沙門氏菌比對試驗(yàn)的檢驗(yàn)分析

陳冬娥， 陳冠武，許如蘇，蘇建暉，林寧靜

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 技術(shù)中心，廣東 汕頭 515041）

沙門氏菌比對試驗(yàn)的檢驗(yàn)分析

陳冬娥， 陳冠武，許如蘇，蘇建暉，林寧靜

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 技術(shù)中心，廣東 汕頭 515041）

選擇鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌分別與檢驗(yàn)中常見的5種其它腸桿菌屬細(xì)菌組合成染菌蝦仁模擬樣品10組，按照現(xiàn)行的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2010進(jìn)行沙門氏菌檢驗(yàn)［1］。10組樣品均能檢出沙門氏菌和干擾菌，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。在檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)BS平板需要經(jīng)過培養(yǎng)48 h才能觀察到明顯的菌落特征；增菌液培養(yǎng)時(shí)間越長，沙門氏菌的生長越好；甲型副傷寒沙門氏菌有微弱產(chǎn)H2S現(xiàn)象；粘質(zhì)沙雷氏菌對鼠傷寒沙門氏菌的硫化氫反應(yīng)有抑制作用；奇異變形桿菌和檸檬酸桿菌與沙門氏菌屬A-F多價(jià)O診斷血清發(fā)生交叉凝集反應(yīng)現(xiàn)象。培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)的檢測技術(shù)問題，在水產(chǎn)品、動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的沙門氏菌等腸桿菌屬的檢驗(yàn)中，都有很好的借鑒意義。

沙門氏菌；腸桿菌屬細(xì)菌；平板；H2S，血清學(xué)

沙門氏菌是腸桿菌科中一類很重要的腸道致病菌，能引起人類患病，如傷寒、敗血癥、急性腸胃炎、骨髓炎、膽囊炎、關(guān)節(jié)炎等疾患，且大多數(shù)菌同時(shí)是動(dòng)物、禽類的病源菌，可引起鼠傷寒、雞白痢、馬、羊流產(chǎn)等急性傳染病，對人、畜危害極大［2］。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒占首位或第二位［3］。國內(nèi)外的各類食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中均要求沙門氏菌不得檢出［4］。沙門氏菌的檢測在食品安全檢測中具有重要的意義。

沙門氏菌屬菌型繁多，抗原復(fù)雜，目前從世界各地檢出的沙門氏菌菌型近兩千個(gè)（包括亞利桑那菌在內(nèi)）［2］。在水產(chǎn)品、動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品沙門氏菌的檢驗(yàn)中，腸桿菌科的其它菌屬細(xì)菌也常被檢出，如奇異變形桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌等，這些干擾菌的存在，影響了檢驗(yàn)人員的判斷。作者所在實(shí)驗(yàn)室近期在粵東地區(qū)組織實(shí)施了 “水產(chǎn)品中沙門氏菌的檢驗(yàn)”的實(shí)驗(yàn)室間比對試驗(yàn)活動(dòng)。在活動(dòng)組織的試驗(yàn)階段，作者通過選用不同的沙門氏菌菌株和具有典型干擾性的其它腸桿菌屬菌株分別進(jìn)行組合培養(yǎng)，通過研究總結(jié)出在沙門氏菌實(shí)際檢測中應(yīng)注意的問題，對于提高日常檢測技術(shù)尤其是水產(chǎn)品、動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品中沙門氏菌的檢驗(yàn)有很好的借鑒意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株或陽性菌株甲型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌：購自中國微生物菌種保藏管理中心；奇異變形桿菌、楊氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、溫和氣單胞菌：來自水產(chǎn)品沙門氏菌檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中分離保留的菌種。

1.1.2樣品蝦仁

1.1.3主要培養(yǎng)基及試劑緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍（BS）、HE瓊脂（HE）、XLD瓊脂（XLD）、三糖鐵瓊脂（TSI）、營養(yǎng)瓊脂（NA）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（CAS）：法國科馬嘉公司；API20E生化試劑鑒定盒：梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；沙門氏菌屬A-F多價(jià)O診斷血清：寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用并通過有效性驗(yàn)證。

1.2方法

1.2.1模擬樣品制備蝦仁經(jīng)1×105Pa滅菌30 min處理，60℃、30 min烘干備用。將甲型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、奇異變形桿菌、楊氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、溫和氣單胞菌等7種菌株劃NA平板36℃培養(yǎng)24 h，挑取菌苔制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪海? mL進(jìn)行1萬倍稀釋，制成含菌量約為1 000 CFU/mL的菌液，分別均勻滴加到蝦仁上，混合制成染菌樣品，蝦仁染菌量為10 CFU/g。將兩種沙門氏菌陽性菌染菌樣品各取20 g，奇異變形桿菌等5種干擾菌染菌樣品各取5 g，分別組合，混合均勻，制成10種組合模擬樣品。模擬樣品經(jīng)-18℃冷凍成干凍蝦仁。

1.2.2模擬樣品的檢驗(yàn)按GB 4789.4-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》對10組樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，將分離出來的沙門氏菌及干擾菌進(jìn)行分離純化、生化試驗(yàn)及血清學(xué)檢驗(yàn)等。在增菌液培養(yǎng)的不同階段對沙門氏菌及干擾菌分別劃線接種HE、XLD、BS、CAS平板，以觀察增菌液培養(yǎng)時(shí)間長短對沙門氏菌等菌株生長情況的影響。

2結(jié)果與討論

2.1模擬樣品檢驗(yàn)結(jié)果

10組樣品均能檢出沙門氏菌和干擾菌，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。沙門氏菌及干擾菌的菌落特征、TSI培養(yǎng)情況及血清學(xué)鑒定結(jié)果見表1。

2.2沙門氏菌和干擾菌平板生長情況

沙門氏菌在HE、XLD、CAS等3種平板培養(yǎng)24 h后生長旺盛，菌落特征明顯，而在BS平板上生長較慢，菌落較小，在48 h后才能觀察到明顯的菌落特征，但生長的菌量沒有其他選擇性平板多，使用效果較差。

甲型副傷寒沙門氏菌培養(yǎng)48 h后，有產(chǎn)H2S現(xiàn)象。鼠傷寒沙門氏菌在粘質(zhì)沙雷氏菌的影響下在XLD平板上無產(chǎn)H2S現(xiàn)象，挑取該菌繼續(xù)劃XLD平板培養(yǎng)，生長的菌落為粉紅色中心帶黑色，產(chǎn)H2S。說明粘質(zhì)沙雷氏菌對鼠傷寒沙門氏菌的硫化氫反應(yīng)有抑制作用。

2.3增菌液培養(yǎng)時(shí)間對沙門氏菌的影響

BPW增菌液培養(yǎng)后直接劃選擇性平板，發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌、楊氏檸檬酸桿菌在平板上生長旺盛，抑制了沙門氏菌的生長。根據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)［1］，BPW增菌液培養(yǎng)時(shí)間為8～18 h，在BPW增菌液培養(yǎng)8 h后發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌與溫和氣單胞菌、楊氏檸檬酸桿菌在42℃生長良好，而在36℃均不生長；而在BPW增菌液培養(yǎng)18 h后，沙門氏菌和這兩種干擾菌在不同溫度均生長良好。說明在日常檢驗(yàn)中，增菌液培養(yǎng)時(shí)間越長，沙門氏菌的生長越好。

2.4血清學(xué)鑒定結(jié)果

2種沙門氏菌和5種干擾菌的血清學(xué)鑒定結(jié)果見表1。本次試驗(yàn)中，甲型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、奇異變桿菌和楊氏檸檬酸桿菌均與沙門氏菌屬A-F多價(jià)O診斷血清發(fā)生凝集，弗氏檸檬酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、溫和氣單胞菌不發(fā)生凝集，生理鹽水對照均不自凝。

表1　　沙門氏菌及干擾菌培養(yǎng)24 h后的菌落特征、TSI培養(yǎng)情況及血清學(xué)鑒定結(jié)果Table 1　Characteristics of the colony of Salmonella and interferential strains after culturing for 24 h，the findings of culturing TSI and the results of identifying Salmonella

3結(jié)語

第一，在用選擇性平板進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)同時(shí)采用兩種以上平板，建議采用沙門顯色平板。在觀察到可疑菌落時(shí)，應(yīng)選取多種形態(tài)的可疑菌落再次劃選擇性平板（最好是沙門顯色平板），初篩可疑菌的同時(shí)又分純菌株，一舉多得。如楊氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌在HE平板、XLD平板上的菌落特征與沙門氏菌一致，但在其他平板上的菌落特征與沙門氏菌有明顯區(qū)別。顯色平板使用準(zhǔn)確率高，但不能完全依賴顯色平板，如溫和氣單胞菌在顯色平板上顯紫色菌落，與沙門氏菌一致。因此，在檢驗(yàn)沙門氏菌時(shí)不能以單個(gè)平板的菌落特征來判定沙門氏菌，應(yīng)結(jié)合多個(gè)平板的菌落特征來判定，可以累積經(jīng)驗(yàn)，減少誤判，提高檢出率。

第二，在增菌液、平板等培養(yǎng)過程中，應(yīng)注意持續(xù)觀察，必要時(shí)可延長培養(yǎng)時(shí)間，減少誤判。通過對增菌液培養(yǎng)的不同階段劃平板，發(fā)現(xiàn)增菌液培養(yǎng)時(shí)間越長，沙門氏菌的生長越好；而培養(yǎng)時(shí)間越短，干擾菌的生長比沙門氏菌旺盛，沙門氏菌的生長受到抑制。BS平板需要經(jīng)過培養(yǎng)48 h才能觀察到明顯的菌落特征。甲型副傷寒沙門氏菌在培養(yǎng)24 h后觀察不到產(chǎn)H2S現(xiàn)象，而在培養(yǎng)48 h后，能觀察到明顯的產(chǎn)H2S現(xiàn)象。這與相關(guān)文獻(xiàn)的介紹一致，大多數(shù)培養(yǎng)物對所列培養(yǎng)基在培育1 d或2 d后，通常在24 h內(nèi)得到陽性反應(yīng)。有極少例外，遲緩反應(yīng)在3～7 d內(nèi)出現(xiàn)。甲型副傷寒沙門氏菌產(chǎn)生H2S是微弱的［5］。粘質(zhì)沙雷氏菌在TSI斜面上培養(yǎng)48 h后，TSI斜面會由黃色變回紅色，這是因?yàn)檎迟|(zhì)沙雷氏菌會產(chǎn)生紅色素［5］。因此及時(shí)觀察掌握細(xì)菌的培養(yǎng)特征是特別重要的。

第三，在沙門氏菌檢驗(yàn)中不能以產(chǎn)H2S作為判定沙門氏菌的惟一依據(jù)。在堿性條件下，硫代硫酸鈉及檸檬酸鐵銨與沙門氏菌產(chǎn)生的H2S反應(yīng)使得菌落的顏色呈黑色，但在酸性條件下這種反應(yīng)被抑制［6］。而粘質(zhì)沙雷氏菌能利用蔗糖大量產(chǎn)酸，使HE、XLD平板變黃，因此，鼠傷寒沙門氏菌與粘質(zhì)沙雷氏菌在XLD上共同培養(yǎng)，會因?yàn)檎迟|(zhì)沙雷氏菌大量產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基呈酸性條件，H2S反應(yīng)被抑制。同理，H2S反應(yīng)也可因其它干擾菌產(chǎn)酸而被抑制。粘質(zhì)沙雷氏菌在水產(chǎn)品、動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的沙門氏菌檢驗(yàn)中經(jīng)常被檢出，更應(yīng)提高警惕。

第四，診斷血清主要用于分型，準(zhǔn)確的沙門氏菌鑒定應(yīng)以生化試驗(yàn)輔以血清學(xué)試驗(yàn)。奇異變形桿菌、檸檬酸桿菌的A-F沙門氏菌屬診斷O多價(jià)血清試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，為交叉凝集，其生化鑒定結(jié)果與沙門氏菌屬不符合，結(jié)合平板菌落特征及TSI的培養(yǎng)情況，判定這兩種菌均非沙門氏菌。腸桿菌科細(xì)菌是常見的微生物，其屬、種較多，該科有30個(gè)屬115個(gè)種，抗原構(gòu)造復(fù)雜，其不同屬、種間細(xì)菌抗原有部分相同，甚至少數(shù)種完全相同，因此細(xì)菌與診斷血清間交叉凝集反應(yīng)現(xiàn)象甚為普遍［7］。曾有文獻(xiàn)報(bào)道過沙門菌診斷血清與奇異變形桿菌、檸檬酸桿菌呈交叉凝集反應(yīng)［8-9］。檸檬酸桿菌與沙門氏菌診斷血清的交叉反應(yīng)表明，它一方面與檸檬酸細(xì)菌屬有關(guān)，另一方面與沙門氏菌屬、亞利桑那菌屬和埃希氏菌屬有關(guān)［10］。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：1-4.

［2］楊正時(shí)，房海.人及動(dòng)物病原細(xì)菌學(xué)［M］.石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，2003：497-502.

［3］蘇世彥.食品微生物檢驗(yàn)手冊［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1998：107.

［4］呂志平.國內(nèi)外技術(shù)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)中食品微生物限量［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002：1-371.

［5］劉云國.食品衛(wèi)生微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜［M］.北京：科學(xué)出版社，2008：26.

［6］王嵐，賈華云，張林清，等.能與沙門菌及O157診斷血清交叉凝集的細(xì)菌分離與鑒定［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（8）：1966-1968. WANG Lan，JIA Huayun，ZHANG Linqing，et al.Isolation and identification of the bacteria interacted agglutination with Salmonella and Escherichia coli O157［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2011，21（8）：1966-1968.（in Chinese）

［7］張?jiān)?，鐘小東，王順東，等.三株與沙門菌有共同抗原的奇異變形桿菌的檢出與分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2003，13（6）：788-789. ZHANG Yuanling，ZHONG Xiaodong，WANG Shundong，et al.Detection and analysis of three strains of Proteus mirabilis has the common antigen with Salmonella［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2003，13（6）：788-789.（in Chinese）

［8］周旭，吳曉勵(lì)，婁美秀，等.兩株與沙門B群及F群診斷血清交叉凝莫的弗勞地拘櫞酸桿菌［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，200l，11 （2）：207. ZHOU Xu，WU Xiaoli，LOU Meixiu，et al.Two strains of Citrobacter freundii Cross-agglutination with Salmonella group B and Salmonella group F［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，200l，11（2）：207.（in Chinese）

［9］R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等.伯杰細(xì)菌鑒定手冊［M］.第八版，北京：科學(xué)出版社，1984：391.

Analysis of the Determination of Salmonella of Contrast Experiment Among Laboratories

CHEN Donge，CHEN Guanwu，XU Rusu，SU Jianhui，LIN Ningjing
（Center of Technology，Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou 515041，China）

Combining the standard bacteria of Salmonella typhimurium and Salmonella paratyphi respectively with five other Enterobacter bacterium which are common in the usual determination to form into 10 groups of modal Bacteria-bearing Peeled Prawms，isolating and identifying them under thefollowingpresentstandards：GB4789.4-2010，NationalfoodsafetystandardFood microbiological examination：Staphylococcus aureus.All the standard bacteria of Salmonella and the Enterobacter bacterium can be exactly detected from the 10 groups of test samples.The experiment shows that the characteristics of the colony on the BS would be more evident after culturing for 48h. And the longer the enriched culture cultures，the better the Salmonella grows.Salmonella paratyphi produces a little of H2S.Serratia marcescens inhibits the H2S-reaction of Salmonella paratyphi. Anti-O polyvalent serum of A-F of Salmonella can agglutinates Proteus mirabilis and Citrobacter spp.The determination techniques found in the test would be applied well in the determination of Salmonella for the aquatic products，animals and animal products.

salmonella，Enterobacter bacterium，plate，H2S，serology

TS 207

A

1673—1689（2016）05—0556—04

2014-09-17

陳冬娥（1984—），女，助理工程師，主要從事出入境食品微生物檢驗(yàn)及動(dòng)物疫病檢疫方面的研究。E-mail：819522338@qq.com