補(bǔ)腎強(qiáng)督方對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎膜內(nèi)成骨Wnt/β-catenin通路影響的實(shí)驗(yàn)研究

徐愿 孔維萍 陶慶文 楊文雪 金玥 閻小萍

中日友好醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕病科，免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性炎性疾病，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關(guān)節(jié)，并可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[1]。多數(shù)AS患者在疾病后期繼發(fā)韌帶、纖維環(huán)、關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)囊的病理性成骨，使脊柱逐漸失去柔軟度，造成脊柱強(qiáng)直和關(guān)節(jié)畸形。在AS中表現(xiàn)為附著點(diǎn)和滑膜關(guān)節(jié)、軟骨結(jié)合處形成新骨[2]。這種結(jié)構(gòu)損傷很難逆轉(zhuǎn)，往往導(dǎo)致AS患者脊柱活動(dòng)受限及關(guān)節(jié)功能降低，輕者出現(xiàn)下蹲、彎腰、轉(zhuǎn)頭等受限，重者行動(dòng)困難，晚期出現(xiàn)關(guān)節(jié)屈曲攣縮、畸形或強(qiáng)直，嚴(yán)重影響患者的關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[3]。目前普遍認(rèn)為，AS的病理性成骨主要通過(guò)兩種方式：軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨。①軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通過(guò)聚集和分化形成軟骨細(xì)胞，經(jīng)過(guò)增生、成熟、分化和凋亡，最后形成骨組織。研究表明軟骨內(nèi)成骨是AS骨贅生成的主要形式[4]。②膜內(nèi)成骨則是BMSCs直接分化為成骨細(xì)胞。膜內(nèi)成骨可能與AS脊柱縱韌帶鈣化有關(guān)[4]。Wnt/β-catenin通路是調(diào)節(jié)這兩種成骨過(guò)程的最重要的分子機(jī)制，本研究觀察補(bǔ)腎強(qiáng)督方對(duì)BMSCs 的Wnt/β-catenin通路的作用，為中醫(yī)治療AS提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞分化培養(yǎng)

人BMSCs(購(gòu)自Sciencell，貨號(hào)：7500)分為空白對(duì)照組、西藥對(duì)照組、補(bǔ)腎強(qiáng)督方低、中、高劑量組。各組細(xì)胞分別于MSCM (含 100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素、5%胎牛血清)中進(jìn)行培養(yǎng)。將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別按照1×105/孔的密度接種于100 mm平皿中，每皿加入不同組全培養(yǎng)基6 mL；按1萬(wàn)/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入不同組全培養(yǎng)基2 mL；按1千/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入不同組全培養(yǎng)基200 μL。將各培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，使細(xì)胞貼壁，擴(kuò)增至90%左右，吸棄各培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，換為MDOM(間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基) ( 含大鼠含藥血清 20%)，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d。

1.2 藥物補(bǔ)腎強(qiáng)督方

組成：熟地20 g，金狗脊30 g，鹿角6 g，骨碎補(bǔ)15 g，補(bǔ)骨脂10 g，桂枝12 g，赤芍12 g，白芍12 g，知母15 g，秦艽15 g，羌活12 g等。中日友好醫(yī)院藥劑室煎制，藥物水煎、過(guò)濾、濃縮至含生藥2.5×103g/L。以洛索洛芬鈉為對(duì)照藥物(上海三共制藥有限公司，國(guó)藥批字：H20030769)。

1.3 大鼠含藥血清制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Wistar雄性大鼠進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，末次給藥兩次，間隔1 h，末次給藥前12 h，禁食不禁水，末次給藥后1 h大鼠稱重，平均220 g/只，10%水合氯醛(中日醫(yī)院提供)麻醉，每只1.2 mL，剖腹，腹主動(dòng)脈取血，離心，吸取血清，-20℃保存。藥物以補(bǔ)腎強(qiáng)督方為治療藥物，以洛索洛芬鈉為對(duì)照藥物，分組為空白對(duì)照組、西藥對(duì)照組(予洛索洛芬鈉3 mg/(kg·d)、補(bǔ)腎強(qiáng)督方低、中、高劑量組[分別予補(bǔ)腎強(qiáng)督方0.9、1.8、3.6 g/(kg·d)]。使用前滅活(56℃,30 min)，過(guò)濾(0.22 μm)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1試劑及儀器：MSCM(間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基)、MODM(間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基)、胎牛血清、MTT試劑盒( Sciencell，美國(guó))；茜素紅S染色試劑盒(Ared，美國(guó))；Elisa試劑盒( R&D，美國(guó))；RIPA裂解液(凱基生物，中國(guó))；Trizol(Invitrogen，美國(guó))；cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，瑞士)；引物合成(Invitrogen，美國(guó))；Power SYBR Green PCR Master Mix(Biosystems，美國(guó))。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國(guó))；超凈臺(tái)(Airtech，美國(guó))；臺(tái)式大容量高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；超微量高精度紫外分光光度計(jì) ( ND-1000，美國(guó))；多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M2(Molecular Devices，美國(guó))；DNA Engine Dyad PCR 儀(Bio-Rad，美國(guó))；7500熒光定量PCR儀(Biosystems，美國(guó))；倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.4.2ELISA方法檢測(cè)ALP、BGP蛋白含量：BMSCs培養(yǎng)21d后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ALP、BGP的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，450 nm光波處測(cè)吸光值，540 mm光波處校正。

1.4.3免疫印跡法分析BMSCs中DKK-1、β-catenin蛋白含量：BMSCs誘導(dǎo)分化21 d后用RIPA法提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)檢測(cè)細(xì)胞中的目標(biāo)蛋白質(zhì)含量。樣品加入上樣緩沖液后100℃加熱3 min。每孔上樣20 μL總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后半干轉(zhuǎn)蛋白至裁剪好的電轉(zhuǎn)膜上，所用濾紙(Whatman,3MM CHR)，電轉(zhuǎn)完畢后，將電轉(zhuǎn)膜置于5%的脫脂奶粉封閉，37℃2 h，加一抗β-catenin(Abcam,貨號(hào)：ab32572，兔單克隆抗體IgG)和DKK1(Abcam,貨號(hào)：ab109416，兔單克隆抗體IgG)，均為1∶1000稀釋。4℃孵育過(guò)夜后加二抗(KPL，貨號(hào)：074-1516)，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，拍照，對(duì)雜交帶進(jìn)行密度掃描分析，比較蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.4.4熒光定量PCR測(cè)定BMSCs膜內(nèi)成骨中DKK-1mRNA和β-cateninmRNA表達(dá)：Trizol提取成骨細(xì)胞總RNA。取1μg總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再取1 μg cDNA 行熒光定量PCR反應(yīng)。DKK1 mRNA上游引物為：5′- TCACACCAAAGGAC AAGAAG-3′，下游：5′-ATCTTGGACCAGAAGTGT CTAGC-3′，β-catenin mRNA上游引物為：5′-ACAAACTGTTTTGAAAATCCA-3′，下游：5′-CGAGT CATTGCATACTGTCC-3′。引物均由Invitrogen公司合成，以cDNA為模板按Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)配制20 μL的PCR反應(yīng)體系，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：步驟1，預(yù)變性，1 cycle，95℃，2 min；步驟2，熱循環(huán)，40 cycle，95℃，15 s，60℃，1 min；步驟3，溶解曲線。每種樣品做3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算時(shí)取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組BMSCs成骨分化ALP、BGP的比較(見(jiàn)表1)

圖1 補(bǔ)腎強(qiáng)督方對(duì)BMSCs成骨分化中DKK-1及β-catenin蛋白量的影響Fig.1 The effect of Bushen Qiangdu recipe on the protein levels of DKK-1 and β-catenin in BMSCs groups after osteoblast differentiationWestern blot檢測(cè)BMSCs成骨分化中產(chǎn)生DKK-1及β-catenin相對(duì)蛋白濃度，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。A: DKK-1 Western blot 電泳圖；B：DKK-1 蛋白表達(dá)結(jié)果分析直方圖 Western blot 電泳圖；D：β-catenin蛋白表達(dá)結(jié)果分析直方圖與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，** P<0.01，與西藥對(duì)照組比較，△P<0.05，與中藥低劑量組比較，#P<0.05

各組細(xì)胞上清液ALP及BGP采用ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 各組BMSCs成骨分化中DKK1、β-catenin蛋白比較(見(jiàn)圖1)

各組細(xì)胞DKK1采用Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，中藥高劑量DKK1蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著增高(P<0.01)，與中藥低劑量組及西藥對(duì)照組比較，中藥高劑量DKK1蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著增高(P<0.05)。其他各組件比較無(wú)差異(P>0.05)。

表1 各組BMSCs成骨分化后ALP、BGP比較Table 1 Comparison of ALP and BGP between each BMSCs group after osteoblast

各組細(xì)胞β-catenin采用Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組及西藥對(duì)照組比較，中藥高劑量β-catenin蛋白質(zhì)產(chǎn)生量顯著降低(P<0.05)；其他各組件比較無(wú)差異(P>0.05)。

2.3 各組BMSCs成骨分化DKK1 mRNA及β-catenin mRNA表達(dá)的比較(見(jiàn)圖2)

各組細(xì)胞DKK1 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，中藥高中低劑量組DKK1 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與西藥對(duì)照組比較，中藥中高劑量組DKK1 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與中藥中低劑量組比較，中藥高劑量組DKK1 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；其他各組件比較無(wú)差異(P>0.05)。

圖2 補(bǔ)腎強(qiáng)督方對(duì)BMSCs成骨分化中DKK-1mRNA及β-cateninmRNA表達(dá)的影響Fig.2 The effect of Bushen Qiangdu recipe on the mRNA levels of DKK-1 and β-catenin in BMSCs groups after osteoblast differentiation熒光定量PCR檢測(cè)BMSCs成骨分化中產(chǎn)生DKK-1 mRNA及β-cateninmRNA 表達(dá)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。A:DKK-1 mRNA表達(dá)結(jié)果分析直方圖表達(dá)結(jié)果分析直方圖與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與西藥對(duì)照組比較，△P<0.05；與中藥低劑量比較，#P<0.05；與中藥中劑量比較，P<0.05

各組細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，中藥高中低劑量組β-catenin mRNA達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與西藥對(duì)照組比較，中藥高中劑量組β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高中劑量組β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；其他各組件比較無(wú)差異(P>0.05)。

3 討論

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)在疾病進(jìn)展過(guò)程中可同時(shí)存在骨丟失和骨形成兩個(gè)看似矛盾的結(jié)果。AS骨丟失表現(xiàn)為骨質(zhì)破壞及骨質(zhì)疏松，本病基本都累及骶髂關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為侵蝕性改變；24%～36%患者出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)骨破壞，嚴(yán)重者導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)強(qiáng)直、甚至致殘[5]；19%～62%患者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，甚至在疾病早期即可出現(xiàn)，顯著增高脊柱骨折、特別是脊柱壓縮骨折的風(fēng)險(xiǎn)[6]。AS骨形成，亦即病理性成骨，多發(fā)生在附著點(diǎn)部位，特別是脊柱部位多發(fā)，22%～24%患者出現(xiàn)較明顯骨化進(jìn)展，50%～60%無(wú)明顯骨化進(jìn)展[7,8]，骨化導(dǎo)致的脊柱強(qiáng)直在病程后期是導(dǎo)致患者痛苦的主要原因，明顯影響脊柱活動(dòng)度，部分長(zhǎng)病程患者甚至因功能障礙而致殘[9,10]。

骨化研究是AS目前研究的熱點(diǎn)，但是進(jìn)展緩慢，其原因有二：其一，骨化往往發(fā)生脊柱附著點(diǎn)部位，病理組織非常難以獲取，病理學(xué)研究大部分是20世紀(jì)基于尸體解剖獲得[11]，而現(xiàn)代影像技術(shù)如MRI能很好發(fā)現(xiàn)炎癥改變，但對(duì)骨化病變不敏感；其二，骨化進(jìn)程非常緩慢，且個(gè)體間差異大，研究周期往往需要5～10年[7,8]，甚至更長(zhǎng)，給研究造成了很大困難。在AS骨化發(fā)生機(jī)制方面，目前研究證實(shí)Wnt、BMP和Hedgehog信號(hào)通路與骨化有關(guān)，而Wnt通路是研究最為清晰的通路。最早研究Wnt通路在骨化中的作用是一個(gè)巧合，為了研究Wnt通路在炎性關(guān)節(jié)病相關(guān)骨質(zhì)疏松的作用，采用阻斷TNF-α轉(zhuǎn)基因鼠中Wnt通路阻滯劑DKK-1，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大量發(fā)生骨化[12,13]，從而發(fā)現(xiàn)Wnt通路在骨化中的作用。進(jìn)一步研究逐漸發(fā)現(xiàn)，發(fā)生韌帶骨贅的AS患者血清中Wnt通路抑制因子DKK1和SOST水平顯著降低[12,14,15]，目前已經(jīng)提出用DKK1作為骨化的生物標(biāo)記物[14]。細(xì)胞學(xué)研究表明，Wnt通路激活可促進(jìn)BMSCs的軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，導(dǎo)致骨化發(fā)生[16]，Wnt通路激動(dòng)劑Wnt5a還能促進(jìn)BMSCs表達(dá)非組織特異性堿性磷酸酶，促進(jìn)其骨化進(jìn)展[17]。AS患者Wnt通路的異常激活參與了AS骨化的發(fā)病，因此，從Wnt通路研究中醫(yī)改善AS骨化的可能機(jī)制具有必要性。

閻小萍教授提出強(qiáng)直性脊柱炎“腎虛督寒”的中醫(yī)基本病機(jī)[18]。腎藏精，主骨生髓，腎氣虧虛，感受外邪，骨失淖澤而出現(xiàn)骨損、骨痿，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)破壞以及骨質(zhì)疏松；督脈行于脊背，通于腎，總督人身諸陽(yáng)，寒邪侵襲，督脈受邪則陽(yáng)氣開(kāi)闔不得，寒凝督脈而致筋脈攣急，出現(xiàn)脊背僵硬、僵曲不得伸，表現(xiàn)為脊柱骨化、甚至強(qiáng)直改變。“腎虛督寒”的病機(jī)很好地解釋了本病骨丟失和骨形成兩個(gè)相矛盾的表現(xiàn)?；诖?，創(chuàng)立了“補(bǔ)腎強(qiáng)督方”，該方由熟地、金狗脊、鹿角、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、桂枝、赤芍、白芍、知母、秦艽、羌活等組成，諸藥共湊補(bǔ)腎祛寒、壯督除濕、活血通脈、強(qiáng)健筋骨之效。補(bǔ)腎強(qiáng)督方治療AS的療效已得到諸多研究驗(yàn)證：①緩解炎癥，改善癥狀，治療3月中醫(yī)有效率達(dá)94.5%[19]，達(dá)到ASAS20者占74.3%[20]；②改善骨質(zhì)疏松，顯著提高患者骨密度，調(diào)節(jié)骨代謝[21]，基于補(bǔ)腎強(qiáng)督方研制的補(bǔ)腎舒脊顆粒改善髖關(guān)節(jié)功能，延緩髖關(guān)節(jié)X線進(jìn)展[22]；③調(diào)節(jié)骨化相關(guān)細(xì)胞因子，上調(diào)血清中骨化抑制因子DKK-1的水平[23]。通過(guò)驗(yàn)證研究，進(jìn)一步證實(shí)了AS“腎虛督寒”基本病機(jī)。

本研究是對(duì)系列研究的進(jìn)一步補(bǔ)充，結(jié)果提示，補(bǔ)腎強(qiáng)督方能夠抑制BMSCs成骨分化中Wnt通路的激活，上調(diào)DKK-1水平，而臨床研究亦提示該方能上調(diào)AS患者血清中DKK-1水平，這些均提示該方可能通過(guò)Wnt通路抑制AS骨化過(guò)程中BMSCs的膜內(nèi)成骨過(guò)程起到調(diào)節(jié)作用。BMSCs成骨分化是維持骨量的機(jī)制之一，雖然該方對(duì)Wnt通路有抑制作用，但是不會(huì)導(dǎo)致AS骨丟失，因?yàn)樵撗芯窟€顯示，補(bǔ)腎強(qiáng)督方在BMSCs成骨分化作用中，體現(xiàn)成骨能力的ALP和BGP無(wú)差異，而且該方能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞OPG/RANKL系統(tǒng)，促進(jìn)骨生成，抑制骨吸收，改善骨質(zhì)疏松癥[24]。因此，基于“腎虛督寒”理論創(chuàng)立的補(bǔ)腎強(qiáng)督方對(duì)AS具有抑制骨化，同時(shí)抑制骨丟失的雙向作用。對(duì)該病機(jī)的進(jìn)一步研究，對(duì)于尋找治療AS骨化的有效藥物具有一定的提示作用。