柿葉不同有效部位對鏈脲佐菌素致2型糖尿病大鼠糖代謝的影響

曹 旭，童圣靈，趙 雷

柿葉不同有效部位對鏈脲佐菌素致2型糖尿病大鼠糖代謝的影響

曹 旭，童圣靈，趙 雷

目的 研究柿葉不同溶劑萃取部位對2型糖尿病大鼠糖代謝的影響，以尋找柿葉降血糖作用的有效部位。方法 雄性SD大鼠隨機選擇8只作為正常對照組，其余72只高脂高糖飼料喂養(yǎng)1個月后，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）30 mg/kg，建立2型糖尿病模型。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、鹽酸二甲雙胍組（0.11 g/kg）、石油醚萃取物組、二氯甲烷萃取物組、乙酸乙酯萃取物組和萃余物組，連續(xù)灌胃給藥28 d（對照組、模型組灌胃等體積蒸餾水），1次/d。于給藥前及給藥7、14、21、28 d測定各組體重及空腹血糖值（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），末次給藥后眼眶取血測定糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS），計算胰島敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）和穩(wěn)態(tài)模型評估法（homeostasis model assessment，HOMA）計算胰島素抵抗（Homa insulin resistance，HOMA-IR）指數(shù)。結(jié)果 （1）與模型組比較，柿葉二氯甲烷萃取物及萃余物均能夠降低 FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR指數(shù)，并升高ISI，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；（2）二氯甲烷萃取物組在給藥7、14 d后FBG及末次給藥后HbA1c、FINS較鹽酸二甲雙胍組無統(tǒng)計學(xué)差異，但Homa-IR指數(shù)、ISI與其比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論 柿葉二氯甲烷萃取物可能是柿葉降血糖的主要藥效部位。

柿葉；萃取物；2型糖尿病大鼠；糖代謝

柿葉為柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬Diospyros L.植物柿D. kaki Thunb.的新鮮或干燥葉［1］，具有清熱解毒、潤肺強心、鎮(zhèn)咳止血、抗癌防癌等作用［2］。柿葉作為藥用始載于明朝《滇南本草》，曰“經(jīng)霜葉敷臁瘡”；《本草再新》記載用于“治咳嗽吐血，止渴生津”；以后諸家本草及醫(yī)（藥）書也多有收載。現(xiàn)代藥理研究也表明柿葉具有良好的降血糖效果［3-6］。本研究從糖代謝角度對柿葉不同溶劑萃取部位對糖尿病大鼠糖代謝的影響進行探討，旨在探尋柿葉在糖尿病模型中具有降糖作用的主要有效部位，為降糖新制劑的開發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 柿葉采集于江蘇省揚中市，經(jīng)江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司酈紅巖高級工程師鑒定為植物柿D. kaki Thunb.的新鮮或干燥葉，低溫干燥后備用。

鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號AAE9241）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，批號SLBB7526V）；糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbAlc）全自動免疫比濁試劑盒、胰島素放射免疫分析試劑盒購于南京建成生物工程研究所；血糖試紙條（美迪信，批號SPF15Z3B1）。其余試劑均為分析純，均在有效期內(nèi)使用。

1.1.2 動物 雄性SD大鼠80只，清潔級，體重（240±20）g，購自江蘇大學(xué)動物實驗中心［合格證號：SCXK（蘇）2009-0002］。飼養(yǎng)室溫度25～26 ℃，濕度65%～70%，自由攝食和飲水，并給予12 h光照和黑暗循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。

1.1.3 儀器 LK-1000A高速中藥粉碎機（新昌縣城關(guān)紅利數(shù)控制備廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（南京金正科學(xué)儀器有限公司）、高速冷凍離心機（美國Sigma公司）、美迪信血糖儀（天津億朋醫(yī)療器械有限公司）、全自動免疫比濁檢測儀（美國貝克曼公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同溶劑萃取部位的制備 將柿葉用高速中藥粉碎機粉碎，過藥典三號篩，得干燥柿葉粉末。將其用70%乙醇，按8倍藥材質(zhì)量的溶劑量，浸泡1.5 h后，80℃水浴回流提取2次，2 h/次，合并濾液，減壓濃縮為浸膏。取浸膏適量，加蒸餾水調(diào)節(jié)生藥濃度為1 g/ml，依次用3倍體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，各3次，分別合并萃取液，于45 ℃下減壓濃縮，冷凍干燥得柿葉石油醚部位、柿葉二氯甲烷部位、柿葉乙酸乙酯部位。將上述萃取后的剩余水溶液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂，用水洗至柱下液澄清，再用95%乙醇洗至柱下液澄清，收集洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥得柿葉剩余部位，即柿葉萃余物。

1.2.2 2型糖尿病大鼠模型建立 80只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機選擇8只大鼠作為正常對照組，其余用于糖尿病造模。正常對照組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，造模組用高糖高脂飼料（含10%豬油、20%蔗糖、1%膽酸鹽、2.5%膽固醇、66.5%普通飼料）喂養(yǎng)，飼養(yǎng)30 d后，禁食12 h，按30 mg/kg劑量一次性腹腔注射鏈脲

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 正常對照組大鼠的攝食量和飲水量正常，反應(yīng)靈敏，皮毛有亮澤，精神狀態(tài)良好，體重增長；與正常對照組相比，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍、萎靡懶動、皮毛枯黃，攝食量和飲水量較對照組明顯增加，且排尿增多，體重較低。給藥28 d后，各給藥組大鼠情況較模型組各方面情況均有所好轉(zhuǎn)，飲水?dāng)z食趨于正常，活動量增加，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，體重有所增長（圖1）。

2.2 各組大鼠FBG的比較 各組FBG在給藥前（F=107.321，P＜0.001）及給藥7、14、21、28 d后差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=101.566，P＜0.001；F=151.244，P＜0.001；F=191.270，P＜0.001；F=191.828，P＜0.001）。佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液。繼續(xù)高脂高糖飼料飼養(yǎng)7 d后，禁食過夜，尾靜脈取血測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），以FBG≥11.1 mmol/L為2型糖尿病模型的標(biāo)準(zhǔn)［7，8］。

1.2.3 分組和給藥 造模成功的糖尿病大鼠隨機分為模型組、鹽酸二甲雙胍（0.11 g/kg）組以及石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物和萃余物（均折合生藥2.0 g/kg）組，每組8只。鹽酸二甲雙胍的劑量依據(jù)用藥說明書中人體用量轉(zhuǎn)化為大鼠用量確定，各萃取物的量按照《中華本草》中柿葉的人體用量轉(zhuǎn)化為大鼠用量確定。對照組和模型組均灌胃等體積蒸餾水。所有動物均連續(xù)給藥28 d，1次/d。

1.2.4 一般情況觀察 觀察各組大鼠一般生理情況，包括攝食量、飲水量、毛色及活動狀態(tài)等，并分別于給藥前及給藥7、14、21、28 d后測定各組大鼠的體重。

1.2.5 FBG的測定 分別于給藥前及給藥7、14、21、28 d后禁食6 h，尾靜脈取血后采用美迪信血糖儀檢測各組大鼠FBG。

1.2.6 HbAlc和FINS的測定 末次給藥后，禁食12 h，眼眶后靜脈叢取血，取乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）抗凝全血按照全自動免疫比濁試劑盒的操作說明測定 HbAlc；取全血經(jīng)離心機3200 r/min離心10 min得血清，采用放射免疫法測定血清FINS，計算胰島敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）和穩(wěn)態(tài)模型評估法（homeostasis model assessment，HOMA）計算胰島素抵抗（Homa insulin resistance，HOMA-IR）指數(shù)。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5；ISI=ln［1/（FBG×FINS）］。進一步兩兩比較結(jié)果顯示，與模型組相比，鹽酸二甲雙胍組、二氯甲烷萃取物組、乙酸乙酯萃取物組及萃余物組FBG在給藥7、14、21、28 d后均顯著降低（P＜0.05）。與鹽酸二甲雙胍組相比，二氯甲烷萃取物組FBG在給藥7、14 d后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.379；P=0.211），而在給藥21、28 d后差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008；P=0.001）；其他萃取物組與鹽酸二甲雙胍組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 各處理組大鼠給藥前及給藥7、14、21、28 d后體重變化

2.3 各組HbA1c和FINS的比較 各組HbA1c（F=15.308， P＜0.001）、FINS（F=11.801，P＜0.001）、Homa-IR（F=180.905，P＜0.001）、ISI（F=27.515，P＜0.001）之間的比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步兩兩比較顯示：與模型組相比，鹽酸二甲雙胍組、二氯甲烷萃取物組、乙酸乙酯萃取物組及萃余物組HbA1c及Homa-IR均顯著降低（P＜0.05）；鹽酸二甲雙胍組、二氯甲烷萃取物組和萃余物組FINS均顯著降低而ISI均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與鹽酸二甲雙胍組相比，二氯甲烷萃取物組HbA1c、FINS均無統(tǒng)計學(xué)差異，而Homa-IR、ISI與其比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021；P=0.035）；其他萃取物組各指標(biāo)與其比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討 論

糖尿病是一種常見的有遺傳傾向的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，是由多種原因引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，可導(dǎo)致全身組織器官，如眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的損害及其功能障礙，嚴(yán)重者可引發(fā)酮癥酸中毒和高滲昏迷。目前，市場上的化學(xué)降糖藥作用強，起效快，但不良反應(yīng)較多，可累及全身器官或各大系統(tǒng)，最常見的為胃腸道反應(yīng)，嚴(yán)重的主要發(fā)生在心血管、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)中，包括室性早搏、低血糖性昏迷、過敏性休克、全身剝脫性皮炎甚至死亡［9，10］。而中藥作用較為溫和，且一般無不良反應(yīng)或者不良反應(yīng)較輕，這正為臨床上使用安全有效的降血糖藥物提供了廣闊的前景。

表1 柿葉不同萃取物對糖尿病大鼠FBG的影響

表2 柿葉不同萃取物對糖尿病大鼠HbA1c、FINS、Homa-IR和ISI的影響

2型糖尿病多以胰島素抵抗為主，因胰島素抵抗、胰島素敏感性降低，血中胰島素增高以補償其胰島素抵抗，但相對患者而言，胰島素分泌仍相對不足。作為糖尿病常用的檢測指標(biāo)，F(xiàn)BG反映胰島β細(xì)胞功能，HbA1c反映一段時間內(nèi)平均的血糖水平，F(xiàn)INS、ISI、HOMA-IR指標(biāo)反映胰島素的抵抗及敏感程度，從上述研究思路出發(fā)，本研究選用上述指標(biāo)評估分析柿葉的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取物及萃余物對2型糖尿病大鼠模型的血糖代謝水平、胰島素抵抗及敏感性的影響。

本實驗通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)加小劑量腹腔注射STZ致2型糖尿病大鼠模型，進而研究柿葉不同萃取部位對糖尿病大鼠糖代謝及胰島素抵抗的作用，并將各萃取部位的藥效與陽性對照藥鹽酸二甲雙胍進行比較。結(jié)果顯示，與模型組相比，二氯甲烷萃取物組和萃余物組大鼠經(jīng)過28 d給藥治療后FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均顯著降低，ISI明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與陽性對照藥相比，二氯甲烷萃取物組在給藥7、14 d后FBG及末次給藥后HbA1c、FINS較鹽酸二甲雙胍組無統(tǒng)計學(xué)差異，但Homa-IR、ISI與其比較有顯著差異。本研究結(jié)果提示柿葉的二氯甲烷萃取物可能是柿葉降血糖的主要藥效部位，其作用可能與鹽酸二甲雙胍的降糖作用相當(dāng)，但其藥效部位中的成分分析鑒定有待今后進一步的深入研究。

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（2016-08-08收稿 2016-08-30修回）

（責(zé)任編輯 付 輝）

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Effect of different effective parts of persimmon leaves on glucose metabolism in rats with type 2 diabetes mellitus induced by streptozotocin

CAO Xu， TONG Shengling， and ZHAO Lei. Jiangsu Jibrier Pharmaceutical Joint Stock Limited Liability Company， Zhenjiang 212009， China

Objective To explore the effect of different extracts of persimmon leaves on glucose metabolism in rats with type 2 diabetes mellitus， so as to find the effective part of persimmon leaves with antidiabetics effects. Methods 8 male SD rats were randomly selected as the normal control group， the rest were intragastrical（ig） administered with high fatty and sugar diet for 1 month， and type 2 diabetic rat model was established by intraperitoneal injection streptozotocin （STZ） 30 mg/kg. Rats with type 2 diabetes mellitus were randomly divided into model group， metformin hydrochloride （0.11 g/kg） group， and persimmon leaves extracts groups of petroleum ether，dichloromethane， ethyl acetate， and raffinate. All animals were ig administered once daily for 28 days （the control group and model group were ig administered equal volume of distilled water）. Weight and fasting blood glucose （FBG） were determined before treatment and after treated 7， 14， 21 and 28 days. After the last administration， the blood samples were collected to measure the glycosylated hemoglobin（HbA1c） and fastings erum insulin （FINS）， and insulin sensitivity index （ISI） and Homa insulin resistance （HOMA-IR） index were calculated. Results （1） Compared with model group， both dichloromethane extract group and raffinate extract group could significantly reduce the indexes of FBG， HbA1c， FINS， HOMA-IR and increase ISI index （P＜0.05）； （2） Compared with metformin hydrochloride group，differences of FBG in dichloromethane extract group after treated 7， 14 days， and HbA1c and FINS in that group after the last administration had no statistical significance， but differences of HOMA-IR and ISI between two groups were statistically significant （P＜0.05）. Conclusions Dichloromethane extracts may be the main effective part of persimmon leaves with antidiabetics effects.

persimmon leaves；extracts；type 2 diabetes mellitus rats；glucose metabolism

R285.5

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.10.008

曹 旭，碩士，工程師，E-mail：15952858172@126.com

212009 鎮(zhèn)江，江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司