Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活及調(diào)控在不同中醫(yī)證型乳腺癌中的意義及機(jī)制

宮國(guó)良，陳靜寧，劉曉雨，張?jiān)?，林　騰

(1.汕頭潮南民生醫(yī)院 病理科，廣東 汕頭515044；2.汕頭市金平區(qū)婦幼保健院 婦產(chǎn)科，廣東 汕頭515044；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

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Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活及調(diào)控在不同中醫(yī)證型乳腺癌中的意義及機(jī)制

宮國(guó)良1，陳靜寧2，劉曉雨1，張?jiān)?，林騰3*

(1.汕頭潮南民生醫(yī)院 病理科，廣東 汕頭515044；2.汕頭市金平區(qū)婦幼保健院 婦產(chǎn)科，廣東 汕頭515044；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

摘要：目的探討β-catenin、Slug、P-GSK3β在不同中醫(yī)證型乳腺癌中的表達(dá)，進(jìn)而分析不同中醫(yī)證型乳腺癌Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活及調(diào)控的意義及機(jī)制。方法對(duì)102例乳腺癌患者進(jìn)行術(shù)前中醫(yī)辨證分型，術(shù)后行病理常規(guī)檢查，并進(jìn)行β-catenin、Slug、P-GSK3β免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果102例乳腺癌中肝郁痰凝型47例(46.08%)，沖任失調(diào)型36例(35.29%)，正虛毒熾型19例(18.63%)；不同中醫(yī)證型組β-catenin、Slug、P-GSK3β的表達(dá)存在差異性，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活在不同中醫(yī)證型乳腺癌中存在差異，且該差異與Slug、P-GSK3β的調(diào)控相關(guān)。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；中醫(yī)證型；免疫組織化學(xué)

(ChinJLabDiagn,2016,20:1076)

近年來(lái)，有關(guān)乳腺癌中醫(yī)證型與分子標(biāo)志物的相關(guān)性研究越來(lái)越多，研究者從各自的研究角度出發(fā)選用不同的指標(biāo)進(jìn)行分析，研究結(jié)果均認(rèn)為乳腺癌的中醫(yī)證型與分子標(biāo)記物間存在一定相關(guān)性。通過(guò)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)可以發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)學(xué)者把研究重點(diǎn)集中在乳腺癌中醫(yī)證型與預(yù)后的相關(guān)性上，而對(duì)其進(jìn)一步的分子機(jī)制，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此我們選擇與乳腺癌較為密切的Wnt/β-catenin信號(hào)通路與中醫(yī)證型的相關(guān)性進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)該信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin及其調(diào)控蛋白鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Slug)和磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(P-GSK3β)的研究，進(jìn)一步闡明不同中醫(yī)證型乳腺癌的可能分子機(jī)制，為中醫(yī)證型與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的緊密結(jié)合提供可行的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料收集汕頭潮南民生醫(yī)院2013年3月-2015年12月診斷的乳腺癌病例102例，患者年齡25-81歲，平均53±28歲，所有患者均進(jìn)行術(shù)前中醫(yī)辨證分型及術(shù)后病理檢查。中醫(yī)辨證分型分為三組，其中肝郁痰凝型47例，沖任失調(diào)型36例，正虛毒熾型19例。術(shù)后病理分型顯示，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌91例，浸潤(rùn)性小葉癌6例，髓樣癌4例，粘液癌1例。

1.2方法標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及染色。免疫組化采用EnVision兩步法，β-catenin單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，Slug、P-GSK3β多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。組織切片65℃烤片后脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗，PBS沖洗5 min×3，滴加—抗室溫孵育1.5h，PBS沖洗5 min×3，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min×3，DAB顯色，鏡下控制陽(yáng)性細(xì)胞呈棕色為止，充分蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染1分鐘，脫水，封片。免疫組化均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。β-catenin正常表達(dá)于細(xì)胞膜，出現(xiàn)細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核的陽(yáng)性為異常表達(dá)，Slug主要表達(dá)于細(xì)胞漿、P-GSK3β表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用IBM SPSS Statistics18.0軟件，多組間比較采用方差分析；β-catenin、Slug、P-GSK3β相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果

2.1102例乳腺癌中醫(yī)辨證分型參考國(guó)家中醫(yī)藥管理局頒布的《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》(ZY/T001.2-94)及相關(guān)文獻(xiàn)[1]，將乳腺癌患者分為3個(gè)證型組：其中肝凝痰凝型47例(46.08%)、沖任失調(diào)

型36例(35.29%)、正虛毒熾型19例(18.63%)。

2.2β-catenin在乳腺癌各中醫(yī)證型中的表達(dá)情況β-catenin只有細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核的異常表達(dá)，才定義為陽(yáng)性，只出現(xiàn)細(xì)胞膜的著色，定義為陰性。β-catenin在3組中醫(yī)證型組間存在差異性表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，見(jiàn)表1，圖1。

2.3Slug在乳腺癌各中醫(yī)證型中的表達(dá)情況Slug主要表達(dá)于細(xì)胞漿，在正虛毒熾型中表達(dá)陽(yáng)性率最高，與其他兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，肝郁痰凝型與沖任失調(diào)型表達(dá)率較低，且組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1，圖2。

2.4P-GSK3β在乳腺癌各中醫(yī)證型中的表達(dá)情況P-GSK3β表達(dá)于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，在肝郁痰凝組中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于其他兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，沖任失調(diào)組與正虛毒熾組表達(dá)率較高，兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1，圖3。

表1　β-catenin、Slug、P-GSK3β在乳腺癌各中醫(yī)證型中的表達(dá)情況

圖1沖任失調(diào)型型乳腺癌，β-catenin出現(xiàn)細(xì)胞漿的異常表達(dá) EnVision法 高倍放大。圖2肝郁痰凝型乳腺癌，Slug細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá) EnVision法 高倍放大。圖3正虛毒熾型型乳腺癌，P-GSK3β細(xì)胞膜及細(xì)胞漿陽(yáng)性表達(dá) EnVision法 高倍放大

2.5不同中醫(yī)證型乳腺癌β-catenin、Slug、P-GSK3β表達(dá)的相關(guān)性β-catenin與 P-GSK3β在3種中醫(yī)證型乳腺癌中呈明顯的正相關(guān)(r值分別為0.166、0.255、0.221，P值分別為0.025、0.007、0.014)，β-catenin與Slug在沖任失調(diào)型和正虛毒熾型中呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.174、-0.322，P值分別為0.011、0.003)，在肝郁痰凝型中無(wú)明顯的相關(guān)性(r=0.054,P=0.748)。在3組中醫(yī)證型中Slug與P-GSK3β均無(wú)明顯相關(guān)性，由此也可以看出，兩者對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控是通過(guò)不同的機(jī)制完成的。

3討論

有關(guān)乳腺癌中醫(yī)證型與分子標(biāo)志物的相關(guān)性研究，國(guó)內(nèi)有較多報(bào)道[2-6]，但重點(diǎn)多集中在乳腺癌中醫(yī)證型與預(yù)后或指導(dǎo)治療的分子標(biāo)志物相關(guān)性上，而對(duì)其進(jìn)一步的機(jī)制少有研究。在乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活與調(diào)控是得到證實(shí)的關(guān)鍵理論點(diǎn)[7-9]。β連環(huán)蛋白(β-catenin)是一種胞內(nèi)蛋白，定位于人染色體3p21.3，其mRNA長(zhǎng)度為3362個(gè)核苷酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為90 ku。β-catenin具有雙重功能：一是介導(dǎo)細(xì)胞E-鈣黏連素(E-cadherin)的重要結(jié)構(gòu)分子，其異常改變?cè)谀[瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用；二是作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[10]。Wnt信號(hào)通路的多個(gè)成員都參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展， Wnt信號(hào)通路的核心是胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定性，在正常乳腺中β-catenin呈膜陽(yáng)性表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)胞漿/核異常表達(dá)時(shí)Wnt信號(hào)通路開(kāi)放，而乳腺癌發(fā)生的一個(gè)重要因素就是Wnt信號(hào)通路被異常激活，大量的國(guó)內(nèi)外研究都證實(shí)了這一理論。通過(guò)我們的研究可以發(fā)現(xiàn)，不同中醫(yī)證型乳腺癌中均存在β-catenin的異常表達(dá)，但以正虛毒熾型異常表達(dá)率最高，說(shuō)明不同中醫(yī)證型乳腺癌中Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活存在差異，對(duì)于該差異的機(jī)制，筆者認(rèn)為與鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Slug)和磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(P-GSK3β)的調(diào)控有關(guān)。

Slug是E-cadherin 啟動(dòng)子的抑制子，能夠特異抑制黏附連接成分(E-cadherin和β-catenin)，從而發(fā)揮對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用[11，12]。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌不同中醫(yī)證型中，Slug蛋白在正虛毒熾型組中的表達(dá)水平明顯其他兩組組，相關(guān)性分析顯示β-catenin與Slug在沖任失調(diào)型和正虛毒熾型中呈負(fù)相關(guān)，在肝郁痰凝型組中，兩者無(wú)明顯的相關(guān)性，這些均提示Slug參與了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控，但僅是Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制之一，該信號(hào)通路的調(diào)控應(yīng)該是復(fù)雜的、多因素的。 GSK-3β是一個(gè)多功能的絲氨酸蘇氨酸類激酶，在真核生物中普遍存在，其基因定位于人染色體3q13.3。GSK-3β是絲氨酸/氨酸激酶，通過(guò)降解β-catenin 發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，由于GSK-3β的活性由不同位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)，GSK-3β發(fā)生磷酸化可降低GSK-3β活性，磷酸化后GSK-3β( P-GSK3β)可以防止GSK-3β與β-catenin及細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)結(jié)合，使β-catenin和CyclinD1 發(fā)生過(guò)度表達(dá)，cycinD1 可與 CDK4 /6在G1期結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，過(guò)度增殖，最后惡性轉(zhuǎn)化，發(fā)生乳腺癌。目前，研究認(rèn)為P-GSK3β是β-catenin的主要正調(diào)控因子，可以使變異的β-catenin 蛋白積累并進(jìn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，參與并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，引發(fā)了細(xì)胞循環(huán)周期失控，加快了腫瘤增殖[13，14]。通過(guò)我們的研究可以發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌不同中醫(yī)證型中，P-GSK3β的表達(dá)存在差異性，在肝郁痰凝組中表達(dá)率最低，與其他兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，沖任失調(diào)組與正虛毒熾組表達(dá)率較高，兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示，β-catenin與P-GSK3β呈明顯正相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道較一致。

綜上所述，不同中醫(yī)證型乳腺癌存在β-catenin的異常表達(dá)，且表達(dá)具有差異性，說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活情況在不同中醫(yī)證型的乳腺癌中存在差異，此種差異與Slug 及P-GSK3βGSK的調(diào)控作用密切相關(guān)。

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基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研資助項(xiàng)目 粵中醫(yī)〔2014〕25號(hào)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)07-1076-04

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

(收稿日期：2016-02-24)

The significance and mechanism of activation and regulation of wnt/β-catenin signal pathway in breast cancers with different TCM syndromes

GONGGuo-liang,CHENJing-ning,LIUXiao-yu,etal.

(Departmentofpathology,ChaonanMinshengHospitalofShantou,Shantou515044，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of β-catenin,Slug and P-GSK3β in breast cancers with different Traditional Chinese Medicine(TCM) syndromes,and further anlyze the significance and mechanism of activation and regulation of wnt/β-catenin signal pathway in breast cancers with different TCM syndromes.MethodsPreoperative TCM syndrome differentiation was carried out on 102 patients with breast cancer,.Routine pathological examination was performed postoperatively,and immunohistochemical staining was conducted for β-catenin,slug and P-GSK3β.ResultsAmong the 102 patients with breast cancer,47 patients(46.08%) had liver-qi stagnation and phlegm stagnation type,36(35.29%) had Chong and Ren disorders,and 19(18.63%) had is the deficiency of heat toxin type.Moreover,the expression of β-catenin,slug and P-GSK3β among different TCM syndrome groups demonstrated differeces,which showed statistical significance.ConclusionThe activation of wnt/β-catenin signal pathway has different effects on breast cancers with different TCM syndromes,which are associated with the regulation of β-catenin,slug and P-GSK3β.

Key words:Breast cancer;Traditional Chinese Medicine syndrome;Immunohistochemistry