異補骨脂素對氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

馮春燕，陳　　勝，胡艷紅，柯發(fā)杰，胡　　俊，黃秀榕，祁明信（.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；.福建中醫(yī)藥大學病理生理研究中心，福建 福州 350）

異補骨脂素對氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

馮春燕1，陳勝1，胡艷紅1，柯發(fā)杰1，胡俊1，黃秀榕2，祁明信1
（1.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；
2.福建中醫(yī)藥大學病理生理研究中心，福建 福州 350122）

目的觀察異補骨脂素對氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響。方法實驗分正常對照組、H2O2組、E2組、ISR組，密度梯度離心法分離出HLEC線粒體，透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果正常對照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體幾乎未受損傷；H2O2組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂消失，線粒體受損傷；E2組、ISR組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)稍完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好。結(jié)論異補骨脂素對H2O2誘導氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)有保護作用。

異補骨脂素；氧化損傷；人晶狀體上皮細胞；線粒體

異補骨脂素（isopsoralen，ISR）是從補骨脂中提取的有效單體，我們課題組前期研究［1-4］發(fā)現(xiàn)ISR和雌二醇（β-Estradiol，E2）一樣具有雌激素作用，能夠增強抗氧化能力，提高人晶狀體上皮細胞（human lens epithelia cell，HLEC）內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；提高 HLEC內(nèi) SOD mRNA、GSH-px mRNA、CAT mRNA的表達，減輕HLEC氧化損傷，對H2O2誘導氧化損傷的HLEC發(fā)揮保護作用。本實驗進一步分離HLEC線粒體，用透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)，探討ISR保護氧化損傷的HLEC亞細胞水平的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1材料與方法

1.1材料3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1mol/L磷酸緩沖液、1%鋨酸亞鐵-1.5%氰化鉀混合液、醋酸鈾、檸檬酸鉛、MTT干粉（美國Sigma公司）；Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells（鷺隆生物科技有限公司）；異補骨脂素（中國藥品生物制品檢定所，純度99.5%）；E2（美國Sigma公司，純度97%）；二甲基亞砜（美國Amresco公司）；乙二胺四乙酸（美國Augus公司）；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基干粉（美國Gibco公司）；新生小牛血清 （奧地利Paa公司），H-7650電子顯微鏡（日本日立公司）；UC-6超薄切片機（美國LaiCa公司）；常溫離心機、低溫離心機（德國Heraeus Inc.公司）；-80℃低溫冰箱（英國New Brunswick Scientific Inc.公司）；IMT-413倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國Forma公司）；超凈工作臺（江蘇SW-CJ-IF）。

1.2HLEC培養(yǎng)及傳代采用永生化人晶狀體上皮細胞系HLE-B3。取出凍存管中的HLE-B3立即放入37℃水中，將溶解的細胞懸液用10倍體積以上的培養(yǎng)液進行稀釋，離心，去上清，反復洗滌3次。以5×105個/mL接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞生長融合后，進行傳代培養(yǎng)用于實驗。

1.3實驗分組① 正常組：HLEC加 DMEM培養(yǎng)液；② H2O2組：正常組加H2O2（終濃度300 μmol/ L）；③ E2組：H2O2組加E2（終濃度10-2μmol/L）；④ISR組：H2O2組加ISR（終濃度10 μmol/L）。

1.4細胞線粒體分離①收集2×107細胞于2 mL微量離心管，離心850×g，2 min，棄上清；② 加800 μL線粒體分離試劑A于離心管，以中等速度漩渦5 s，冰上孵育2 min；③ 將細胞懸液轉(zhuǎn)于冰冷的杜恩斯組織研磨器，充分勻漿細胞；④ 將勻漿液移到原離心管中，加800 μL線粒體分離試劑C，200 μL線粒體分離試劑A，混勻，離心700×g，10 min，4℃；⑤ 轉(zhuǎn)上清液于一新離心管，離心3 000× g，15 min，4℃；⑥轉(zhuǎn)上清液于一新離心管，加500 μL線粒體分離試劑C，離心12 000×g，5 min，4℃棄上清，所得沉淀即為線粒體。

1.5透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)① 前固定：分離出的HLEC線粒體以3%戊二醛-1.5%多聚甲醛混合液-0.1M PBS（pH 7.2）4℃過夜；② 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；③后固定：1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀4℃ 1.5 h；④ 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；⑤ 脫水：50%酒精10 min→70%酒精飽和醋酸鈾染液4℃過夜→90%酒精10 min→90%酒精-丙酮10 min→90%丙酮10 min→無水丙酮10 min×3次；⑥ 浸透：無水丙酮+環(huán)氧樹脂618包埋劑（1∶1）1.5 h，純618包埋劑 35℃3 h；⑦ 包埋、聚合：35℃12 h、45℃ 12 h、60℃ 3 d；⑧切片、染色：超薄切片機切70～80 nm的超薄切片；經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min，并蒸餾水水洗；⑨ 透射電鏡下觀察并攝片。

2結(jié)果

2.1線粒體分離純化質(zhì)量鑒定各組HLEC線粒體電鏡觀察顯示：線粒體聚集，其它細胞結(jié)構(gòu)基本未見，說明線粒體分離純化良好。

2.2ISR對氧化損傷的HLEC內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響① 正常對照組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體幾乎未受損傷，見圖1。②H2O2組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂消失，線粒體受損傷，見圖2。③E2組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)稍完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好，見圖3。④ ISR組：線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)稍完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好，見圖4。

3討論

3.1文獻［5］表明，白內(nèi)障的發(fā)病率呈男女性別差異，女性高于男性，且絕經(jīng)后表現(xiàn)更為明顯。Krishnaiah等［6］發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后接受激素替代治療的女性白內(nèi)障患病率明顯低于未使用者及同齡男性，激素替代治療對皮質(zhì)性、核性、后囊下性白內(nèi)障有保護作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障的發(fā)生與缺乏雌激素的保護有關［8］，雌激素能夠減輕晶狀體氧化損傷程度［9-10］，抑制HLEC凋亡，在白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程中起一定的作用。

3.2ISR是從補骨脂中提取的有效單體，我們前期研究發(fā)現(xiàn)ISR和E2發(fā)揮相同的作用，具有雌激素樣活性，能夠增強抗氧化能力，提高HLEC內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-px、CAT活性，提高HLEC內(nèi)的SODmRNA、GSH-pxmRNA、CATmRNA的表達，減輕HLEC氧化損傷，從而對氧化損傷的HLEC發(fā)揮保護作用。線粒體是一種真核細胞中普遍存在的細胞器，是細胞內(nèi)氧化磷酸化及形成ATP的主要場所，故有細胞“動力工廠”之稱。目前純化線粒體的方法主要是差速離心結(jié)合密度梯度離心。密度梯度介質(zhì)一般采用Percoll密度梯度和蔗糖密度梯度，提取的線粒體都需要進行純度評價。純度評價一般從3個方面進行：形態(tài)學觀察、特異酶活性測定、特異抗體檢測，形態(tài)學觀察一般采用透射電鏡來進行。本實驗通過密度梯度離心法分離出HLEC線粒體，并通

過透射電鏡鑒定，發(fā)現(xiàn)各組線粒體聚集，其它細胞結(jié)構(gòu)基本未見，分離純化良好?？梢娒芏忍荻入x心法是分離出HLEC線粒體的有效方法。

3.3實驗結(jié)果示：正常對照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體幾乎未受損傷。經(jīng)H2O2誘導氧化損傷后，HLEC的線粒體形態(tài)發(fā)生改變，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，嵴結(jié)構(gòu)斷裂消失；E2在保護 H2O2誘導氧化損傷 HLEC的同時，也保護了HLEC線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。ISR和E2一樣在保護H2O2誘導氧化損傷HLEC的同時，也保護了HLEC線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，說明ISR對H2O2誘導氧化損傷的HLEC線粒體超微結(jié)構(gòu)有保護作用。

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R776

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1000-338X（2016）03-0018-02

2016-03-02

福建省自然科學基金資助課題（2014J05093），福建省創(chuàng)新課題（2014-CXB-21）

馮春燕（1979—），女，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師，主要從事白內(nèi)障的基礎與臨床研究。

祁明信（1945—），男，教授，主任醫(yī)師。E-mail：qihuang@ netease.com