PKH67示蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至損傷脊髓的實驗研究

馬嬌 張雪梅 孫楊 俞冰倩

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PKH67示蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至損傷脊髓的實驗研究

馬嬌 張雪梅 孫楊 俞冰倩

目的 探討SCI后體外移植PKH67標(biāo)記的BMSCs遷移至脊髓損傷處并進行增值和分化的動員情況。方法 用梯度離心法分離和培養(yǎng)出SD 大鼠第3代BMSCs，用綠色熒光染料PKH67標(biāo)記；采用鉗夾法制備脊髓損傷(SCI)模型，分為實驗組(n=15)、對照組(n=16)、假手術(shù)組(n=16)；SCI術(shù)后對脊髓損傷組織進行HE染色,實驗組和假手術(shù)組于術(shù)后尾靜脈移植含有1×107個BMSCs的0.5 mL生理鹽水，對照組注射等量生理鹽水；分別于術(shù)后1、7、14、21 d觀察大鼠后肢運動功能恢復(fù)情況，并做BBB分；術(shù)后21 d后取脊髓組織，行免疫熒光染色，觀察BMSCs的遷移，增值和分化情況。結(jié)果 (1)鏡下可見損傷脊髓形成的空洞、壞死及炎性細(xì)胞的增多；(2)共聚焦熒光顯微鏡觀察顯示術(shù)后21 d實驗組脊髓損傷部位可見移植的BMSCs， 部分BMSCs呈GFAP和Nestin陽性表達；假手術(shù)組無 PKH67標(biāo)記的BMSCs；實驗組GFAP和Nestin陽性細(xì)胞數(shù)較對照組和假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，對照組較假手術(shù)組增加不明顯(P>0.05)；(3)實驗組和對照組BBB評分均有增加，但實驗組BBB評分顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 PKH67示蹤的BMSCs可遷移至損傷脊髓部位，進行增值并分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，促進損傷脊髓的神經(jīng)功能恢復(fù)。

PKH67 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 脊髓損傷 增值

隨著工礦事業(yè)和現(xiàn)代交通事業(yè)的發(fā)展，脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的發(fā)病率近幾年在不斷上升，SCI是以損傷平面以下感覺、運動神經(jīng)系統(tǒng)功能喪失的中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重疾病。雖然現(xiàn)在有類固醇類、金屬蛋白酶抑制劑、蛋白激酶抑制劑和再生技術(shù)等多種方法來改善SCI患者的癥狀，但是效果都很有限[1～2]。近年隨著生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞移植已經(jīng)成為一種有效的治療手段[3]。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mensenchymal stem cells,BMSCs)因為其具有易于提取和培養(yǎng)、多向分化、低免疫原性等能力已經(jīng)成為眾多學(xué)者的研究方向[4～5]，并且已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療SCI[6]。但目前仍存在許多問題需要解決，其中主要問題之一就是移植細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、增值和分化情況。為了追蹤并觀察移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的存活、遷移和分化情況就必須對移植細(xì)胞加以標(biāo)記，以便識別和監(jiān)測。目前，已經(jīng)有研究者用PKH26及基因轉(zhuǎn)染的方法標(biāo)記[7～9]，而用綠色熒光染料PKH67標(biāo)記BMSCs的研究卻鮮有報道。本實驗采用綠色熒光染料PKH67標(biāo)記BMSCs，探討SCI后體外移植PKH67標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移至損傷處并進行增值和分化的動員情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

成年雌性SD大鼠47只，體重200～220 g；1月齡雄性SD鼠8只，體重40～60 g；均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號為SCXK- (黑) 2013-001，實驗中對動物處置均符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2016年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[10]，獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn) (審查編號為HMUIRB20150029)。主要試劑與儀器：PKH67試劑盒(PKH67染料1瓶，0.1 mL，稀釋液C 1瓶，10 mL，Sigma公司)；DMEM/F12(Hyclone公司)；胎牛血清(ScienCell公司)；淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋)；兔單克隆抗體GFAP，小鼠單克隆抗體Nestin(Abcam公司)；FV-1000共聚焦熒光顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的制備及培養(yǎng) 取8只1月齡雄性SD大鼠,10%水合氯醛腹腔注射麻醉，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇全身浸泡消毒10 min；無菌環(huán)境中取股骨及脛骨，PBS浸泡；在超凈臺中用無菌器械剝?nèi)ゼ∪饨M織，剪掉股骨及脛骨的骨骺端，用5.0 mL滅菌注射器抽取4.0 mL DMEM-F12培養(yǎng)基，沖出骨髓，反復(fù)吹打，收入無菌離心管中。向骨髓細(xì)胞懸液中緩緩加入與之相等的淋巴細(xì)胞分離液，2500 r/min,離心30 min；取出離心管可見液體分4層(圖1)，用無菌吸管吸取第2層(從上向下數(shù))雨霧狀液體，移入另一離心管中，用5.0 mL DMEM培養(yǎng)基洗滌1次，1500 r/min,離心5 min，棄上清，加入4.0 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，充分吹打混勻至單細(xì)胞懸液，接種于無菌透氣培養(yǎng)瓶中；置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3 d后首次換液，以后每3 d換液1次，1周后當(dāng)細(xì)胞生長融合達80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2比例進行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。

圖1 正常脊髓和損傷脊髓組織形態(tài)(HE染色×40，×100倍)

1.2.2 PKH67標(biāo)記BMSCs 首先將含2×107細(xì)胞的懸液放于離心管中，用無血清培養(yǎng)基DMEM洗1次；400 r/min離心5 min，棄去上清，使細(xì)胞團上剩余液體小于25.0 μL；染色前準(zhǔn)備2×細(xì)胞染料 (4×10-6M)用稀釋液C稀釋，即在1.0 mL稀釋液C中加4.0 μL的PKH67染料，置于離心管中，充分混勻；準(zhǔn)備2×細(xì)胞懸液即加1.0 mL稀釋液C到細(xì)胞團中，重懸細(xì)胞保證完全離散，但注意不要旋轉(zhuǎn)震蕩，不要讓細(xì)胞在稀釋液中存留太長時間；盡快加1.0 mL的2×細(xì)胞懸液到1.0 mL 2×染料懸液中，立即用吸管均勻快速混合樣品；在混勻的預(yù)定體積中最終濃度將是2×10-6M PKH67染料和1×107細(xì)胞；25 ℃孵育含有細(xì)胞和染料的懸液5 min，定期混勻；然后加入等量(2.0 mL) 的血清或其他合適的蛋白溶液(1% BSA)終止染色反應(yīng)；充分混勻，孵育1min來和過量的染料結(jié)合；25 ℃細(xì)胞離心，400 r/min，10 min，棄去上清；向離心管中加入10.0 mL完全培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞團，然后移到新試管中，25 ℃離心，400 r/min，5 min；棄去上清后用10.0 mL完全培養(yǎng)基清洗細(xì)胞團2次，確保洗掉了未結(jié)合的染料；在最后清洗后以1.0 mL生理鹽水重懸，細(xì)胞濃度為2×107個/mL。

1.2.3 大鼠SCI模型制備 47只成年雌性大鼠隨機編號，分為3組，A組為實驗組 (SCI+BMSCs移植,n=15)，B組為對照組(SCI+生理鹽水,n=16)，C組為假手術(shù)組(假手術(shù)+BMSCs移植，n=16)；術(shù)前8 h禁食、禁水，稱重后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg)，定位后沿后正中線切開3.0 cm長皮膚，鈍性分離筋膜及肌肉，充分暴露T9-T11脊椎，咬除T10及部分T9、T11棘突及椎板，不破壞硬脊膜，暴露該段脊髓組織，用動脈瘤夾夾持脊髓，時間為1 min；夾持過程中可見大鼠尾巴逐漸卷曲翹起，雙后肢出現(xiàn)抽搐，隨后尾巴及雙后肢松弛癱軟；移除動脈瘤夾后可見T9-T10 段脊髓明顯充血 (圖2)，去除殘余的肌肉組織及骨碎片，用生理鹽水沖洗傷口，后用慶大霉素沖洗，逐層縫合假手術(shù)組僅暴露出脊髓組織，不進行動脈瘤夾加持。對實驗組和假手術(shù)組大鼠尾部用碘伏消毒，1.0 mL無菌注射器吸取0.5 mL上述制備好的骨髓細(xì)胞液，緩慢經(jīng)尾靜脈注射，注射時間大于2 min，對照組注射等量生理鹽水。大鼠術(shù)中和術(shù)后期間體溫維持在37 ℃，術(shù)后每只鼠分籠飼養(yǎng)，飲用含500 g/L 慶大霉素水7 d，防止感染；每日各早晚予以人工膀胱按摩排尿1次，直至恢復(fù)自主排尿功能。

圖2 脊髓損傷前后脊髓形態(tài)

1.2.4 運動功能評價BBB評分 大鼠后肢運動功能的恢復(fù)通過BBB (Basso,Beattie,Bresnahan)評分[11]檢測,包括0～21分，0分為后肢完全癱瘓，無運動，21分為完全正常。在術(shù)后1、7、14、21 d，兩名對實驗雙盲的人員觀察大鼠后肢運動并記錄評分。

1.2.5 組織病理學(xué)檢測 造模1 d后分別取對照組和假手術(shù)組大鼠各1只，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開胸骨，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注生理鹽水2000 mL，先快后慢；直至右心耳流出清亮的液體后開始灌注4%多聚甲醛300 mL，前100 mL快灌，當(dāng)出現(xiàn)肌顫后改為慢灌，直至肝臟質(zhì)地變硬；然后將全部脊髓組織取出，進行拍照；后截取損傷部位上下各1.0 cm的脊髓組織，放置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)后固定24 h；然后將脊髓組織進行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、制成4 μm切片，每10張取1張進行HE染色；染色后顯微鏡下觀察脊髓損傷部位的組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 組織免疫熒光染色 剩余大鼠按上述方法處死，取損傷部位上下各1.0 cm的脊髓組織放置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)后固定24 h，繼續(xù)30%蔗糖脫水48 h以上；在冰凍切片機內(nèi)-24 ℃環(huán)境下進行OCT包埋，行4 μm厚度的切片；將切片在室溫25 ℃復(fù)溫30 min，浸入4 ℃預(yù)冷的丙酮固定10 min；將切片用0.01 mol/L的PBS沖洗3次，每次10 min；然后用含0.25% TritonX-100的0.01 mol/L的PBS對組織通透處理30 min，山羊血清封閉30 min；去除山羊血清后加入一抗兔抗GFAP (稀釋濃度為1∶400)、Nestin (稀釋濃度為1∶200)，放置于避光濕盒中4 ℃過夜；第2 d取出濕盒，室溫下復(fù)溫30 min，0.01 mol/L的PBS沖洗3次；加入Dylight 594山羊抗兔，抗小鼠熒光二抗，37 ℃孵育1 h；取出，0.01 mol/L的PBS沖洗3次；用DAPI染核10 min，0.01 mol/L的PBS沖洗3次，后在蒸餾水中漂洗1次；用濾紙吸除多余水分，每張組織切片加入10 μL抗熒光淬滅封片劑，進行封片；激光共聚焦顯微鏡下進行觀察PKH67，GFAP，Nestin陽性細(xì)胞分布情況，并拍照。每個組織選不連續(xù)3張切片進行染色，每張切片隨機選取6個(×40倍)視野進行計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 脊髓組織形態(tài)觀察

術(shù)后1 d光鏡下可見損傷的脊髓組織結(jié)構(gòu)被破壞，有大量炎性細(xì)胞浸潤，有較多的空腔形成，神經(jīng)細(xì)胞水腫、壞死 (圖1)。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)觀察

培養(yǎng)第3 d可見原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞呈梭形、三角形或多角形外觀，雜質(zhì)較多，換液去除未貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞后可見部分細(xì)胞形成集落；后每3～4 d換1次培養(yǎng)液，7～10 d可見細(xì)胞融合達到80%～90%，呈漩渦狀，均勻一致生長；后進行消化傳代，傳代細(xì)胞24 h后完全貼壁，生長更加迅速，4 d左右即可傳代，取第3代細(xì)胞進行染色(圖3)。

2.3 PKH67標(biāo)記陽性細(xì)胞的檢測

PKH67染料染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見BMSCs細(xì)胞膜在波長為488 nm的激發(fā)光作用下發(fā)出明亮的綠色熒光，表面細(xì)胞標(biāo)記成功(圖3)；移植21 d后在共聚焦熒光顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)，實驗組損傷脊髓組織周圍均可見到分布的綠色熒光光點，為PKH67陽性細(xì)胞(記為PKH67+)，而假手術(shù)組沒有陽性細(xì)胞。

2.4 免疫熒光染色觀察

術(shù)后21 d共聚焦熒光顯微鏡下可見實驗組脊髓損傷組織周圍GFAP陽性和Nestin陽性的PKH67標(biāo)記的BMSCs (記為GFAP+，Nestin+)，胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，胞漿呈現(xiàn)紅色熒光，胞核呈現(xiàn)藍色熒光，共合成后呈現(xiàn)黃綠色熒光(圖4)。假手術(shù)組對應(yīng)的脊髓組織周圍幾乎沒有PKH67+細(xì)胞(圖4)。 實驗組GFAP和Nestin陽性細(xì)胞數(shù)較對照組和假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)，對照組較假手術(shù)組增加不明顯(P>0.05)。

2.5 運動功能評價

SCI術(shù)后1 d假手術(shù)組大鼠四肢恢復(fù)活動，但未達正常水平，實驗組和對照組大鼠評分均為0分，BBB評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1周假手術(shù)組恢復(fù)正常，實驗組和對照組BBB評分均有增加， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后2、3周實驗組BBB評分明顯高于對照組(16.0±1.7，9.2±1.2；13.2±1.8，19.0±1.4；P<0.05)(圖5)。

3 討 論

SCI是一種嚴(yán)重并常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，它可直接導(dǎo)致神經(jīng)損傷，從而引起損傷平面以下感覺及運動功能的喪失，為患者的家庭及整個社會帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。SCI分為原發(fā)性損傷階段(物理損傷階段)和繼發(fā)性損傷階段，原發(fā)性損傷是脊髓直接受到外力后引起的組織損傷，繼發(fā)性損傷是原發(fā)性損傷后的缺血、炎癥、過氧化作用、軸突脫髓鞘、瘢痕形成等過程[12～13]。因此，治療SCI的繼發(fā)性損傷十分重要，目前臨床治療方法包括大劑量激素、手術(shù)治療減輕脊髓壓迫、物理治療及聯(lián)合治療，然而這些治療效果都比較有限[14]。近年來，干細(xì)胞移植通過減少損傷體積，減輕膠質(zhì)瘢痕形成，誘導(dǎo)軸突再生等治療SCI已經(jīng)成為一種新型治療方法[15]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞又稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是一類非造血干細(xì)胞，具有多向分化潛能，可以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等，可作為細(xì)胞治療的來源[16]。

圖3 BMSCs提取分層，形態(tài)及PKH67染色(×40倍)

圖4 移植的BMSCs在損傷脊髓組織中的檢測(×40倍)

圖5 各組BBB評分

因此，BMSCs移植已經(jīng)成為近幾年治療SCI的研究熱點，大量動物實驗和臨床前期分析證明BMSCs能夠增加動物SCI后修復(fù)。然而其治療SCI的機制十分復(fù)雜，移植細(xì)胞在體內(nèi)的遷移，增值和分化情況仍在研究中。

在目前研究中有三種主要的脊髓損傷動物模型即脊髓橫斷模型、脊髓挫傷模型和脊髓壓迫模型。本實驗采用和人類脊髓損傷發(fā)生過程最為接近的脊髓壓迫模型，通過尾靜脈移植PKH67標(biāo)記的BMSCs，來研究它對SCI的治療作用。在術(shù)后通過鏡下觀察損傷部位的脊髓組織來確定造模成功，同時通過BBB運動功能評分來評價BMSCs的治療效果。PKH67是一種通過長脂肪族末端結(jié)合細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)的綠色熒光染料，它通過細(xì)胞膜上的受體與細(xì)胞相連接，減少了染料標(biāo)記細(xì)胞轉(zhuǎn)與非標(biāo)記細(xì)胞的交換。其性質(zhì)穩(wěn)定，無細(xì)胞毒性，半衰期較長，可在488 nm的激發(fā)光作用下發(fā)出綠色熒光。本實驗可觀察到PKH67+的BMSCs在大鼠SCI模型中存活良好，并可遷移到損傷組織周圍，部分分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和類神經(jīng)元，而未損傷的脊髓組織內(nèi)幾乎沒有PKH67+的BMSCs分布。這說明損傷脊髓組織神經(jīng)元的壞死、炎癥介質(zhì)的釋放、損傷微環(huán)境的形成都可能刺激外源性移植的BMSCs遷移至損傷區(qū)域，并誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元，從而修復(fù)神經(jīng)功能的缺損。動物行為測定也發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植的大鼠運動神經(jīng)功能恢復(fù)均好于單純SCI的大鼠。

綜上本實驗可說明以下幾個問題：(1)在脊髓損傷時部分外源性移植的BMSCs可以通過血腦屏障到達損傷脊髓組織，本研究推測這可能是由于損傷區(qū)的血腦屏障開放，便于BMSCs進入脊髓組織；(2)未進入脊髓組織的BMSCs可能通過血液進入其他組織器官；(3)通過靜脈移植的BMSCs能夠遷移到損傷脊髓組織中，并分化為類神經(jīng)元，修復(fù)損傷；(4)PKH67標(biāo)記BMSCs保持了其干細(xì)胞生物學(xué)特性，是一種，安全、有效、實用的標(biāo)記方法，可用于干細(xì)胞在活體內(nèi)的示蹤。以后，可以進一步研究BMSCs除了分化為類神經(jīng)元外，是否還有通過其他作用如抑制凋亡蛋白表達、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等作用共同促進損傷脊髓的恢復(fù)，為BMSCs在未來臨床更大范圍的應(yīng)用上提供有力證據(jù)。

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(2016-04-22收稿)

Study on the utilization of PKH67 in the transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells to injured spinal cord

MaJiao,ZhangXuemei,SunYang,etal.

DepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086

Objective To investigate the utilization of PKH67 in the transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells to injured spinal cord and the migration,proliferation and differentiation of the BMSCs.Methods Density gradient centrifugation method was used for isolating the rat BMSCs and the 3rd passage of BMSCs were labeled with green fluorescent dye PKH67.SCI model was generated by using aneurysm clip to clamp the the spinal cord of the rat.There were three groups: BMSCs group,sham operation group and

control group.After SCI,the lesion of spinal cord was taken for HE，1.0×107cells labeled with PKH67 in 0.5 mL 0.9% sterile saline solution were transfused intravenously in BMSCs group and sham-operation group,the same volume of sterile saline solution were transfused in control group.The BBB scale was performed at 1 day,7 days,14 days,21 days after surgery for evaluating hind limbs movement.The migration and differentiation of BMSCs were determined by using triple immunofluorescent staining.Results (1)Syringomyelia after injury,necrosis and increased inflammatory cells could be seen under microscopy.(2)Immunofluoresence analysis were performed at 21 days post-transplantation and the transplanted BMSCs were centralized in the epicenter of injured spinal cord,part of BMSCs expressed by GFAP and Nestin.There were no PKH67+cells in sham operation group.The GFAP+and Nestin+cells in BMSCs group were significantly higher than other two groups (P<0.05),while there was no obviously difference between sham operation group and control group (P>0.05).(3)The BBB scores of BMSCs group and control group both improved,but the rats in BMSCs group improved rapidly than control group (P<0.05).Conclusion The bone marrow mesenchymal stem cells labeled with PKH67 could migrate to the lesion of spinal cord,proliferate and differentiate into neurocyte-like cells,which could promote the recovery of spinal cord’s function.

PKH67 Bone marrow mesenchymal stem cells Spinal cord injury Proliferation

于維漢院士杰出青年培養(yǎng)基金項目

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院[馬嬌 張雪梅(通信作者) 孫楊 俞冰倩]

R744

A

1007-0478(2016)06-0432-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.06.012