常A549細(xì)胞之間差異表達(dá)的miRNA。其中，9個(gè)在缺氧組中上調(diào)的miRNA（如hsa-miR-301b、hsa-miR-769-5p等）和5個(gè)下調(diào)的miRNA（如hsamiR-622、hsa-miR-181a-3p等）（見(jiàn)表1）。hsa-miR-301b上調(diào)的差異倍數(shù)最大，hsa-miR-622下調(diào)的差異倍數(shù)最大。

2.2差異表達(dá)miRNA的靶基因分析

為研究差異表達(dá)的miRNA在缺氧條件下對(duì)哪些基因產(chǎn)生調(diào)控作用，本研究利用Target Scan數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因。共有4個(gè)上調(diào)的miRNA（hsa-mir-301b、hsa-mir-148b-3p、hsa-mir-769-5p和hsa-mir-1180）和2個(gè)下調(diào)的miRNA（hsamir-622和hsa-mir-202-3p）預(yù)測(cè)到靶基因，靶基因數(shù)目總共3259個(gè)，例如，上調(diào)表達(dá)的hsa-miR-301b調(diào)控的靶基因包括FOXF2、CRE5B、MARK3和MYB等；hsa-mir-148b-3p調(diào)控NOG、WNT10B等基因；hsa-miR-769-5p調(diào)控ARID1A、PTCH1、GRAMD3等基因；hsa-mir-1180調(diào)控SCN5A、ISOC2等基因。而下調(diào)表達(dá)的hsa-mir-622調(diào)控G3BP1、CELF2等基因；hsa-mir-202-3p調(diào)控TFAP2B、CLCN5等基因。見(jiàn)表2。

表2　差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因

2.3差異表達(dá)miRNA靶基因的生物學(xué)功能分析

為進(jìn)一步研究差異表達(dá)miRNA所涉及的生物學(xué)功能，本研究對(duì)預(yù)測(cè)到的miRNA靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，間接揭示差異表達(dá)miRNA所參與的生物學(xué)功能。

在上調(diào)miRNA靶基因富集的GO功能中，DNA轉(zhuǎn)錄、多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、核染色質(zhì)修飾、代謝過(guò)程和細(xì)胞周期等功能被富集到。其中DNA轉(zhuǎn)錄、多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、核染色質(zhì)修飾與代謝過(guò)程功能也被下調(diào)miRNA靶基因富集到，另外，下調(diào)miRNA靶基因還富集在血液凝固等GO功能上。見(jiàn)表3。

在上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA靶基因富集的顯著通路中，有很多通路是一樣的，比如Wnt信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路、黏著斑等。見(jiàn)表4。

表3　miRNA靶基因富集到的排名前10的GO功能 （按P值由小到大）

續(xù)表3

表4　miRNA靶基因富集到的排名前10的KEGG通路 （按P值由小到大）

3　討論

在腫瘤中，細(xì)胞快速增殖，但新生血管的生成速度相對(duì)較慢，來(lái)不及為實(shí)體瘤內(nèi)部和腫瘤周圍細(xì)胞供應(yīng)血氧，所以這些細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生缺氧狀態(tài)。有研究表明，幾乎所有的實(shí)體瘤中都存在缺氧細(xì)胞[6]。缺氧對(duì)于腫瘤的發(fā)展具有十分重要的意義[7]。①缺氧會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者壞死；②缺氧會(huì)激活與細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)合成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而減緩增殖速度，增加無(wú)氧糖酵解，使細(xì)胞能適應(yīng)缺氧環(huán)境，抑制細(xì)胞的凋亡；③缺氧可以刺激肺癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)移植瘤中新血管的生成，提高腫瘤的生長(zhǎng)能力；④缺氧還會(huì)刺激缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)，激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路[8]。

本研究利用miRNA芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法，分析缺氧對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜的影響，并預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因，分析靶基因所參與的生物學(xué)功能和通路。

本研究共篩選出14個(gè)在缺氧A549細(xì)胞和正常A549細(xì)胞之間差異表達(dá)的miRNA，包括9個(gè)在缺氧組中上調(diào)的miRNA和5個(gè)下調(diào)的miRNA。在上調(diào)表達(dá)的miRNA中，hsa-miR-769-5p調(diào)控ARID1A 和SMAD2等基因。ARID1A基因編碼SWI/SNF家族蛋白，該蛋白具有解旋酶和腺苷三磷酸酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，ARID1A被富集到染色質(zhì)修飾功能上。有研究報(bào)道，ARID1A可以通過(guò)改變核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄[9]。有研究報(bào)道稱，SWI/SNF家族蛋白可以結(jié)合到缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的啟動(dòng)子上，通過(guò)HIF-1α的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞缺氧應(yīng)答[10]。目前，還沒(méi)有研究報(bào)道ARID1A基因與缺氧肺癌的關(guān)系。筆者推測(cè)，ARID1A可能是通過(guò)其染色質(zhì)修飾功能來(lái)調(diào)節(jié)某些與缺氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而對(duì)肺腺癌細(xì)胞的缺氧應(yīng)答產(chǎn)生影響。

SMAD2基因編碼的蛋白是信號(hào)傳感器和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路。在本研究中，SMAD2被富集在Wnt信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路上。已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt信號(hào)與缺氧之間的關(guān)系，例如，Wnt信號(hào)通路中的β-連環(huán)蛋白可以與缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α相互作用，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)能力[11]。HIF-1α可以通過(guò)抑制β-連環(huán)蛋白的活性來(lái)阻礙Wnt信號(hào)通路，該機(jī)制可能與缺氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制有關(guān)[12]。上述研究表明，Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞缺氧應(yīng)答過(guò)程中具有非常重要的作用。另外，目前也有很多關(guān)于缺氧與TGF-β信號(hào)關(guān)系的研究報(bào)道，例如缺氧（1%O2）可以誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)和SMAD2磷酸化，激活肝星狀細(xì)胞的活性[13]。TGF-β信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的新生小鼠肺血管重建過(guò)程[14]。上述研究結(jié)果顯示，TGF-β信號(hào)通路與缺氧關(guān)系密切。缺氧會(huì)誘導(dǎo)SMAD2蛋白的磷酸化，這是細(xì)胞缺氧應(yīng)答過(guò)程中一個(gè)十分重要的機(jī)制[15-16]。但目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道hsa-miR-769-5p與缺氧的關(guān)系。筆者推測(cè)，hsa-miR-769-5p可能通過(guò)調(diào)節(jié)ARID1A和SMAD2等基因的表達(dá)，間接調(diào)控Wnt信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路，從而在肺腺癌細(xì)胞的缺氧應(yīng)答中發(fā)揮重要功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA靶基因富集的GO功能和KEGG通路中，有些功能和通路是一樣的，例如在GO功能富集結(jié)果中，DNA轉(zhuǎn)錄、多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、核染色質(zhì)修飾與代謝過(guò)程等功能均被上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的靶基因富集到。該研究結(jié)果表明，在肺腺癌細(xì)胞的缺氧應(yīng)答中，該功能可能受上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的共同調(diào)控。在KEGG通路富集結(jié)果中，Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和黏著斑等通路均被上調(diào)miRNA和下調(diào)miRNA的靶基因富集到。心肌缺氧導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH降低，促進(jìn)P38 MAPK的磷酸化，從而激活該信號(hào)通路，而抑制該通路則會(huì)使心肌細(xì)胞免于缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[17]。還有研究報(bào)道，缺氧可以激活MAPK信號(hào)通路[18]。另外，缺氧也會(huì)激活黏著斑激酶的活性和亞細(xì)胞遷移，促進(jìn)黏著斑蛋白的磷酸化[19]。

綜上所述，本研究利用miRNA芯片技術(shù)和相關(guān)生物信息學(xué)分析手段，在經(jīng)缺氧處理的人肺腺癌A549細(xì)胞中篩選出14個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括9個(gè)上調(diào)miRNA和5個(gè)下調(diào)miRNA。而且差異表達(dá)的miRNA及其靶基因可能在肺腺癌A549細(xì)胞的缺氧反應(yīng)中具有十分重要的功能。另外，靶基因參與的一些生物學(xué)功能以及一些通路功能可能在肺腺癌細(xì)胞的缺氧反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。該miRNA和靶基因的表達(dá)水平變化，以及對(duì)肺腺癌細(xì)胞的一些功能影響還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果為深入探索缺氧對(duì)肺癌細(xì)胞在分子層面的影響提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床治療肺癌提供一些潛在藥物靶點(diǎn)。

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（童穎丹編輯）

中圖分類號(hào)：R 734.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.007

文章編號(hào)：1005-8982（2016）13-0037-06

收稿日期：2015-12-21

*基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)然基金（No：D201230）

[通信作者]鮑永霞，E-mail：baoyongxia@126.com；Tel：13936196255

MicroRNA gene chip analysis of human lung adenocarcinoma A549 cells in anoxic microenvironment*

Ying Geng1，Yong-xia Bao1，Jing-bin Xiao2，Dong-jie Ge3，Zheng Liang1
（1.Department of Respiratory Diseases，the Second Affiliated Hospital，Harbin Medical University，Harbin，Heilongjiang 150081，China；2.Director Healthcare Room，the Military Region Hospital of Heilongjiang Province，Harbin，Heilongjiang 150009，China；3.Department of Respiratory Diseases，the First Hospital of Harbin，Harbin，Heilongjiang 150010，China）

Abstract:Objective To analyze the effect of hypoxia on miRNA expression in lung adenocarcinoma A549 cells.Methods Based on miRNA chip technology and bioinformatic analysis methods，differential expression of miRNAs between hypoxia-treated A549 cells and normoxia-treated A549 cells were identified，and their target genes were predicted.Besides，biological functions and pathways of target genes were analyzed. Results In total，14 differentially-expressed miRNAs were screened，including 9 upregulated miRNAs and 5 downregulated miRNAs in the hypoxia-treated A549 cells.Target genes of both upregulated and downregulated miRNAs were enriched in GO terms，such as DNA transcription，chromatin modification，as well as a set of pathways，such as Wnt signaling，TGF-beta signaling and MAPK signaling.Conclusions In the hypoxic A549 cells，miRNA expressions have significantly changed.A series of differentially-expressed miRNAs regulate certain genes.

Keywords:lung adenocarcinoma；A549 cell；chip；hypoxia；differentially-expressed microRNA