沙鼠腦缺血再灌注損傷后Hsp22和c-fos的表達變化

衛(wèi)杏利 胡治平

?

沙鼠腦缺血再灌注損傷后Hsp22和c-fos的表達變化

衛(wèi)杏利 胡治平

目的 探討沙鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中Hsp22和c-fos的表達變化及相應(yīng)的保護機制。方法 健康雄性蒙古沙鼠制作腦缺血再灌注模型，缺血10 min，再灌注6 h、1、3、7 d。采用HE染色、免疫組織化學(xué)染色法觀察腦組織的病理變化，Hsp22和c-fos的表達情況。結(jié)果 (1)HE染色：腦缺血再灌注組根據(jù)時間點的不同可見膠質(zhì)細胞增生、肥大,細胞間質(zhì)和細胞水腫，神經(jīng)元壞死；(2)免疫組化:缺血再灌注損傷后Hsp22的表達上調(diào)，于第3 d達到高峰，與對照組比較有顯著差異(p<0.05)，第7 d開始下降但仍高于正常組和假手術(shù)組；c-fos在腦缺血再灌注后表達明顯增高，于第1 d達到高峰，與對照組比較有顯著差異(p<0.05)，隨后逐漸減少。結(jié)論 沙鼠腦缺血再灌注后腦組織Hsp22及c-fos表達上調(diào)，推測Hsp22可能通過抑制c-fos的活性而起到凋亡負性調(diào)節(jié)的作用。

腦缺血再灌注 Hsp22 c-fos 蒙古沙鼠

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)是從細菌到哺乳動物中廣泛存在一類熱應(yīng)急蛋白質(zhì)。腦組織缺血再灌注后會出現(xiàn)熱休克蛋白等基因表達的動態(tài)變化，進而發(fā)揮相應(yīng)的功能。人類的Hsp22屬于sHsp亞家族成員，關(guān)于Hsp22對缺血性心肌的保護作用已經(jīng)有較多的報道，Hsp22對缺血后腦組織的保護機制還不清楚。c-fos基因是參與細胞最早功能活動的基因，被認為是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)最有代表性的即刻早期基因[1]。c-fos過度表達與神經(jīng)元凋亡有必然聯(lián)系，且參與細胞凋亡過程，但其具體機制尚未完全明了。Hsp22在腦缺血組織中與c-fos的表達關(guān)系尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性蒙古沙鼠30只，9月齡，體重(90±10)克，由浙江省醫(yī)科院動物實驗室提供。隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注組。正常對照組,n=5，不予任何處理即斷頭處死沙鼠;假手術(shù)組,n=5，分離雙側(cè)頸總動脈,不予夾閉,處死;缺血再灌注組(I/R)，n=20,分為I/R后6 h(I/R6h組)、1(I/R1d組)、3(I/R3d組)及7 d(I/R7d組)4組,每組n=5。

1.2 腦缺血再灌注動物模型的建立[2]將健康雄性蒙古沙鼠用3%戊巴比妥以30 mg/kg體重的劑量腹腔注射進行麻醉，固定沙鼠，消毒，頸正中切開皮膚1.5 cm，鈍性分離皮下組織，分離暴露雙側(cè)頸總動脈，微血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min后松夾再灌注恢復(fù)血流,最后縫合皮膚,消毒；并分別于再灌注6 h、1、3、7 d后斷頭處死沙鼠。

1.3 主要試劑 抗Hsp22兔多克隆抗體，抗c-fos兔多克隆抗體，SP免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 病理變化的觀察 采用相鄰切片作常規(guī)HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察腦組織的病理變化，估計缺血再灌注后不同時間的腦損傷程度。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 具體步驟:常規(guī)應(yīng)用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫蠟至水；以3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，血清封閉，滴加一抗[Hsp22兔抗鼠多克隆抗體IgG(1∶200)；c-fos兔抗鼠多克隆抗體IgG(1∶100)]，4 ℃濕盒過夜,次日PBS洗滌，再滴加生物素化抗兔IgG(二抗)，PBS洗滌，棕色DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。免疫組化對照用隨試劑提供的陽性對照片作陽性對照,陰性對照采用替代法，用PBS代替一抗，其余步驟與上述操作相同。取各組沙鼠切面水平相似的連續(xù)腦組織切片，所有切片分析均在同一強度、同一放大倍數(shù)下進行，每個指標(biāo)采用陽性細胞計數(shù)法。在40×10倍的光鏡視野下觀察免疫反應(yīng)，以細胞漿著棕褐色為陽性，每張切片隨機選取前腦皮層區(qū)域8個不重疊400倍視野分別對切片的Hsp22、c-fos免疫陽性細胞進行計數(shù)，取均數(shù)作為各時間點該指標(biāo)的陽性細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 病理觀察 正常對照組和假手術(shù)組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯的變化，隨著缺血再灌注的時間延長，可見膠質(zhì)細胞增生明顯, 神經(jīng)元壞死程度加重。

2.2 免疫組化染色 Hsp22在大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中均有表達,陽性反應(yīng)為細胞漿出現(xiàn)棕褐色細顆粒。Hsp22在正常對照組及假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細胞中呈弱陽性表達，2組之間沒有顯著性差異(p>0.05)。I/R6h組可見Hsp22表達開始明顯升高,I/R3 d達高峰，I/R7 d表達減少(表1)。

表1 各組Hsp22和c-fos表達水平比較,陽性細胞數(shù)/每400倍視野)

注：表示與假手術(shù)組、正常對照組比較，*P<0.05;與C6 h組比較，ΔP<0.05；與C1 d組比較，▲P<0.05；與C3 d組比較，#P<0.05

c-fos在大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中表達，以胞核表達為主，部分可見胞核、胞漿均有表達或胞漿表達。c-fos在正常對照組及假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細胞中呈極弱陽性表達，偶可見陽性細胞。I/R6 h組c-fos的表達開始增加，I/R1 d達高峰，I/R3 d，I/R7 d表達逐漸減少(表1)。

Hsp22和c-fos在各組沙鼠前腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)均有表達，隨著Hsp22的表達逐漸達到高峰，相應(yīng)的出現(xiàn)c-fos表達迅速下調(diào)(圖1～3)。

圖1 缺血再灌注后Hsp22和c?fos表達變化

圖2 Hsp22的免疫組化表達水平

圖3 c?fos的免疫組化表達水平

3 討 論

熱休克蛋白是組織受應(yīng)激后表達的一類蛋白，它的表達可以增強機體對有害應(yīng)激的耐受能力。根據(jù)分子量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)特點可以分為Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60和小熱休克蛋白(sHsp)。人類的Hsp22是一種分子量是21.6KDa小熱休克蛋白也被稱作HspB8、H11激酶和E2IG1，由位于12q24.23的基因編碼，屬于sHsp亞家族成員,以單體的形式存在[3]。Hsp22蛋白廣泛存在于哺乳動物的很多組織中，在肌肉、胎盤、心臟和腦組織中高度表達。Hsp22具有絲/蘇氨酸激酶活性,是一種磷蛋白。在體外Hsp22主要被蛋白激酶C和P44MAPK磷酸化。Hsp22不僅有分子伴侶的作用還有激酶活性、促凋亡或抗凋亡的作用[4]，在延長生物體的壽命、抗缺血再灌注損傷[5]、腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等很多方面發(fā)揮著重要作用。

本實驗采用沙鼠前腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)在I/R6h 和I/R1dHsp22的表達開始迅速增加，I/R3d Hsp22表達增加達到高峰，I/R7dHsp22表達減少。I/R6h到I/R3d Hsp22表達逐漸上調(diào)達到高峰，隨后下調(diào)，而病理結(jié)果顯示I/R6h到I/R7d腦組織損傷逐漸加重，可能的原因是在缺血再灌注應(yīng)激下機體產(chǎn)生大量應(yīng)激因子，上調(diào)了HSF的表達從而誘導(dǎo)了Hsp22表達增高。I/R3d后，機體對缺血性刺激可能逐漸適應(yīng)，應(yīng)激因子減少，因而導(dǎo)致Hsp22表達下調(diào)。在缺血再灌注應(yīng)激下，細胞基因水平的反應(yīng)性上調(diào)，使Hsp22的表達增強，從而發(fā)揮分子伴侶的作用和激酶的作用。Hsp22對缺血再灌注后的腦組織起到保護作用的機制可能有(1)Hsp22通過分子伴侶作用可以發(fā)現(xiàn)錯誤折疊的蛋白質(zhì)，并通過重新折疊或者降解的作用防止變異蛋白聚集，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性[6]；(2)穩(wěn)定細胞骨架，保證細胞膜的完整性。Hsp22可以保護肌動蛋白的穩(wěn)定,增加微管的完整,避免中間絲的異常聚合。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Hsp22變異時會使軸突骨架破壞和軸突運輸功能發(fā)生障礙[7]；(3)抑制細胞凋亡，挽救受損的神經(jīng)細胞。

在原癌基因家族中有一類能被第二信使所誘導(dǎo)的原癌基因，被稱為“即刻早期基因” (immediately earlygenes，IEGs)，又稱快速反應(yīng)基因。IEGs 家族中具有代表性且研究較為深入的主要是 c-fos 和 c-jun 家族，其中以 c-fos 轉(zhuǎn)錄、激活最快，活性最高。正常情況下 c-fos在神經(jīng)元中僅是低水平的表達，而在腦缺血、缺氧等病理情況下卻被快速地誘導(dǎo)高表達[8]，其產(chǎn)物Fos蛋白由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與c-jun 基因的產(chǎn)物Jun蛋白形成Fos-Jun異源二聚體，作用于DNA的特殊序列，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮第三信使的作用，進而干預(yù)細胞核的修復(fù)，導(dǎo)致細胞凋亡[9]。c-fos 表達產(chǎn)物(c-fos mRNA 和c-fos 蛋白)常作為細胞對缺血反應(yīng)的敏感標(biāo)志物，近年來其與腦外傷、癲癇、腦血管病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系研究越來越多。Zheng 等[10]運用彌漫性腦損傷模型觀察c-fos表達的變化，結(jié)果顯示腦損傷后c-fos表達即開始增加，隨后降低但與對照組比較仍維持在較高水平,說明 c-fos表達在腦損傷后隨時間發(fā)生變化。毛曉霞等[11]以四血管阻斷法建立全腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)降低c-fos與c-jun表達后凋亡神經(jīng)細胞明顯減少。這些研究提示腦損傷后抑制c-fos基因的高表達有利于減少腦卒中后神經(jīng)元的凋亡。

本實驗用沙鼠前腦腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)I/R6h c-fos的表達開始少量增加，I/R1d c-fos表達迅速增強，并且達到高峰, I/R3d和I/R7d c-fos表達逐漸下降。結(jié)合病理HE染色，缺血再灌注6h是腦缺血病變的超急性期，這時腦組織變化不明顯，腦損傷程度較輕，I/R1d腦組織輕度水腫，腦損傷程度加重，I/R3d和I/R7d腦組織損傷進一步加重。這與神經(jīng)元凋亡表達時間基本一致，因此c-fos表達變化的時間和腦損傷變化的時間也保持一致，提示c-fos參與了缺血后神經(jīng)元的損傷過程，推測腦缺血再灌注后c-fos介導(dǎo)了神經(jīng)細胞的凋亡。腦缺血再灌注后c-fos表達上調(diào)的可能機制是①興奮性氨基酸(excita-tive amino acid，EAA)所激發(fā)的[12]；②腦缺血再灌注時細胞內(nèi)Ca2+超載(Ca2+-overload)，可誘導(dǎo)c-fos表達[13]；③腦缺血再灌注時產(chǎn)生的大量氧自由基的作用；④NO能誘導(dǎo)c-fos基因表達，引起細胞的凋亡。 腦缺血再灌注時缺血腦組織的NO含量明顯升高，可達基線水平的100倍[14]?？傊?，腦缺血再灌注時興奮性氨基酸、鈣超載、自由基及NO的增多共同參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos的表達過程，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。c-fos因腦缺血再灌注在中樞神經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后其編碼產(chǎn)物Fos隨即與同時被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、編碼的c-jun核磷蛋白Jun結(jié)合形成AP-1復(fù)合物，后者有可能再通過作用并影響靶基因的轉(zhuǎn)錄而參與腦缺血再灌注后的繼發(fā)性損害，從而促進神經(jīng)細胞凋亡[15]。也就是說，c-fos是把短時外界傷害性刺激信號轉(zhuǎn)變?yōu)殚L時程病理變化的關(guān)鍵性調(diào)控因素。缺血再灌注3 d和7 d c-fos表達逐漸下降，結(jié)合病理，此刻腦組織損傷卻逐步加重。本研究推測可能原因是機體在接受缺血再灌注等應(yīng)激后啟動的自身保護性機制在逐漸加強，一些保護性因子在一定程度上抑制了c-fos的活化，抑制了c-fos基因的表達，從而抑制c-fos介導(dǎo)的凋亡。

目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于Hsp22和c-fos在腦缺血再灌注模型中的表達關(guān)系及其作用機制的報道。本研究采用沙鼠前腦缺血再灌注模型，在相同條件下同步檢測Hsp22、c-fos的表達變化，在I/R1d后隨著Hsp22的緩慢上調(diào)，c-fos開始迅速下調(diào)，提示可能由于Hsp22的腦保護作用抑制了c-fos的活性，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡，挽救受損的神經(jīng)細胞，可能的機制是：一方面，Hsp22通過抑制Ca2 +外流，減少氧自由基的生成等，抑制c-fos基因的表達，減少神經(jīng)元損傷；另一方面，Hsp22的激酶作用可以激活相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路[16]，使抗調(diào)亡蛋白Bcl-2穩(wěn)定、Bag-1上調(diào)，進而抑制c-fos 基因的表達。總之，c-fos作為第三信使進一步誘導(dǎo)相關(guān)保護基因如Hsp22等的轉(zhuǎn)錄表達，隨著Hsp22的表達增多，抑制c-fos 基因的表達，阻止細胞開始自殺途徑，最終達到對缺血再灌注腦組織的保護作用。

腦缺血-再灌注損傷的病理機制非常復(fù)雜, 涉及興奮性氨基酸毒性、細胞內(nèi)鈣負荷超載、自由基損傷、炎癥反應(yīng)及局部免疫反應(yīng)等許多方面, 其中腦缺血后腦組織局部神經(jīng)細胞過度凋亡是造成再灌注損傷的主要原因之一。Hsp22和c-fos的相互作用機制還需要進一步研究。

[1] Funahashi M,He YF,Sugimoto T,et al.Noxious tooth pulp stimulation suppresses c-fos expression in the rat hippocampal formation[J].Brain Res,1999,827(1/2):215-220.

[2] Carmichael ST.Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose[J].NeuroRx,2005,2(3):396-409.

[3] Kim MV,Seit-Nebi AS,Marston SB,et al.Some properties of human small heat shock protein Hsp22(H11 or HspB8) [J].Biochem Biophys Res Commun,2004,315(4):796 801.

[4] Sui X,Li D,Qiu H,et al.Activation of the bone morphogenetic protein receptor by H11kinase/Hsp22 promotes cardiac cell growth and survival[J].Circ Res,2009,104(7):887-895.

[5] Hollander JM,Martin JL,Belke DD,et al.Overexpression of wild-type heat shock protein 27 and a nonphosphorylatable heat shock protein 27 mutant protects against ischemia/reperfusion injury in a transgenic mouse model[J].Circulation,2004,110(23):3544-3552.

[6] Fontaine JM,Sun X,Benndorf R,et al.Interactions of HSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,337(3):1006-1011.

[7] Carra S,Sivilotti M,Chvez Zobel AT,et al.HspB8, a small heat shock protein mutated in human neuromuscular disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells[J].Hum Mol Genet,2005,14(12):1659-1669.

[8] Rau SW,Dubal DB,B ttner M,et al.Estradiol differentially regulates c-Fos after focal cerebral ischemia[J].J Neurosci,2003,23(33):10487-10494.

[9] Sch?bitz WR,Schade H,Heiland S,et al.Neuroprotection by hyperbaric oxygenation after experimental focal cerebral ischemia monitored by MRI[J].Stroke,2004,35(5):1175-1179.

[10]Zheng W,Niu L,Zhang C,et al.Brain edema and protein expression of c-Fos and c-Jun in the brain after diffused brain injury[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(6):2809-2817.

[11]毛曉霞,夏愛華,吳曉光,等.山楂葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)元凋亡和c-fos,c-jun表達的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(2):174-177.

[12]韓濟生.北京[M].北京:中國青年出版社,2011:273.

[13]Takei N,Endo Y.Ca ionophore-induced apoptosis on cultured embryonic rat cortical neurons[Z],1994:65.

[14]Malinski T,Bailey F,Zhang ZG,et al.Nitric oxide measured by a porphyrinic microsensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion[Z],1993:335.

[15]Whitfield J,Neame SJ,Paquet L,et al.Dominant-negative c-Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrome c release[J].Neuron,2001,29(3):629-643.

[16]Smith CC,Yu YX,Kulka M,et al.A novel human gene similar to the protein kinase[Z],2000.

(2016-04-15收稿 2016-05-13修回)

046000 山西省長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院老年病科(衛(wèi)杏利)；中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(胡治平)

R743

A

1007-0478(2016)06-0449-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.06.016