甜瓜果肉顏色相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用

楊旭輝，華德平，付金玉，張喬玲，謝梅婷，劉 莉*

(1 天津大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2 天津大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072)

甜瓜(CucumismeloL.)為一年生黃瓜屬(Cucumis)作物，其色香味俱全，并且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種世界性的果品，深受人們喜愛。果肉顏色作為甜瓜的一個(gè)重要農(nóng)藝性狀，直接影響消費(fèi)者的需求與選擇。甜瓜果肉顏色主要分為橘色、淺綠色和白色，與綠色和白色果肉甜瓜相比，橘色果肉甜瓜顏色更加誘人，尤其是其具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所以受到消費(fèi)者的偏愛。因此培育橘色果肉的甜瓜品種，是當(dāng)前甜瓜育種的重要目標(biāo)之一。

甜瓜果肉顏色由葉綠素和類胡蘿卜素共同決定[1]，其中類胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素是決定甜瓜橘色果肉的關(guān)鍵色素[2]。β-胡蘿卜素廣泛存在于新鮮蔬菜和水果中，是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素之一[3]。適量攝入β-胡蘿卜素可以緩解由維生素A缺乏引起的多種病癥，并具有預(yù)防癌癥、心腦血管疾病和眼部疾病的功效，還有抗氧化和預(yù)防衰老的作用[4-6]。橘色果肉市場(chǎng)品種甜瓜是類胡蘿卜素(主要指β-胡蘿卜素)的重要飲食來源[5]。前人的研究表明甜瓜果肉顏色由2個(gè)等位基因決定，分別為gf(決定果肉綠色)和wf(決定果肉白色)。Gf決定橘色果肉，它同時(shí)對(duì)gf和wf呈顯性上位效應(yīng)[7]。值得注意的是Tzuri 等在甜瓜中發(fā)現(xiàn)1個(gè)可以增加果肉β-胡蘿卜素含量的基因CmOr[8]，被證明是甜瓜中的gf位點(diǎn)，它是控制甜瓜果肉顏色的關(guān)鍵因子，含有正常功能CmOr基因的甜瓜表現(xiàn)為橘色的果肉，含有突變形式CmOr基因的甜瓜表現(xiàn)為綠色或白色果肉。

目前，有關(guān)甜瓜類胡蘿卜素研究的報(bào)道較少，對(duì)于橘色果肉甜瓜的選育，一般還采用傳統(tǒng)方法，即對(duì)育種材料成熟期的果實(shí)顏色進(jìn)行鑒定，具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來，由于甜瓜可用遺傳信息包括轉(zhuǎn)錄組(http://www.icugi.org)和基因組序列(http://melonomics.net)信息的公布和完善，可以開發(fā)更多的分子標(biāo)記用于甜瓜實(shí)際育種中。分子標(biāo)記輔助育種(marker-assisted selection)是直接從DNA水平對(duì)性狀進(jìn)行選擇，具有省時(shí)、省力、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，可以大幅縮短育種周期，是傳統(tǒng)育種技術(shù)的有力補(bǔ)充。

InDel(insertion-deletion length polymorphism)標(biāo)記具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠基于插入/缺失位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接在電泳技術(shù)平臺(tái)上檢測(cè)即可，檢測(cè)簡(jiǎn)單便捷，對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)要求較低。本研究旨在利用當(dāng)前已知的甜瓜基因組序列信息，通過對(duì)橘色果肉和非橘色果肉甜瓜材料CmOr基因序列進(jìn)行比對(duì)，開發(fā)出與甜瓜果肉顏色共分離的功能型 InDel分子標(biāo)記，以期利用該分子標(biāo)記能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定出橘色果肉和非橘色果肉甜瓜，從而用于甜瓜果肉顏色的選育，通過分子標(biāo)記輔助選擇，能夠有效降低育種成本，提高育種效率，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 甜瓜材料

供試甜瓜包括橘色果肉材料12份；白色果肉材料6份；綠色果肉材料6份，橘綠果肉‘一窩狼’和‘紅到邊’各1份，純合橘肉和純合白肉材料雜交得到的2個(gè)F1組合F358和F361。以上所用甜瓜材料除F1代材料之外，均為高代純合自交系，果肉顏色性狀區(qū)分明顯，遺傳穩(wěn)定(表1)。分別選取2個(gè)純合橘肉材料(Nb590和Nb647)與2個(gè)純合白肉材料(Nb627和Nb652)雜交得到2個(gè)F1組合(Nb627×Nb590)及(Nb647×Nb652)，F(xiàn)1自交后得到2個(gè)F2分離群體用于橘色果肉的分子標(biāo)記檢測(cè)。上述所有材料均由天津大學(xué)植物資源及育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1果肉顏色鑒定供試材料于2016年8月在天津市北辰區(qū)甜瓜實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行育苗，塑料大棚定植，采用常規(guī)吊蔓栽培。在果實(shí)成熟期調(diào)查果肉顏色。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)甜瓜基因組重測(cè)序信息，通過對(duì)比橘肉和非橘肉甜瓜材料間CmOr基因序列，在其內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一插入/缺失突變，根據(jù)此插入/缺失位點(diǎn)開發(fā)出 InDel-Or1標(biāo)記，依照突變兩側(cè)的 DNA 序列以及引物設(shè)計(jì)的一般原則，利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)正向引物InDel-Or1-For(5′-AGAGGAGACTGTAGCCGATGTTTGG-3′)和反向引物InDel-Or1-Rev(5′-CAACCTTTCTTCTCCCATTGCACATTGC-3′)。所開發(fā)的 InDel 標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，利用該引物對(duì)甜瓜材料進(jìn)行擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)容易區(qū)分純合子和雜合子，對(duì)于橘肉性狀甜瓜材料DNA能擴(kuò)增出大小為560 bp的條帶，而非橘肉甜瓜材料DNA擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段大小為488 bp，設(shè)計(jì)得到的標(biāo)記為共顯性。

1.2.3DNA提取、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳對(duì)所有供試材料取0.5 g 幼嫩葉片，參照 Murray 等[9]的 CTAB 方法提取葉片總 DNA。以該DNA為模板，利用設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用10 μL反應(yīng)體系，包括：1.0 μL 10×PCR Buffer、0.2 μL 2.5 mmol·L-1dNTP、0.4 μL 10 μmol·L-1引物、0.2 μL 5 U·μL-1Taq、1.5 μL 50 ng·L-1DNA、6.7 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增采用的程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在150 V恒壓條件下電泳30 min，EB染色后，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 供試甜瓜材料

2 結(jié)果與分析

2.1 CmOr基因功能標(biāo)記InDel-Or1的開發(fā)

CmOr(MELO3C005449)是控制甜瓜果肉顏色的關(guān)鍵基因，并且已經(jīng)被克隆。根據(jù)甜瓜基因組重測(cè)序信息，于CmOr基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一InDel分子標(biāo)記，將其命名為InDel-Or1，與非橘肉甜瓜相比，橘肉甜瓜CmOr內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)存在73個(gè)核苷酸的插入和1個(gè)核苷酸的缺失(圖1)，根據(jù)其插入/缺失位置兩側(cè)的堿基序列信息，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，來檢測(cè)甜瓜是否為橘色果肉。理論上來說，該引物對(duì)于橘肉純合材料DNA能擴(kuò)增出大小為560 bp片段，在非橘肉材料DNA中能擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段大小為488 bp，而在橘肉雜合甜瓜材料中則能擴(kuò)增出488 bp及560 bp兩條帶。利用瓊脂糖凝膠電泳能很好區(qū)分。

2.2 InDel-Or1分子標(biāo)記在橘肉和非橘肉甜瓜材料中的驗(yàn)證

使用本研究開發(fā)的InDel-Or1標(biāo)記對(duì)選取的28份甜瓜材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)所選材料的田間表型和分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果(圖2)顯示，12份橘肉材料只擴(kuò)增出了560 bp條帶；有14份材料只擴(kuò)增出了488 bp條帶，果肉顏色包括白色、綠色和橘綠色。以上26份材料檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)出單一條帶的純合基因型。2個(gè)F1代甜瓜材料則擴(kuò)增出了488和560 bp兩條帶，表現(xiàn)為雜合基因型(圖2)。利用該分子標(biāo)記對(duì)材料基因型檢測(cè)結(jié)果與田間表現(xiàn)型完全一致(表2)。

在本研究中，非橘肉材料除了常用白肉和綠肉類型以外，還選用了2個(gè)果肉顏色較為特殊的材料，如‘一窩狼’和‘紅到邊’，其果肉顏色介于橘色和綠色之間，稱之為橘綠肉類型，如圖2，B所示，這2個(gè)材料(27和28)擴(kuò)增出488 bp條帶，即非橘肉條帶。由此可見，只有標(biāo)準(zhǔn)的橘肉類型甜瓜才能擴(kuò)增出560 bp條帶。

2.3 InDel-Or1對(duì)甜瓜分離群體的果肉顏色鑒定分析

2016年春季，選取純合橘肉和白肉材料配置2個(gè)雜交組合(Nb627×Nb590)和(Nb647×Nb652)，自交收獲F2代種子。2017年春，對(duì)這2個(gè)F2群體分別獲得601株和578株的幼苗進(jìn)行掛牌取樣，提取單株的單片子葉DNA，利用InDel-Or1標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果見表3。將2個(gè)組合中僅擴(kuò)增出560 bp條帶的110株和123株幼苗，以及在僅擴(kuò)增出488 bp條帶的幼苗中隨機(jī)選10株定植到田間。最終待果實(shí)成熟時(shí)調(diào)查果肉顏色。比較基因型與表型鑒定結(jié)果(表4)顯示：雜交組合(Nb590×Nb627)的分離群體中，篩選出的560 bp條帶植株田間收獲104株，其中96株表現(xiàn)為橘肉，分子標(biāo)記符合率為97.1%；在具有純合488 bp條帶的10株果實(shí)中，6株為白肉，4株為綠肉。組合(Nb647×Nb652)的分離群體中，篩選出的560 bp條帶植株田間收獲119株，其中113株表現(xiàn)為橘肉，分子標(biāo)記符合率為95.0%；在具有純合488 bp條帶的10株果實(shí)中，8株為白肉，2株為綠肉(表4)。

灰色方格為外顯子，灰色方之間為內(nèi)含子區(qū)域；紅色箭頭為本研究發(fā)現(xiàn)InDel標(biāo)記所處位置。框線內(nèi)為橘肉甜瓜與非橘肉甜瓜在InDel標(biāo)記附近序列比對(duì)結(jié)果，紅色框線內(nèi)為插入缺失位點(diǎn)，與非橘肉甜瓜相比，橘肉甜瓜在此區(qū)域存在大小為73 bp插入和1 bp缺失圖1 InDel-Or1分子標(biāo)記在CmOr基因中所處位置Gray blocks represent exons and the regions between them stand for introns. Red arrow denotes the location of InDel marker we found here in CmOr gene. Sequences in black box are the results of sequence alignment between orange flesh melon and non-orange flesh melon, base sequences in red boxes are InDel loci. There are 73 bp insertion and 1 bp deletion in orange flesh melon compared with non-orange flesh melonFig.1 Location of InDel-Or1 marker in the CmOr gene

A. 厚皮甜瓜材料; B. 薄皮甜瓜材料; M. DNA MarkerⅠ; 1～28. 28份供試甜瓜材料的序號(hào)、果肉顏色見表1圖2 InDel-Or1標(biāo)記對(duì)28份甜瓜材料PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果A. Muskmelon accessions; B. Oriental sweet melon accessions; M. DNA MarkerⅠ; 1-28. Numbers of 28 melon accessions listed in Table 1Fig.2 PCR amplification products of 28 melon accessions using InDel-Or1 marker

編號(hào)No.果肉顏色Flesh color條帶大小Size/bp編號(hào)No.果肉顏色Flesh color條帶大小Size/bp1橘色 Orange56015綠色 Green4882橘色 Orange56016綠色 Green4883橘色 Orange56017綠色 Green4884橘色 Orange56018綠色 Green4885橘色 Orange56019橘色 Orange488/5606橘色 Orange56020橘色 Orange488/5607橘色 Orange56021橘色 Orange5608橘色 Orange56022橘色 Orange5609橘色 Orange56023綠色 Green48810橘色 Orange56024白色 White48811白色 White48825白色 White48812白色 White48826綠色 Green48813白色 White48827橘綠色 Orange-green48814白色 White48828橘綠色 Orange-green488

表3 F2代群體基因型檢測(cè)結(jié)果

表4 F2代部分植株田間表型鑒定與基因型檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 討 論

分子標(biāo)記通常是指狹義概念上的DNA標(biāo)記，即利用種內(nèi)個(gè)體間 DNA 序列差異而設(shè)計(jì)的，主要有RFLPs、SSR、AFLPs、InDel 和SNPs等，在分子標(biāo)記的開發(fā)中，通常有2類標(biāo)記具有較大的應(yīng)用意義，基因連鎖標(biāo)記[10]和基因標(biāo)記[11]。開發(fā)基因連鎖標(biāo)記或基因標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助育種策略通過基因型的選擇來判斷表型，不受環(huán)境因素的制約，可在種子或苗期進(jìn)行選擇。近年來，越來越多的關(guān)于甜瓜果肉顏色調(diào)控基因的分離以及類胡蘿卜素累積機(jī)制方面的研究被報(bào)道[8, 12-15]，但甜瓜果肉顏色的調(diào)控機(jī)理尚未完全清楚。Tzuri等[8]通過測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)CmOr基因編碼區(qū)內(nèi)一單核苷酸突變位點(diǎn)導(dǎo)致了編碼氨基酸的改變。進(jìn)一步研究證明該氨基酸的突變導(dǎo)致了甜瓜果肉顏色的變異。根據(jù)該SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，能夠很好地鑒定出橘色果肉甜瓜。SNP作為最新一代分子標(biāo)記，依托高通量測(cè)序平臺(tái)和基因芯片技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大群體樣本的快速分型。然而如今許多育種實(shí)驗(yàn)室對(duì)SNP的分型還是基于PCR的技術(shù)水平，并且還需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化處理。而InDel作為另一種被廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記，具有遺傳穩(wěn)定、檢測(cè)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，可以適合不同檢測(cè)條件的需求。

本研究通過橘肉和綠肉CmOr基因的基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)橘肉CmOr基因及綠肉CmOr基因內(nèi)含子區(qū)域存在插入/缺失位點(diǎn)，片段大小為72 bp。此插入/缺失位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為CmOr基因 InDel分子標(biāo)記的開發(fā)提供了序列參考信息。由此成功開發(fā)出的InDel-Or1分子標(biāo)記與果肉顏色主效基因/QTL共分離。此標(biāo)記通過瓊脂糖凝膠電泳即能清晰地分析出條帶差異，并且此標(biāo)記設(shè)計(jì)為共顯性，能夠清晰地區(qū)分純合子和雜合子，在甜瓜種子或幼苗期即可鑒定果肉顏色的基因型。在2個(gè)雜交分離群體中，InDel-Or1標(biāo)記對(duì)橘肉植株鑒定符合率分別達(dá)到97.1%和95.0%。完全可用于甜瓜果肉顏色的分子標(biāo)記輔助育種選擇。

甜瓜果肉顏色主要有橘色、綠色和白色。而在本研究選取的薄皮材料中，存在一些特殊果肉顏色的甜瓜類型，例如橘綠肉類型的‘一窩狼’和‘紅到邊’，這2個(gè)材料的橘色表現(xiàn)與本研究中其他橘肉類型不同，在未熟時(shí)期果肉顏色為綠色，隨著果實(shí)成熟而逐漸顯現(xiàn)為橘色，但綠色并未消失，最終在果實(shí)完全成熟時(shí)期表現(xiàn)為橘綠色，果實(shí)中的橘色部分由瓤向外呈現(xiàn)擴(kuò)散趨勢(shì)，并且離瓤越近橘色越深。分子檢測(cè)結(jié)果顯示這2份橘綠肉材料僅出現(xiàn)488 bp條帶即非橘肉條帶，并未出現(xiàn)560 bp的橘肉條帶，無法解釋果肉中橘色的來源。而薄皮材料的Nb151和Nb169為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過改良得到的高代純合橘肉類型甜瓜材料，與厚皮材料中橘肉類型甜瓜果肉顏色表現(xiàn)一致，在成熟過程中，果肉呈現(xiàn)出由幼果的白色逐漸到淺橘，再到成熟時(shí)期均勻的橘色。這些材料擴(kuò)增產(chǎn)物僅有560 bp條帶。由此推測(cè)可能在薄皮類型的‘一窩狼’和‘紅到邊’中，其果肉中橘色來源與以上其他材料的橘肉類型不同，存在其他控制果肉顏色的基因，仍需進(jìn)一步研究。

另外，本研究所設(shè)計(jì)分子標(biāo)記主要用于區(qū)分橘肉類型和非橘肉類型甜瓜，當(dāng)前尚未開發(fā)出用于鑒定綠色果肉和白色果肉甜瓜的分子標(biāo)記，對(duì)于控制它們的基因也尚不清楚。在本研究利用橘肉和白肉親本得到的F2代分離群體中，不但出現(xiàn)了橘肉和白肉類型甜瓜，也出現(xiàn)了少量的綠肉類型甜瓜。先前的研究也已證明在甜瓜果肉顏色遺傳中，綠肉和白肉性狀對(duì)橘肉性狀為隱性，同時(shí)控制綠肉的基因gf與控制白肉的基因wf之間存在上位效應(yīng)。當(dāng)基因型為wf+_/gf+_或wf+_/gfgf時(shí)，果肉顏色為橘色；當(dāng)基因型為wfwf/gf+_時(shí)果肉顏色為白色；當(dāng)基因型為wfwf/gfgf時(shí)果肉顏色為綠色[16]。并且wf已經(jīng)被證實(shí)與甜瓜果實(shí)由白色到綠色的轉(zhuǎn)變有關(guān)，并且已經(jīng)被定位到了08染色體[17]。Gur等研究發(fā)現(xiàn)由于人工選擇的作用，使得在甜瓜亞種ssp.melo中，橘肉材料多出現(xiàn)在reticulatus和cantalupensis變種中，白色果肉甜瓜大都出現(xiàn)在inodorous變種，以分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)為指導(dǎo)，已經(jīng)可以快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)甜瓜顏色性狀在不同遺傳背景材料中的轉(zhuǎn)移[18]。當(dāng)前亟需進(jìn)行更進(jìn)一步的探究控制甜瓜顏色的基因以及它們之間的作用和聯(lián)系，開發(fā)可用于區(qū)分綠色和白色果肉類型甜瓜的分子標(biāo)記，建立和完善甜瓜果肉顏色分子標(biāo)記輔助育種體系。

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