益智仁-烏藥醚提取物對(duì)糖尿病腎病氧化應(yīng)激Mn-SOD、MDA影響實(shí)驗(yàn)研究

梁　薇，譚年花，潘子怡，謝毅強(qiáng)，韋　祎（海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?71199）

益智仁-烏藥醚提取物對(duì)糖尿病腎病氧化應(yīng)激Mn-SOD、MDA影響實(shí)驗(yàn)研究

梁薇，譚年花，潘子怡，謝毅強(qiáng)，韋祎
（海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?71199）

目的：探討不同濃度益智仁-烏藥醚提取物對(duì)糖尿病腎病大鼠的抗氧化應(yīng)激作用。方法：SD大鼠高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射造模4 w。隨機(jī)分為空白組、益智仁-烏藥醚提取物高、中、低劑量組，西藥組、模型組6組，每組10只。給藥4 w后用ELISA法檢測(cè)各組大鼠Mn-SOD，TBA法檢測(cè)MDA。結(jié)果：與模型組比較，益智仁-烏藥醚提取物各劑量組及西藥組Mn-SOD明顯升高（P＜0.01），MDA明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），且作用與西藥纈沙坦相當(dāng)。結(jié)論：益智仁-烏藥醚提取物可能通過(guò)升高SOD，降低MDA防治糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，并延緩了糖尿病腎病的進(jìn)展。

糖尿病腎??；益智仁-烏藥醚提取物；Mn-SOD；MDA

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是糖尿病常見(jiàn)的難治性并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為蛋白尿、高血壓、腎功能進(jìn)行性下降，終末期時(shí)出現(xiàn)尿毒癥癥狀。調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)糖尿病的患病率為9.7%，其中20%～40%會(huì)發(fā)生糖尿病腎病，由DN引發(fā)的終末期腎病（ESRD）是威脅糖尿病患者生命的主要原因，最終有5%～10%的糖尿病患者死于腎病。中醫(yī)藥目前已成為安全有效的治療DN的途徑之一。

“藥對(duì)”（或稱對(duì)藥）是一種相對(duì)固定的組方單位，也是復(fù)方配伍中最基本的單位。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、丙二醛（MDA）的方法，探討不同濃度益智仁-烏藥醚提取物對(duì)STZ造模的糖尿病腎病大鼠的抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而以確定其療效性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，8 w齡，體重（180±20）g。長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，無(wú)不良反應(yīng)即進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑與儀器腺嘌呤、纈沙坦、大鼠SOD ELISA檢測(cè)試劑盒、大鼠TBA檢測(cè)試劑盒；離心機(jī)；AF240電子天平（中國(guó)瑞士梅勒公司）；酶標(biāo)儀（上海閃普）。干燥合格的益智種仁和烏藥塊根。

1.2方法

1.2.1藥物的提取益智、烏藥按1∶1比例進(jìn)行常規(guī)水煎3次，收集濃縮液得干浸膏；另取水煎液依次用石油醚（60℃～90℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，分離各層，并分別減壓回收溶劑，即得各部位。取石油醚部位浸膏，將其配制成含5%Twen-80的穩(wěn)定的混懸液備用。并根據(jù)該部位的出膏率，制備成折合1g生藥/mL的藥液備用。

1.2.2造模50只SD大鼠高糖高脂飲食聯(lián)合40 mg/kg的STZ腹腔注射，然后分別給予高能量飲食（包括高糖、高脂、高糖高脂飲食）飼喂4 w誘發(fā)大鼠胰島素抵抗，解剖部分DN模型可發(fā)現(xiàn)大鼠早期腎臟病變?yōu)榧?xì)胞外基質(zhì)積聚，出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)增多、系膜區(qū)明顯增寬，以此確定造模成功。另取10只作為空白組，正常喂養(yǎng)。

1.2.3分組及給藥造模成功的SD大鼠給藥處理喂養(yǎng)8 w，隨機(jī)分為益智仁-烏藥高劑量組、中劑量組、低劑量組，西藥組、模型組5組，每組10只。低劑量、中劑量、高劑量（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）分別給予益智仁-烏藥石油醚提取物，西藥組纈沙坦20 mg/kg。另設(shè)空白組，不給予干預(yù)。給藥4 w后，取血清備用。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠在層流柜中飼養(yǎng)，所有器具及食物均消毒，無(wú)菌操作。小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持墊料干燥，12h交替照明。每2 w測(cè)體重、血糖。

1.2.4檢測(cè)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，處死前12h禁食不禁水，以葡萄糖氧化酶法鼠尾毛細(xì)血管取血測(cè)空腹血糖（FBG）后，按2 mL/kg體重腹腔注射8%異戊巴比妥鈉麻醉后固定四肢，取腹部正中切口，在腹主動(dòng)脈插入無(wú)菌空針采血3～5 mL，血液標(biāo)本以3 000 rpm離心15min，分離血清，取上清液，-20℃保存待測(cè)腎功等。

用ELISA法按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD。實(shí)驗(yàn)操作步驟：稱取植物組織0.5g先加入2.5 mL PBS，研磨勻漿后，再加入2.5 mL PBS混勻，4℃下10 000 r/min離心15min上清液即為粗酶液。取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。取10 mL小燒杯7只，3只測(cè)定樣品，4只作為對(duì)照，將上述試劑混勻后，1只對(duì)照燒杯置于暗處，另3只對(duì)照燒杯和樣品一起置于4 000 lx日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光一致，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)），最后在560 nm處測(cè)定反應(yīng)液的光密度。以不照光的對(duì)照燒杯作參比，分別測(cè)定其他各管的光密度。

蛋白含量的測(cè)定：步驟1的上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量。

TBA法檢測(cè)MDA。取0.5 mL腎組織剪碎勻漿液于10 mL試管，加入2 mL 0.6%的TBA。保鮮膜封口，扎一小孔沸水浴15min，取出后流水冷卻，以10 000 rpm離心10min，取上清液測(cè)450 nm，532 nm和600 nm的吸光值。換算公式：C （μmol/L）=6.45×（A532-A600）-0.56×A450

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1益智仁-烏藥醚提取物對(duì)糖尿病腎病大鼠Mn-SOD的影響

與空白組相比，模型組大鼠Mn-SOD含量明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，其余各組大鼠的Mn-SOD均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），高劑量組與西藥組的效果接近。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2益智仁-烏藥醚提取物對(duì)糖尿病腎病MDA的影響

與空白組相比，模型組大鼠MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，其余各組大鼠的MDA都降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　益智仁-烏藥醚對(duì)糖尿病腎病Mn-SOD，MDA的影響?。é蘭ol/L，±s）

表1　益智仁-烏藥醚對(duì)糖尿病腎病Mn-SOD，MDA的影響?。é蘭ol/L，±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

組別　Mn-SOD　MDA西藥組　65.40±5.432）　8.45±0.272）模型組　45.29±4.581）　8.94±0.521）益智仁-烏藥高劑量　69.24±5.123）　8.17±0.353）益智仁-烏藥中劑量　62.35±4.583）　8.51±0.292）益智仁-烏藥低劑量　55.23±4.442）　8.71±0.422）

3討論

糖尿病腎病是與長(zhǎng)期糖尿病相關(guān)的進(jìn)行性腎臟損傷，病變累及腎小球、腎小動(dòng)脈、腎小管及間質(zhì)組織，臨床上以持續(xù)蛋白尿?yàn)橹饕卣鳎橛心I小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降，導(dǎo)致終末期腎病，最終需要透析或腎臟移植［1］。益智仁性溫，味辛，具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾的功能，化學(xué)成分多樣，其神經(jīng)保護(hù)作用、抗炎作用和抗老年癡呆作用是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［2］。前期研究證實(shí)，石油醚部位是益智仁抗糖尿病腎病的有效部位［3］。烏藥為樟科植物，性味辛溫，歸肺、脾、腎、膀胱經(jīng)，具有行氣止痛、溫腎散寒、縮尿止遺的作用?，F(xiàn)代研究證實(shí)，烏藥具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑菌、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)消化道、松弛內(nèi)臟平滑肌、改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、調(diào)理婦科聯(lián)病等藥理作用［4］。

“藥對(duì)”（或稱對(duì)藥）是一種相對(duì)固定的組方單位，也是復(fù)方配伍中最基本的單位。藥對(duì)是最簡(jiǎn)單的復(fù)方，雖無(wú)君、臣、佐、使的完整性，但其藥簡(jiǎn)力捷，也能體現(xiàn)方劑配伍中的陰陽(yáng)、君臣、補(bǔ)瀉等關(guān)系［5］。益智仁和烏藥的藥對(duì)是來(lái)源于《婦人良方》縮泉丸的主要組成部分，烏藥以行散為主，益智仁以溫補(bǔ)收攝為要。二藥伍用，在臨床上對(duì)于腎陽(yáng)虛DN多尿的患者有較好的療效［6-7］。參照文獻(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)成功獲得糖尿病腎病的大鼠模型。由于迄今為止了解到的DN發(fā)病的機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為DN的發(fā)病機(jī)制與糖代謝紊亂及由此所致的非酶糖化、多元醇通路激活、蛋白激酶C激活、脂代謝紊亂、高血壓所致腎血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、血管活性物質(zhì)及細(xì)胞因子、遺傳因素等多種因素有關(guān)［8-11］。超氧化物歧化酶（Supemxide dismutase，SOD）是衡量自由基基礎(chǔ)代謝狀態(tài)的主要指標(biāo)，而血清中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平通?？煞从臣?xì)胞和組織內(nèi)氧化損傷情況。由于近年來(lái)，大量研究報(bào)道SOD活性降低和MDA含量增高在多種器官腫瘤組織中和組織增生性疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有重要意義，并認(rèn)為這種氧自由基的產(chǎn)生和清除平衡的失調(diào)與各種腺體合成和分泌激素有關(guān)。SOD和MDA在腎上腺皮質(zhì)疾病患者血清和組織中表達(dá)異常，聯(lián)合檢測(cè)SOD、MDA可能為腎上腺皮質(zhì)疾病進(jìn)行鑒別診斷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)未用藥的模型組受到SOD的損害，而用藥的高劑量組有效干預(yù)了大鼠的腎避免氧化損害，故表明益智仁-烏藥醚提取物高劑量對(duì)于延緩糖尿病腎病的進(jìn)展有明顯作用。

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（編輯：張世霞）

Experimental study of the ether extract of the Yizhiren-Wuyao on expression of Mn-SOD，MDA in rats with diabetic nephropathy

Liang Wei，Tan Nianhua，Pan Ziyi，Xie Yiqiang，Wei Yi
（Hainan Medical College，Haikou Hainan 571199）

Objective：To observe anti-oxidative stress of ether extract with different concentrations of fructus alpiniae oxyphyllae，radix linderae in rats with diabetic nephropathy（DN）.Methods：DN rat models were established by feeding with high glucose and high-fat diet combined with streptozotocin intraperitoneal injection for 4 weeks.Rats were randomly divided into blank group，Low，medium and high dose of ether extract of the Yizhiren-Wuyao groups，western medicine group and model group.After intragastric administration for 4 weeks，the content of Mn-SOD，MDA in serum were detected.Results：Compared with model group，Mn-SOD was increased，MDA was decreased in Yizhiren-Wuyao ether extracts groups and western medicine group（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion：The curative effect of ether extract of the Yizhiren-Wuyao on diabetic nephropathy may be related to it's influence on content of SOD，MDA.

diabetic nephropathy（DN）；ether extract of Yizhiren-Wuyao；Mn-SOD；MDA

R285

A

1671-0258（2016）03-0020-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81473618）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（812186）；海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)（ZY201332）；海口市重點(diǎn)科技項(xiàng)目（2013-50）；海南省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年骨干教師項(xiàng)目（2013）；海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（HYCX201307）

梁薇，醫(yī)學(xué)學(xué)士，E-mail：362303450@qq.com

韋祎，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：SUE0900CN@163.com