銅納米簇的合成與應(yīng)用研究

李　婷，李盼盼，肖　慧，楊　嬋，黃思穎，何婧琳，曹　忠（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，微納生物傳感與食品安全檢測(cè)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410114）

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銅納米簇的合成與應(yīng)用研究

李婷，李盼盼，肖慧，楊嬋，黃思穎，何婧琳*，曹忠*
（長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，微納生物傳感與食品安全檢測(cè)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙410114）

摘要：貴金屬納米簇一般由幾個(gè)到約一百個(gè)金屬原子組成，具有超小粒徑、生物相容性、低毒性以及獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，近年來備受人們的關(guān)注，相比較于金納米簇和銀納米簇，銅納米簇的研究仍處于初始階段。該文介紹了銅納米簇的光學(xué)性質(zhì)、合成方法和應(yīng)用進(jìn)展，重點(diǎn)總結(jié)了合成銅納米簇的模板法、化學(xué)還原法、反相微乳液法、刻蝕法等，評(píng)述了銅納米簇用于重金屬離子、pH、小分子、生物分子等的熒光檢測(cè)應(yīng)用及其在生物標(biāo)記、生物成像上的分析應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：銅納米簇；熒光傳感；分析應(yīng)用；評(píng)述

0　引言

近年來，貴金屬納米簇（nanoclusters，NCs）在納米科學(xué)和納米技術(shù)等諸多領(lǐng)域中逐漸成為一種應(yīng)用廣泛的納米材料。貴金屬納米簇通常由幾個(gè)到約百個(gè)原子組成，其大小介于單個(gè)原子和納米晶體之間，核簇直徑小于2 nm，當(dāng)金屬納米顆粒粒徑減小到接近電子的德布羅意波長時(shí)，納米粒子的等離子體共振效應(yīng)消失，能級(jí)譜帶變得不連續(xù)，形成類分子的分裂能級(jí)［1］，電子可在各能級(jí)之間躍遷，發(fā)射出具有尺寸依賴性的熒光，它的熒光發(fā)射光譜可在近紅外到可見光區(qū)內(nèi)可調(diào)，具有優(yōu)良的熒光特性。由于金屬原子的自由電子被限制，電子的集體震蕩被阻礙，具有區(qū)別于大顆粒金屬納米粒子和塊狀金屬的特殊性質(zhì)，如強(qiáng)光致發(fā)光性、良好的耐光性、生物相容性、超小尺寸等。這些獨(dú)特的性質(zhì)使得貴金屬納米簇成為構(gòu)建熒光傳感平臺(tái)的理想納米材料，在疾病診斷與檢測(cè)、細(xì)胞成像、生物示蹤、環(huán)境檢測(cè)、生物傳感等方面具有廣闊的發(fā)展前景［2-3］。目前，已報(bào)道的貴金屬納米簇有AuNCs、AgNCs、CuNCs等［4-5］，相比于AuNCs和AgNCs，CuNC的報(bào)道較少。Cu的價(jià)格比Au和Ag便宜，具有與Au和Ag相似的性能，合成CuNCs的前體更容易從市場上購買到，CuNCs的研究已引起人們的廣泛興趣。

該文介紹了銅納米簇的光學(xué)性質(zhì)、合成方法和應(yīng)用進(jìn)展，總結(jié)了銅納米簇的合成方法，主要有模板合成法、化學(xué)還原法、反相微乳液法、刻蝕法。銅納米簇用于熒光檢測(cè)重金屬離子、pH、小分子、生物分子等方面的情況及其在生物標(biāo)記、生物成像上的應(yīng)用。

1　銅納米簇的光學(xué)性質(zhì)

1.1熒光性質(zhì)

熒光，是銅納米簇的重要性質(zhì)之一。近年來，科研工作者一直致力于制備各種水溶性的銅納米簇，其發(fā)射光可從紅到藍(lán)。銅納米簇的發(fā)光一般歸因于電子占據(jù)d能帶與德布羅意波長以上能級(jí)之間的電子轉(zhuǎn)移，如sp能帶；或者是最高占據(jù)分子軌道HOMO與最低占據(jù)分子軌道LUMO能隙間的電子躍遷［6］。

1.2雙光子吸收性質(zhì)

雙光子吸收（TPA）是指物質(zhì)的一個(gè)分子同時(shí)吸收兩個(gè)相同或不同頻率的光子的過程，將分子從基態(tài)激發(fā)至高能態(tài)，目前只能在強(qiáng)激光作用下發(fā)生，是一種強(qiáng)激光下光與物質(zhì)相互作用的現(xiàn)象。與單光子激發(fā)相比，雙光子激發(fā)表現(xiàn)出諸多優(yōu)勢(shì)，它可以有效增加組織穿透深度，大大提高空間分辨率，最大限度地降低了背景熒光，尤其適合生物體內(nèi)成像和光動(dòng)力學(xué)治療。Wang等［7］運(yùn)用雙官能化多肽作為穩(wěn)定劑和還原劑，制備了以多肽為模板的Cu14納米簇，在飛秒激光激發(fā)下，發(fā)射出藍(lán)色雙光子熒光，此熒光探針能夠用來標(biāo)記HeLa和A549細(xì)胞。

1.3聚集誘導(dǎo)發(fā)光

聚集誘導(dǎo)發(fā)光是指一類在溶液中不發(fā)光的分子在聚集狀態(tài)下發(fā)光的現(xiàn)象，這種有趣的現(xiàn)象多見于某些有機(jī)分子，而罕見于熒光納米簇。一般熒光分子在稀溶液中熒光強(qiáng)度較大，而在聚集狀態(tài)或者固態(tài)時(shí)，熒光強(qiáng)度由于熒光分子間的相

互作用產(chǎn)生大量非輻射失活降低，而聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子，因其特殊的分子結(jié)構(gòu)，分子堆疊方式也因之不同［8］，在某種程度上減小了分子間的相互作用，也限制了分子在聚集態(tài)的內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，較好的抑制了非輻射失活過程，最終導(dǎo)致聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子在聚集狀態(tài)下熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于在稀溶液中的熒光強(qiáng)度。Li等［9］發(fā)現(xiàn)了S2-能聚集誘導(dǎo)發(fā)光以半胱氨酸為配體的銅納米簇，Li等［10］發(fā)現(xiàn)了以D-青霉胺為配體的銅納米簇也有聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象。

2　銅納米簇的合成

目前，金屬納米簇的制備方法大致分為二種［3］（如圖1所示），其一是自下而上法，通常在溶液中進(jìn)行，以量子點(diǎn)或金屬離子為前驅(qū)體，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件獲得不同性質(zhì)和粒徑的金屬納米簇，反應(yīng)條件如可以選擇不同類型的配體，不同種類的還原劑，適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和pH值，適當(dāng)?shù)呐潴w與金屬鹽的摩爾比等。適宜的反應(yīng)條件對(duì)金屬納米簇的合成至關(guān)重要，用于還原金屬離子的常見還原劑有抗壞血酸鈉、硼氫化鈉、水合肼、四羥甲基氯化膦（THPC）等。用于支架金屬納米簇的常見配體有多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、寡聚核苷酸DNA、聚合物、巰基化合物等。自下而上的合成方法一般可分為模板合成法、光致還原法、超聲化學(xué)合成、固相合成、微乳技術(shù)、微波合成、電化學(xué)合成、輻射分解和Brust-Schiffrin法等。其二是自上而下法，即刻蝕法，主要基于配體與金屬原子間強(qiáng)相互作用，利用配體誘導(dǎo)刻蝕，使得大顆粒納米粒子破碎溶解，從而粒徑變小，得到金屬納米簇。已被用于刻蝕劑的配體主要有巰基乙醇，谷胱氨酸、牛血清蛋白、巰基丁二酸（MSA）、PEI。自上而下刻蝕法，提供了一種可選擇性分散粒徑制備金屬納米簇的簡便合成方法。

納米顆粒的制備歷史悠久［11］，銅納米顆粒的常用制備方法有液相還原法、機(jī)械化學(xué)法、等離子體法、氣相蒸發(fā)法等。經(jīng)以上方法合成的銅納米顆粒分散性差，在空氣中容易被氧化，其比表面積大，化學(xué)活性高，很難制備極小的納米顆粒，從一定程度限制了銅納米顆粒的進(jìn)一步應(yīng)用發(fā)展。而銅納米簇彌補(bǔ)了這些不足，不同于金納米簇和銀納米簇，銅納米簇的研究和應(yīng)用近幾年才逐漸引起科研工作者的關(guān)注，合成銅納米簇的主要方法是模板合成法。一般情形下，銅離子在水溶液中還原，由于銅納米簇容易聚集成團(tuán)，得到的是銅納米顆粒，因此需要加入配體保護(hù)銅納米簇防止其團(tuán)聚。包裹在銅納米簇表面的配體對(duì)其熒光性質(zhì)起著重要的作用，而銅納米簇的熒光性質(zhì)直接影響應(yīng)用，配體與銅納米簇應(yīng)有很強(qiáng)的相互作用，可采用光照，微波，強(qiáng)還原劑等延長其老化時(shí)間、提高其量子產(chǎn)率等。配體可潛在改變納米簇的電子結(jié)構(gòu)，影響其幾何尺寸，因此，選擇合適的配體類型對(duì)合成高熒光產(chǎn)率的銅納米簇尤為重要。目前用于穩(wěn)定銅納米簇的常見配體主要有：多肽和蛋白質(zhì)、寡核苷酸DNA、聚合物、巰基化合物等。該文將詳細(xì)介紹銅納米簇的合成方法。

圖1　貴金屬納米簇的制備方法［3］Fig.1　Various routes for synthesis of noble metal nanoclusters［3］

2.1自下而上法

2.1.1模板合成法

模板合成法被認(rèn)為是制備金屬納米簇的高效合成方法。模板分子可提供特定的空間構(gòu)型，對(duì)形成的金屬納米簇其尺寸和形態(tài)均有可調(diào)性。模板分子主要有DNA、多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、硫醇類化合物、樹枝狀聚合物等。

2.1.1.1寡聚核苷酸（DNA）

金屬陽離子與DNA分子中堿基之間存在一定的相互作用，Rotaru等［12］成功合成了雙鏈DNA銅納米簇，并發(fā)現(xiàn)可以通過改變雙鏈DNA的堿基數(shù)目來控制熒光CuNCs的尺寸大小，銅離子對(duì)雙鏈DNA有很高的選擇性，可以用于對(duì)雙鏈DNA的檢測(cè)。隨后，Jia等［13］以DNA為模板合成銅納米簇實(shí)現(xiàn)了對(duì)單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)。 Hu［14］和Dong［15］等分別利用雙鏈DNA銅簇構(gòu)建了一種檢測(cè)核酸酶和三磷酸腺苷 （ATP）的方法。之后，Qing等［16］發(fā)現(xiàn)富含胸腺嘧啶的單鏈DNA中的胸腺嘧啶與二價(jià)銅離子有強(qiáng)相互作用，在抗壞血酸還原劑作用下形成Cu0聚集在聚T單鏈DNA上，成功合成發(fā)紅色熒光的銅納米簇，整個(gè)合成過程只需5 min。

2.1.1.2多肽和蛋白質(zhì)

生物大分子如多肽、蛋白質(zhì)等，其中的氨基酸能提供許多與銅的結(jié)合位點(diǎn)，從而提高銅納米簇的穩(wěn)定性。Shen等［17］報(bào)道了一種在超分子凝膠溶液中合成銅納米簇的新方法，實(shí)驗(yàn)以膽酸衍生物（BAs）為預(yù)凝膠器，BAs表面有獨(dú)特的雙親類固醇分子結(jié)構(gòu)，容易形成Cu2+-超分子凝膠復(fù)合體系，加入有巰基基團(tuán)的半胱氨酸，緩慢溶解在水凝膠中，形成半胱氨酸為模板的銅納米簇。Huang等［18］制備了一種以多肽CLEDNN為模板，合成的銅納米簇量子產(chǎn)率為7.3%，熒光強(qiáng)度隨溫度變化。Zhao等［19］用轉(zhuǎn)鐵蛋白（Trf）為模板，抗壞血酸為還原劑在室溫下一步合成了轉(zhuǎn)鐵蛋白-銅納米簇 （如圖2所示），其發(fā)射峰位置在670 nm（量子產(chǎn)率約為6.2%），Trf-CuNCs表現(xiàn)出良好的生物相容性和低毒性，可作為目標(biāo)探針用于癌細(xì)胞（Hela）的生物成像。Li等［10］利用D-青霉胺（DPA）將Cu2+還原成Cu0，形成DPA-CuNCs，引入牛血清蛋白 （BSA），BSA與DPA有強(qiáng)靜電作用，形成BSA/DPA-CuNCs，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，其熒光強(qiáng)度是DPA-CuNCs熒光強(qiáng)度的二倍。2.1.1.3硫醇類化合物、聚合物、酶類等

圖2　Trf-CuNCs的合成及用于癌細(xì)胞成像示意圖［19］Fig.2　Schematic illustration of the formation process of the transferrin-copper nanoclusters as a fluorescent probe for cancer cell.bioimaging［19］

硫醇類化合物中的巰基與Cu之間能形成Cu-S共價(jià)鍵，聚合物在水溶液中能與銅離子螯合。Wang等［20］發(fā)現(xiàn)利用谷胱甘肽（GSH）表面處理聚乙烯吡咯烷酮-銅納米簇 （PVP-CuNCs）能使PVP-CuNCs熒光大大增強(qiáng)，其熒光量子產(chǎn)率由8%顯著升高到27%。通過觀察L-半胱氨酸、半胱胺、巰基乙醇、巰基丙酸等配體表面處理PVPCuNCs，研究后發(fā)現(xiàn)PVP-CuNCs熒光增強(qiáng)是由于CuNCs與這些配體中富含電子的官能團(tuán)有強(qiáng)的作用力，經(jīng)過GSH處理過的PVP-CuNCs能以粉末狀保存，它與綠色和紅色熒光粉組合后，可制造高顯色指數(shù)的低頻白光發(fā)光二極管。Cao等［21］建立了一種以單寧酸為模板一步合成水溶性熒光銅納米簇的方法。形成的銅納米簇非常穩(wěn)定，量子產(chǎn)率達(dá)到14%，并能用于快速，高靈敏檢測(cè)血清中的Fe3+。Ghosh等［22］用溶菌酶為模板，一步合成了高量子產(chǎn)率、穩(wěn)定性好、低毒的銅納米簇（如圖3所示）。采用質(zhì)譜分析表明銅納米簇種類從Cu2-Cu9，經(jīng)過透射電鏡表征發(fā)現(xiàn)銅納米簇平均直徑為2.3 nm，該納米簇在pH=4到pH=10的環(huán)境下穩(wěn)定。2.1.2化學(xué)還原法

圖3　溶酶菌包裹的銅納米簇合成示意圖［22］Fig.3　Reaction scheme for the synthesis of Cu NCs in the presence of lysozyme［22］

化學(xué)還原法，一般是向銅鹽中加入還原劑，使得銅離子還原成銅原子，再將銅原子聚集成銅納米簇。Wei團(tuán)隊(duì)［23］用簡單的一鍋法合成銅納米簇，Cun（n＜8）。將硝酸銅和四丁基溴化銨溶解于乙醇，在80℃下攪拌30 min后，冰水浴冷卻，依次加入2-巰基-5-n-正丙基嘧啶 （MPP）和硼氫化鈉，所得產(chǎn)物離心提純后，用電噴霧質(zhì)譜表征，銅原子個(gè)數(shù)小于八個(gè)，發(fā)射峰位置在425 nm和593 nm，且對(duì)氧氣還原過程有很好的電催化性能。Ujados等［24］用由硫辛酸和聚乙二醇短鏈構(gòu)成的雙齒配體，以硼氫化鈉為還原劑，在回流裝置中，一步合成了非極性的穩(wěn)定性極好的銅納米簇。Zheng等［25］沒有用任何的穩(wěn)定劑，直接合成銅納米簇，利用亞硝酸根離子能在CuNCs核上把Cu0氧化成Cu（Ⅰ），有效淬滅銅納米簇而檢測(cè)亞硝酸根離子，其檢測(cè)范圍為0.0125～5000 μmol/L，檢測(cè)下限為3.6 nmol/L。Bashir等［26］首次報(bào)道了一種不用惰性氣體保護(hù)的綠色化學(xué)合成以淀粉封端的棕紅色銅溶膠，采用TEM表征發(fā)現(xiàn)銅納米簇包裹在淀粉多糖螺旋腔內(nèi)，且小尺寸I2或者I3-不能取代淀粉螺旋腔內(nèi)的銅納米簇。

2.1.3反相微乳液法

反相微乳液為油包水微乳液，主要由表面活性劑、助表面活性劑、油相、水相組成的各向同性的熱穩(wěn)定體系。Vazquez等［27］用油包水微乳技術(shù)合成了不同尺寸的銅納米簇（如圖4所示），該微乳系統(tǒng)是由環(huán)己烷/十二烷基硫酸鈉/異戊醇/五水硫酸銅水溶液組成，其中十二烷基硫酸鈉作為表面活性劑，異戊醇為助表面活性劑，環(huán)己烷為油相，五水硫酸銅為水相，隨著還原劑硼氫化鈉的量的不同，微乳溶液顏色首先由藍(lán)變黃，然后由淡棕變?yōu)榘底?，最后變成深黑色，?dāng)還原劑的用量小于10%的化學(xué)計(jì)量數(shù)時(shí)，能夠得到發(fā)熒光的銅納米簇，（Cun，n＜13）。該方法可通過控制原料比例來控制銅簇粒徑。

圖4　不同的還原劑比例a對(duì)應(yīng)的銅納米簇尺寸大小圖［27］Fig.4　Schematic picture of the evolution of the copper cluster size with increasing a value［27］

2.1.4其它方法

銅納米簇的合成除了以上介紹的方法外，根據(jù)反應(yīng)條件不同，還有光還原法、超聲化學(xué)合成法、微波合成法等。Gui等［28］利用多齒聚體聚丙烯酸-巰基乙胺（PAA-g-MEA）作為穩(wěn)定劑，用功率為8 W的紫外燈照射后形成發(fā)紅光的銅納米簇（如圖5所示），因焦賴氨酸二硫代氨基甲酸銨（APDC）與銅離子有強(qiáng)作用力，通過化學(xué)刻蝕后熒光猝滅，加入過量銅離子，熒光恢復(fù)，可用于檢測(cè)APDC。

Bhamore等［29］用雞蛋白為配體微波合成的銅納米簇，呈現(xiàn)很強(qiáng)的黃色熒光，且發(fā)射峰位置在600 nm，且驚奇地發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)條件下不同比例的殺菌劑福美雙和除草劑百草枯均能使銅納米簇線性猝滅，其檢測(cè)下限分別為70 nmol/L和49 nmol/L，同時(shí)，該熒光探針可以用于細(xì)菌細(xì)胞的多顏色生物成像。Vilar-Vidal等［30］以四丁胺硝酸鹽為模板利用簡單的電化學(xué)方法合成了熒光CuNCs（n＜14），銅離子由陽極電解獲得并在陰極還原形成CuNCs，這種方法合成的CuNCs保存幾年都很穩(wěn)定。Wang等［31］用谷胱甘肽作為穩(wěn)定劑和還原劑，加入銅離子，在pH=6條件下，超聲15 min即可快速得到發(fā)紅色熒光的順磁性銅納米簇。2.2“自上而下”刻蝕法

圖5　光致還原合成多齒聚體-銅納米簇的熒光開關(guān)響應(yīng)圖［28］Fig.5　Schematic representation of the photoreduction synthesis of multidentate polymers stabilized CuNCs and fuorescence“OFF–ON”response［28］

Wang等［32］利用過量的谷胱甘肽刻蝕銅納米晶體，得到了CuNCs，該刻蝕方法的途徑可能有以下二種：第一種途徑是表面刻蝕，銅原子從銅納米晶體的表面脫離，與過量的GSH形成Cu（Ⅰ）-GSH復(fù)合物，Cu（Ⅰ）-GSH通過Cu+-Cu+相互作用形成Cu2納米簇。第二種途徑是尺寸減少刻蝕，GSH分子從銅納米晶體表面奪取銅原子，使得銅納米晶體粒徑逐漸減少，最后形成Cu2納米簇。Zhong等［33］用碘離子誘導(dǎo)氧化刻蝕以聚乙烯亞胺 （PEI）為保護(hù)支架的銅納米簇，I-在PEICuNCs表面與Cu2+形成CuI化合物，導(dǎo)致CuNCs聚集增大熒光猝滅，制備了肉眼可見碘離子熒光傳感器，并應(yīng)用于尿液中碘離子的檢測(cè)，檢出限為100 nmol/L。Yuan等［34］用靜電誘導(dǎo)相轉(zhuǎn)換刻蝕金、銀、鉑、銅納米簇。

3　銅納米簇的應(yīng)用

銅納米簇由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，因其具有超小尺寸、生物相容、低毒性和熒光性質(zhì)等特點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于金屬離子、pH、小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等檢測(cè)和生物標(biāo)記成像。

3.1金屬離子的檢測(cè)

銅納米簇作為新的熒光探針已經(jīng)成功應(yīng)用于對(duì) Pb2+、Hg2+、Cu2+、Cr（Ⅵ）、Fe3+等重金屬離子的檢測(cè)，檢測(cè)機(jī)理一般是重金屬離子誘導(dǎo)銅納米簇?zé)晒舱衲芰哭D(zhuǎn)移，使得傳感體系熒光增強(qiáng)或降低。Qing等［35］發(fā)現(xiàn)聚T的單鏈DNA能作為合成銅簇的模板后，應(yīng)用其形成的銅簇在紫外燈下發(fā)紅色熒光的性質(zhì)，構(gòu)建了一種便捷、經(jīng)濟(jì)、可視化的檢測(cè)銅離子的新方法。將聚T單鏈DNA封鎖在帶狀水凝膠中，從水凝膠微孔注入銅離子后，在紫外燈下用相機(jī)記錄或者裸眼可視其紅色熒光團(tuán)簇，此方法中核酸探針無需化學(xué)標(biāo)記或修飾、檢測(cè)快速只需幾分鐘、設(shè)備簡單可以手提、且檢測(cè)在凝膠內(nèi)，有良好的抗干擾性，但該體系的檢測(cè)限為20 μmol/L。該團(tuán)隊(duì)Ou等［36］利用Pb2+易與Cu+發(fā)生嗜金屬作用，破壞聚T銅納米簇結(jié)構(gòu)使得該傳感體系熒光強(qiáng)度減弱，構(gòu)建了一種基于鉛離子猝滅銅納米簇?zé)晒忪`敏檢測(cè)鉛離子的方法，其檢測(cè)限為0.4 nmol/L。最近，Liao等［37］報(bào)道一種用牛血清蛋白和雙氧水合成的CuNCs檢測(cè)汞離子的新方法，其中H2O2能部分氧化牛血清蛋白上的二硫鍵，加入Hg2+后，由于Hg-S共價(jià)鍵比Cu-S共價(jià)鍵更容易形成，使得銅納米簇?zé)晒怙@著猝滅，該方法能快速、可靠、超靈敏檢測(cè)汞離子，檢測(cè)限為4.7 pmol/L。此外，Gui等［38］報(bào)道了以半胱氨酸為模板的銅納米簇檢測(cè)Cr（Ⅵ）。

3.2pH的檢測(cè)

銅納米簇pH傳感器一般是基于銅納米簇本身對(duì)pH有信號(hào)響應(yīng)，Liao等［39］仍然利用牛血清蛋白包裹的銅納米簇，加入雙氧水部分毀壞多肽和牛血清蛋白上的二硫鍵，使得親水基團(tuán)裸露出來，當(dāng)pH很低時(shí)，銅納米簇不斷聚集尺徑增大熒光猝滅，隨著溶液中pH的增加，溶液由藍(lán)色變成紅色，相應(yīng)的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)，在pH2～pH14范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與pH值呈良好的線性關(guān)系。Zhou等［40］首次發(fā)現(xiàn)在堿性條件下合成的發(fā)藍(lán)色熒光的半胱氨酸-銅納米簇對(duì)pH有靈敏的響應(yīng)。同樣，Qiao等［41］提出了一種基于雞蛋白-銅納米簇pH傳感方法，在pH6.14～pH12.08時(shí)，有良好的線性響應(yīng)關(guān)系。

3.3小分子物質(zhì)的檢測(cè)

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，對(duì)身體有害。Zhu等［42］開發(fā)了一種以聚T銅納米簇為熒光探針的三聚氰胺傳感器，檢測(cè)范圍0.1～6 μmol/L，檢出限為95 nmol/L，美國食品藥物管理局規(guī)定的三聚氰胺的安全限值為20 μmol/L，其檢出限比規(guī)定限值低200倍。該方法主要原理是三聚氰胺與胸腺嘧啶間有氫鍵作用，使得ssDNA變成dsDNA，DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)變后體系熒光大大增強(qiáng)，熒光信號(hào)與三聚氰胺的濃度對(duì)數(shù)成良好的響應(yīng)關(guān)系，該方法已應(yīng)用于牛奶中三聚氰胺的檢測(cè)。Mao等［43］同樣以聚T單鏈DNA為模板的銅納米簇?zé)晒馓结?，基于芬頓反應(yīng)檢測(cè)雙氧水分子。Zhao等［44］一步合成了以組氨酸為模板的高熒光銅納米簇，當(dāng)加入三磷酸鳥苷（GTP）后，發(fā)現(xiàn)體系熒光信號(hào)逐漸降低，而其他的三磷酸核甘（ATP、CTP、UTP）和無機(jī)陰離子如P2O74-、PO43-、CH3COO-等無此現(xiàn)象，可能是由于鳥嘌呤有相對(duì)較強(qiáng)的還原能力使得銅納米簇?zé)晒忖纭?/p>

3.4核酸及酶的檢測(cè)

隨著Rotaru等［12］成功合成以DNA為模板的銅納米簇，銅納米簇應(yīng)用于核酸和酶類的檢測(cè)方法才逐漸出現(xiàn)。Xu等［45］運(yùn)用滾壞擴(kuò)增信號(hào)放大技術(shù)超靈敏檢測(cè)核糖核酸RNA let-7d，let-7d經(jīng)滾壞擴(kuò)增技術(shù)和鏈雜交形成了多聯(lián)體雙鏈DNA，加入銅離子和還原劑抗壞血酸納后，形成的銅納米簇的熒光強(qiáng)度是未擴(kuò)增前的10000倍，該體系在RNA let-7d濃度為10～400 pmol/L時(shí)有很好的線性響應(yīng)信號(hào)，檢出限為10 pmol/L，此方法適合各種可直接或間接進(jìn)行滾壞擴(kuò)增的分析物的檢測(cè)。Hu等［46］同樣利用DNA銅納米簇附著在磁珠上檢測(cè)DNA，如圖6所示，將cDNA的3端連接到已被鏈霉親和素修飾的磁珠上，tDNA和cDNA雜交使得tDNA的3端裸露，激發(fā)了末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）聚合酶反應(yīng)，使得熒光信號(hào)不斷放大，該方法對(duì)tDNA的檢出限為98.2 pmol/L。

圖6　DNA傳感體系原理圖［46］Fig.6　Schematic diagram of DNA sensing strategy（cDNA:capture DNA）［46］

Wang等［47］根據(jù)先前報(bào)道的方法，制備了雙鏈DNA為模板的銅納米簇，研究發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白能顯著提高dsDNA-CuNCs的熒光強(qiáng)度，在魚精蛋白/dsDNA-CuNCs體系中加入胰蛋白酶，水解魚精蛋白使得該傳感體系熒光逐漸降低，胰蛋白酶的檢出限為0.048 ng/mL。Wang等［48］發(fā)現(xiàn)在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）輔酶作用下能使以發(fā)夾DNA為模板的銅納米簇?zé)晒庠鰪?qiáng)，基于此來檢測(cè)NAD+。

3.5生物標(biāo)記和成像

有效、成功的治療癌癥的關(guān)鍵是早期準(zhǔn)確的診斷，銅納米簇毒性低，有一定的化學(xué)惰性，避免了反應(yīng)環(huán)境的影響，減小了對(duì)生物組織和活細(xì)胞的損害，若銅納米簇外殼選用合適，其整體尺寸可小于腎閾值，很容易排出體外，這些特點(diǎn)都促長了銅納米簇在生物標(biāo)記成像領(lǐng)域的應(yīng)用。如Gao等［49］報(bào)道了超小銅納米簇用于正電子發(fā)射型斷層顯影成像（PET）診斷原位肺癌，如圖7所示。之前，一般把放射性元素64Cu成像劑通過大環(huán)螯合引入生命物質(zhì)材料中進(jìn)行PET成像診斷，但由于64Cu易從原螯合物質(zhì)上脫離或者轉(zhuǎn)移影響PET成像結(jié)果。Gao等合成了一種用牛血清蛋白（BSA）作支架的放射性銅納米簇，提前將癌目標(biāo)多肽促黃體激素釋放激素（LHRH）連接到BSA分子上，形成的［64Cu］CuNC@BSA-LHRH有高的放射性標(biāo)記穩(wěn)定性、超小尺寸、能快速擴(kuò)散至目標(biāo)腫瘤處，也能很快排出體外，研究表明CuNC@BSA是一種很好的PET成像追蹤器。Das等［50］用谷胱甘肽作為還原劑和保護(hù)劑一步合成了銅納米簇并應(yīng)用于細(xì)胞成像，研究表明，CuNCs首先集中在癌細(xì)胞核膜上，由于CuNCs的低毒性，能在細(xì)胞內(nèi)良好的生存。

圖7　放射性銅納米簇應(yīng)用于PET成像示意圖［49］Fig.7　The schematic diagram［64Cu］Cu nanoclusters as tracers for PET imaging［49］

4　結(jié)論與展望

銅納米簇由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，具有超小尺寸、生物相容、低毒性和熒光性質(zhì)等特點(diǎn)，成為了一種很有發(fā)展?jié)摿Φ男滦蜔晒馓结?。該文介紹了銅納米簇的性質(zhì)、著重介紹了銅納米簇的合成方法及在重金屬離子、pH、小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等檢測(cè)和生物標(biāo)記和成像方面的應(yīng)用，銅納米簇表面配體的多樣性，為目標(biāo)物的檢測(cè)提供了豐富的位點(diǎn)，使得銅納米簇的應(yīng)用前景非常廣闊。再者，在原有的銅納米簇上組裝上新的物質(zhì)呈現(xiàn)新的性能成為銅納米簇以后的發(fā)展趨勢(shì)。例如Gao等［49］將癌目標(biāo)多肽促黃體激素釋放激素組裝在BSA-CuNCs上，用于原位肺癌的醫(yī)療診斷。銅納米簇的研究及應(yīng)用到目前為止雖有一定進(jìn)展，但在以下方面仍需要科研工作者的努力，如銅納米簇的熒光量子產(chǎn)率低，光穩(wěn)定性弱，容易受環(huán)境干擾，且銅納米簇在超微尺寸下易氧化，如何綠色、簡便合成高質(zhì)量的銅納米簇仍是一個(gè)挑戰(zhàn)；銅納米簇的研究目前集中在其熒光性質(zhì)上，其它性質(zhì)上的應(yīng)用較少，如催化性質(zhì)；某些目標(biāo)物能夠猝滅或者增強(qiáng)銅納米簇的熒光信號(hào)，其檢測(cè)目標(biāo)物的機(jī)理需要進(jìn)一步深入鉆研；應(yīng)加強(qiáng)銅納米簇與其他學(xué)科的交融研究，拓展其應(yīng)用范圍。綜上，合成高質(zhì)量銅納米簇的新方法未來將層出不窮，檢測(cè)目標(biāo)物的種類將更加多樣，隨著銅納米簇合成技術(shù)和基礎(chǔ)理論研究的不斷發(fā)展，將極大地推動(dòng)納米簇?zé)晒鈧鞲衅鞯拈L足進(jìn)步。

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*通信聯(lián)系人，E-mail:jinglin_he@163.com，zhongcao2004@163.com（Z.Cao）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（21545010，31527803）、中國科學(xué)院環(huán)境監(jiān)測(cè)STS項(xiàng)目（KFJ-SW-STS-173）、湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015GK1046）資助

Recent research in synthesis and application of copper nanoclusters

Li Ting，Li Pan-pan，Xiao Hui，Yang Chan，Huang Si-ying，He Jing-lin*，Cao Zhong*
（Collaborative Innovation Center of Micro/nano Bio-sensing and Food Safety Inspection，Hunan Provincial Key Laboratory of Materials Protection for Electric Power and Transportation，School of Chemistry and Biological Engineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114，China）

Abstract:Nobel metal nanoclusters（NCs）are composed of several to about one hundred atoms and have received considerable research interest due to their ultra small particle size，good biocompatibility，low toxicity，and unique physical and chemical properties.However，in comparison to the AuNCs and AgNCs，the research of copper nanoclusters is still at the initial stage.In this review，we introduce the optical properties，synthesis methods and analytical applications of copper nanoclusters，especially emphasis on summing up the CuNCs synthesis method like template synthesis method，chemical reduction method，inverse microemulsion method，etching method，etc.And the analytical applications for fluorescent detection of heavy metal ions，pH，small molecules and biological molecules as well as the applications in biological labeling and bioimaging have been reviewed.

Key words:copper nanoclusters；fluorescent sensor；analytical application；review