一株高產(chǎn)2-苯乙醇酵母菌的篩選及鑒定

黃筱萍，劉　蘭，熊大維，黃國昌

（江西省科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌330029）

一株高產(chǎn)2-苯乙醇酵母菌的篩選及鑒定

黃筱萍，劉蘭，熊大維，黃國昌

（江西省科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌330029）

從24株不同來源的酵母菌中分離篩選出一株對2-苯乙醇耐受性強、生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力高的優(yōu)良菌株SH003，該菌株能在含有4 g/L的2-苯乙醇培養(yǎng)基中生長，在優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下，轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇質(zhì)量濃度達4.31 g/L，生成速率為0.18 g/（L·h），L-苯丙氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為72.4%，經(jīng)菌落特征、菌體形態(tài)分析、生理生化試驗，結(jié)合18S rDNA序列分析，由系統(tǒng)發(fā)育樹表明它與釀酒酵母親緣關(guān)系最近，確定該菌株為Saccharomyces cerevisiae。

2-苯乙醇；釀酒酵母；菌株篩選和鑒定；18S rDNA

2-苯乙醇（2-phenylethanol，2-PE）是一種具有玫瑰花香的芳香醇，其作為主香和底香廣泛應(yīng)用于食品香精、化妝品洗滌產(chǎn)品等日化產(chǎn)品中。此外，它還是重要的醫(yī)藥中間體，是合成苯乙醇苷、羥基苯乙醇的前體，作為精細(xì)化工中間體用于合成苯乙烯［1］。目前，全球2-苯乙醇年產(chǎn)量近萬噸，基本采用化學(xué)合成法生產(chǎn)。其產(chǎn)品大都含有難聞的有毒副產(chǎn)物，如聯(lián)二苯、二氯代乙苯、氯二醇等。隨著人們對天然香料的需求增多，從植物中主要是玫瑰精油中萃取獲得的天然2-苯乙醇已遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。2-苯乙醇是微生物代謝產(chǎn)物，它是一些發(fā)酵食品如面包、葡萄酒、干酪的自然產(chǎn)物，采用微生物生產(chǎn)2-苯乙醇生產(chǎn)周期短、原料便宜，具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛在能力，通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2-苯乙醇已獲得廣泛關(guān)注。

酵母細(xì)胞合成2-苯乙醇途徑主要有兩條：一是通過合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑合成，二是通過艾氏途徑（Ehrlich pathway），即L-苯丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成苯丙酮酸，再脫羧形成苯乙醛后，經(jīng)氧化脫氫作用生成2-苯乙醇，通過添加前體物質(zhì)L-苯丙氨酸使2-苯乙醇的產(chǎn)量大幅提高［2］。大多數(shù)酵母具有從頭合成或轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸為2-苯乙醇的能力，如馬克斯克魯維酵母［3］、發(fā)酵畢赤酵母［4］、乳酸克魯維酵母、釀酒酵母及異常漢遜酵母等［5］，但通常產(chǎn)率較低，主要是嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制成為酵母合成轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的瓶頸。因此篩選對2-苯乙醇耐受性好、轉(zhuǎn)化率高的菌株成為國內(nèi)外持續(xù)研究開發(fā)的關(guān)鍵。Etschmann M［6］等以工業(yè)廢糖蜜為碳源，L-苯丙氨酸為前體，從14株酵母菌中篩選出2株高產(chǎn)菌，采用原位分離技術(shù)，2-苯乙醇產(chǎn)量達到3 g/L。Eshkol等［7］通過對Ye9系類菌種的篩選，得到2株對于2-苯乙醇耐受性高的菌株，在補料分批發(fā)酵72 h后，2-苯乙醇質(zhì)量濃度達4.5 g/L。唐育岐等［8］從9株酵母菌中篩選出一株2-苯乙醇產(chǎn)量達1.688 g/L的釀酒酵母，通過培養(yǎng)基優(yōu)化，2-苯乙醇產(chǎn)量達4.402 5 g/L。崔志峰等［9］采用紫外誘變等方法篩選出一株對2-苯乙醇耐受性和產(chǎn)量較高的釀酒酵母突變株，2-苯乙醇的耐受性和產(chǎn)率分別提高了50%和9.1%。王航等［10］從8株酵母菌株中2-苯乙醇產(chǎn)量達1.48 g/L的釀酒酵母，通過紫外誘變和原生質(zhì)融合，獲得一株2-苯乙醇產(chǎn)量達2.51 g/L的突變株。榮紹峰［11］篩選出一株釀酒酵母菌種，在優(yōu)化的條件下2-苯乙醇產(chǎn)量達3.2 g/L，梅建風(fēng)等［12］通過紫外誘變選育出一株釀酒酵母突變株，轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇產(chǎn)量達5.4 g/L。通過從自然界中分離篩選酵母菌，以及從不同來源的酵母菌株中進行2-苯乙醇的耐受性的篩選和對L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力的研究，篩選到一株對2-苯乙醇耐受性高、產(chǎn)率高的酵母菌株，并對它進行了鑒定。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1樣品采集和菌種來源市售不同產(chǎn)地葡萄，酒廠泥窖，土壤，市售酵母干粉，外購菌種。

1.1.2培養(yǎng)基

1）斜面及保藏培養(yǎng)基（g/L）：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

2）篩選培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖30，酵母粉1，KH2PO45，MgSO40.2，2-苯乙醇2，瓊脂粉 18；pH 6.5～6.7。2-苯乙醇于培養(yǎng)基滅菌后加入。

3）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母粉3，麥芽汁3；pH自然。

4）初篩轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖60，酵母粉3，L-苯丙氨酸6，KH2PO45，MgSO40.2；L-苯丙氨酸于培養(yǎng)基滅菌后加入。

5）轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100，酵母粉5，L-苯丙氨酸8；復(fù)合無機鹽營養(yǎng)液2 mL。L-苯丙氨酸于培養(yǎng)基滅菌后加入。

1.1.3主要試劑L-苯丙氨酸：河北冀海生物科技有限公司，純度99.5%；2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司，純度99.0%；甲醇：色譜純；超純水自制，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器

Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測器，Agilent HC-C18反相色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），Olympus BX53顯微鏡，呈像系統(tǒng)DP80，Sartorius prachfum 224-1CN分析天平。

1.3實驗方法

1.3.1酵母菌的篩選和分離純化取不同來源的樣品，分別接入含有2-苯乙醇的篩選培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，取0.1 mL富集后的菌液進行梯度稀釋度，涂布于篩選培養(yǎng)基平板中，于28℃培養(yǎng)24～48 h，挑選不同的單菌落劃線純化并鏡檢，將純化的酵母菌接種麥芽汁斜面中，28℃培養(yǎng)48 h，4℃冰箱保存。

1.3.2種子液培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化從斜面菌種中挑取少量菌苔接種于30 mL種子培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，再按10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于含有L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中，于28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)化液于10 000 r/min離心10 min，上清液采用高效液相色譜法檢測L-苯丙氨酸和2-苯乙醇質(zhì)量濃度。

1.3.3酵母菌對2-苯乙醇耐受性試驗斜面培養(yǎng)基滅菌后，加入2-苯乙醇使其在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度分別為0、1、2、3、3.5、4、5 g/L，用無菌量杯準(zhǔn)確量取20 mL培養(yǎng)基，倒入直徑10 cm的平皿中，制成厚度均一的篩選培養(yǎng)基平板。從待測菌株的斜面上取一環(huán)菌苔至含有玻璃珠的50 mL無菌水中，振蕩均勻，制成菌懸液，稀釋涂平板，于28℃培養(yǎng)3 d后進行菌落計數(shù)。

1.3.4反相高效液相色譜法測定L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加純水稀釋1倍，用0.22 μm濾膜過濾。樣品于HPLC分析，流動相為V甲醇∶V水=50%∶50%，流速為1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

1.3.5酵母菌形態(tài)特征及生理生化鑒定利用顯微鏡及觀察固體平板上的菌落形態(tài)，并根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》［13］所列的酵母菌鑒定方法進行生理生化鑒定。生理生化鑒定主要為碳源同化、氮源同化和其它特定的生理生化試驗等。

1.3.618S rDNA的擴增、測序和系統(tǒng)樹的構(gòu)建提取SH003菌株的基因組DNA，以引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGC AGGTTCACCTACGGA-3'）擴增18S rDNA。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min預(yù)變性；94℃30 s變性，54℃30 s退火，72℃2 min延伸，35個循環(huán)；72℃10 min延伸，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在北京諾禾致源生物信息科技公司完成測序。

將測序獲得18S rDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索，從數(shù)據(jù)庫中獲得高相似性的18S rDNA序列，下載相關(guān)菌種的18S rDNA序列，與供試菌株的序列一同用Clustal1.83軟件進行多序列完全比對，結(jié)果采用MEGA5.2中的鄰接法（Neihbor-Joining tree）進行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對進化樹進行1 000次可信度分析。

2結(jié)果與討論

2.1生物轉(zhuǎn)化合成2-PE菌株的初篩

從篩選平皿中挑選出24株菌株，經(jīng)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)觀察，初步確定這些菌株均為酵母菌，分離純化后，將這些酵母菌分別接種于初篩轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中，于28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，以篩選合成轉(zhuǎn)化2-苯乙醇能力較高的菌株，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，檢測轉(zhuǎn)化液中的2-苯乙醇質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。

初篩結(jié)果表明，所分離的酵母菌合成轉(zhuǎn)化2-PE的能力差異較大，有3株2-苯乙醇產(chǎn)量達2.5～3.2 g/L，13株2-苯乙醇產(chǎn)量為1.0～2.8 g/L，8株2-苯乙醇產(chǎn)量低于1 g/L。其中菌株SH003顯示出最高的2-苯乙醇合成能力，其產(chǎn)量達3.15 g/L，轉(zhuǎn)化率為70.74%。圖1為菌株SH003的發(fā)酵上清液的HPLC圖譜。

表1　　不同酵母菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇質(zhì)量濃度和摩爾轉(zhuǎn)化率Table 1　2-PE concentration and molar yield in screening process by different yeast

圖1 菌株SH003轉(zhuǎn)化液HPLC圖譜Fig.1　HPLC of 2-phenylethanol from the transformed reaction solution of strain SH003

2.2菌株對2-苯乙醇耐受性試驗

對產(chǎn)2-苯乙醇高于1 g/L的19株菌進行2-苯乙醇耐受性平板試驗，在篩選培養(yǎng)基中加入1～5 g/L 的2-苯乙醇，分別用菌懸液涂布接種后，于30℃培養(yǎng)3 d。19株菌均能在含2 g/L的平皿中生長，在高于2 g/L的平板中其生長明顯受到抑制，菌落變小，培養(yǎng)72 h有3株能在含3 g/L的2-苯乙醇平皿上生長，當(dāng)質(zhì)量濃度達到4 g/L以上時，基本上無菌落形成。菌株SH003在3.5 g/L的平板中生長良好，在4.0 g/L的平板上亦有少量菌生長，對2-苯乙醇的耐受性明顯高于其它2株酵母菌。表2為對2-苯乙醇耐受性最強的3株菌株的結(jié)果。

表2　　不同2-苯乙醇質(zhì)量濃度平板中酵母菌落數(shù)Table　2　Colony　forming　units　ofyeastin　dishes containing different concentration of 2-PE

2.3酵母菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力試驗

將初篩中對2-苯乙醇耐受性較高，轉(zhuǎn)化能力較高的3株酵母菌株，接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，于28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，2-苯乙醇產(chǎn)率見表3。

表3　　不同酵母菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇質(zhì)量濃度和摩爾產(chǎn)率Table 3　2-phenylenthanol concentration and molar yield by different yeast

在提高轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸底物質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度后，各菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇質(zhì)量濃度均有很大提高，其中對2-苯乙醇耐受性最高的菌株SH003產(chǎn)率最高，產(chǎn)2-苯乙醇質(zhì)量濃度達4.3 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達72.4%。這表明菌株對產(chǎn)物的耐受性越高，其生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的能力越強。

2.4菌株形態(tài)特征觀察

菌株SH003在麥芽汁瓊脂平板中于28℃培養(yǎng)48 h，其菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征見圖2及表4。

圖2　　酵母SH003形態(tài)特征Fig.2　Morphologic characteristic of yeast SH003

表4　酵母SH003的形態(tài)特征Table 4　Morphology characteristics of yeast SH003

2.5生理生化鑒定

根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》和《食品微生物實驗技術(shù)》等相關(guān)方法，生理生化鑒定主要進行了碳源同化、氮源同化和其它生理生化實驗，采用廣東省微生物研究所購買的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae GIM2.45（ATCC AS2.119）作為模式種，每個菌株分別作3個重復(fù)，結(jié)果見表5。

表5　S.cerevisiae GIM2.45與菌株SH003部分生理生化特征Table 5　Some physiological and biochemical characteristics of S.cerevisiae GIM2.45 and strain SH003

菌株SH003碳源同化實驗中棉子糖同化為陽性，而菌株Saccharomyces cerevisiae GIM2.45棉子糖同化為陰性，其它生理生化特性均相同，從鑒定手冊中亦列舉了部分釀酒酵母可利用棉子糖。

2.618S rDNA序列分析

測序結(jié)果表明，該菌株18S rDNA序列共1 039 bp。在NCBI中進行BLAST，結(jié)果表明，它與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的18S rDNA序列同源性最高，達99.0%。菌株SH003的18S rDNA序列與S.cerevisiae MA09AN菌株的序列只有3個堿基的差別。用ClustalX+MEGA5.2建立SH003的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，菌株SH003與S.cerevisiae KMS0510和 S.cerevisiae MA09-AN同源性最高，可以確定酵母菌SH003歸屬于S.cerevisiae。

圖3　　基于菌株SH00318S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3　Phylogenetic tree of stain SH003 on its 18S rDNA

3結(jié)語

酵母菌在自然界分布廣泛，很多酵母菌都有轉(zhuǎn)化生成2-苯乙醇的能力，但不同酵母菌株中轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的能力差別很大。從不同產(chǎn)地的市售葡萄、酒廠窖泥、市售干酵母中分離出的17株酵母菌和不同來源的7株酵母菌中篩選到3株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力較高的菌株，通過對2-苯乙醇耐受性和對2-苯乙醇合成能力測試，發(fā)現(xiàn)酵母菌對2-苯乙醇的耐受性越強，其轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的能力越高，為從自然界中快速分離獲得2-苯乙醇高產(chǎn)菌株提供一種高效便捷的方法。從葡萄果皮中分離的菌株SH003對2-苯乙醇的耐受性最強，在含有4 g/L 的2-苯乙醇培養(yǎng)基中亦能生長，在L-苯丙氨酸底物質(zhì)量濃度為8 g/L時，轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇質(zhì)量濃度為4.31 g/L，生成速率為0.18 g/（L·h），摩爾轉(zhuǎn)化率為72.4%，該菌株的成功選育為后續(xù)生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的研究和生產(chǎn)提供了很好的菌種來源。

通過形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定，菌株SH003的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性均與釀酒酵母相符，通過18S rDNA序列分析，菌株SH003與釀酒酵母同源性最高，可確定其為釀酒酵母。

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Screening and Identification of High-Yield Strain for 2-Phenylethanol

HUANG Xiaoping，LIU Lan，XIONG Dawei，HUANG Guochang
（Institution of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029，China）

A strain designated as SH003 with high 2-phenylethanol tolerance and bioconversion properties was selected from 24 yeast strains with different sources.It could grow in the medium containing 4 g/L 2-phenylethanol.Under the optimized conditions，the production and productivity of 2-phenylethanol respectively reached to 4.31 g/L and 0.18 g/（L·h）.The molar conversion rate of L-phenylalanine to 2-phecylethanol was 72.4%.Identified by the morphological and physiological characteristics and its 18S rDNA sequence，strain SH003 was closely related with Saccharomyces cerevisiae on phylogenesis.

2-phenylethanol，Saccharomyces cerevisiae，screening and identification，18S rDNA

TQ 92

A

1673—1689（2016）05—0531—06

2014-11-14

江西省重點科技支撐計劃項目（20133BBE50018）；江西省科研院所基礎(chǔ)設(shè)施配套項目（20151BBA13031）。
*

黃筱萍（1965—），女，江西南昌人，理學(xué)碩士，研究員，主要從事生物發(fā)酵、活性物質(zhì)提取精制方面的研究。Email：plahxp@163.com