續(xù)苓健骨方對骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度及OPG和RANKL蛋白表達的影響

葛繼榮 李生強 陳娟 謝麗華 許惠娟 馬海珍

福建省中醫(yī)藥研究院，福州 350003

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種退化性的老年疾病，無聲無息地蠶食著老年人的骨骼，其嚴(yán)重后果是骨折以及骨折并發(fā)癥引起的殘疾和死亡。隨著人類壽命的延長和老齡化社會的到來,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率正逐年上升。世界衛(wèi)生組織預(yù)測在今后50年,全世界因骨質(zhì)疏松癥所致的髖骨骨折例數(shù)將有大幅度的上升,其中1/4將發(fā)生在北美和歐洲,超過一半發(fā)生在亞洲,特別是中國[1,2]。因此,防治骨質(zhì)疏松的工作目前已是臨床醫(yī)師的重要任務(wù)之一。近年來，臨床采用中藥治療骨質(zhì)疏松癥得到廣泛認可，治療骨質(zhì)疏松癥的中成藥多數(shù)有緩解癥狀、減輕骨痛的療效，但中藥關(guān)于改善骨密度，降低骨折風(fēng)險的大型臨床研究尚缺乏，長期療效和用藥安全性需進一步研究[3]，因此，臨床迫切需要研制出既能提高骨密度、降低骨折風(fēng)險，又能適宜長期服用、安全性好的中藥新藥。鑒于此，作者憑借參與十余種治療骨質(zhì)疏松癥中藥新藥的Ⅱ期、Ⅲ期臨床試驗經(jīng)驗，結(jié)合自己的臨床實踐，以中醫(yī)藥理論遣方用藥，逐漸完善，形成續(xù)苓健骨方，用于治療骨質(zhì)疏松癥，為了探討其治療機制，本文以骨質(zhì)疏松模型大鼠為研究對象，觀察該方對模型大鼠骨密度和OPG/RANKL/RANK信號系統(tǒng)中相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6月齡清潔級雌性SD大鼠40只,上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供,實驗動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005,合格證編號:2007000530078。福建省中醫(yī)藥研究院比較醫(yī)學(xué)實驗中心飼養(yǎng)[合格證號:SYXK (閩)2009-000]。

1.2 實驗藥物與試劑

續(xù)苓健骨方組成：川續(xù)斷、白術(shù)、陳皮、赤芍、紅花和甘草等12味中藥組成，每劑中藥總量為122克。中藥材購自福建省醫(yī)藥公司。大鼠灌胃量計算方法：按人50Kg：122÷50=2.44g/(kg.d)，大鼠灌胃量：2.44×6.25倍=15 g/kg，按傳統(tǒng)中藥煎熬方法,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鈣爾奇D(惠氏制藥有限公司)規(guī)格：600 mg/片；Elisa試劑盒(TSZ公司)，PVDF膜(Invitrogen公司)；一抗(Abcam公司)；ECL發(fā)光試劑(Thermo Scientific公司)。

1.3 儀器

Discovery Wi雙能X線骨密度儀(Hologic公司)，多色熒光/化學(xué)發(fā)光成像工作站(Protein simple Fluor Chem M 公司)，核酸檢測儀2100 (Agilent公司)。

2 方法

2.1 動物分組

SD雌性大鼠隨機分成：鈣爾奇D組、續(xù)苓健骨方組、假手術(shù)組、去卵巢骨質(zhì)疏松模型組，每組10只。

2.2 骨質(zhì)疏松模型大鼠造模與給藥

行雙側(cè)卵巢切除術(shù)：用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部正中切口,探及左、右末端卵巢,行結(jié)扎切除術(shù)。術(shù)后3 d連續(xù)肌注青霉素預(yù)防感染(8萬單位/只)。術(shù)后30 d開始灌胃給藥，大鼠劑量為等體重臨床藥量的6.25倍。

鈣爾奇D 給藥量為0.126 g/(kg·d)，下午灌胃；續(xù)苓健骨方10 g/kg，上午灌胃；假手術(shù)組和模型組每只給予生理鹽水10 g/kg。各組動物給予普通飼料飼養(yǎng),自由飲水和活動。

2.3 取材

給藥12周后取材，以10%水合氯醛麻醉后,由腹主動脈取血,隨后取雙側(cè)脛骨和腰椎。實驗過程中，鈣爾奇D組1只大鼠在飼養(yǎng)過程中死亡。

2.4 骨密度、BALP和蛋白表達檢測

雙能X線骨密度儀進行左側(cè)脛骨骨密度測定；Elisa試劑盒檢測血清骨堿性磷酸酶(BALP)水平；Western blot法測骨保護素(OPG)和核因子κB受體激活因子配體(RANKL)蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布，選擇非參數(shù)檢驗或t檢驗比較組間差異，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間骨密度比較

續(xù)苓健骨方組骨密度在4組中最高，模型組骨密度最低。續(xù)苓健骨方組與鈣爾奇D組比較：t=2.4867，P<0.05，與假手術(shù)組比較t=3.3499，P<0.01，與模型組比較t=5.5133，P<0.000。鈣爾奇D組與假手術(shù)組比較骨密度無顯著差異，P>0.05，與模型組比較：t=3.8425，P<0.01；模型組與假手術(shù)組比較：t=2.0604，P=0.054。見表1。

2.2 組間BALP濃度比較

續(xù)苓健骨方組BALP濃度與模型組比較：t=3.643，P<0.01，與假手術(shù)組、鈣爾奇D組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，P>0.05；鈣爾奇D組BALP濃度與模型組比較：t=2.885，P<0.05，與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，P>0.05；假手術(shù)組BALP濃度與模型組比較，t=3.088，P<0.01。見表2。

組別N骨密度模型組100.195±0.017☆#假手術(shù)組100.213±0.020△鈣爾奇D組90.223±0.013?續(xù)苓健骨方組100.244±0.022

注：與續(xù)苓健骨方組比較，“*”P<0.05，“△”P<0.01，“☆”P<0.000。與鈣爾奇D組比較，“#”P<0.01。

組別NBALP濃度模型組1011.661±4.435假手術(shù)組1023.484±11.266△鈣爾奇D組918.694±6.140?續(xù)苓健骨方組1021.056±6.843△

注：與模型組比較，“*”P<0.05，“△”P<0.01

2.3 組間OPG、RNAKL蛋白表達比較

續(xù)苓健骨方組OPG蛋白表達水平明顯高于模型組，兩組比較：t=2.1359，P<0.05，但與鈣爾奇D組、假手術(shù)組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義。續(xù)苓健骨方組RNAKL蛋白表達水平明顯低于模型組，兩組比較：t=3.2168，P<0.01，但與鈣爾奇D組、假手術(shù)組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義。鈣爾奇D組與模型組RNAKL蛋白表達水平比較：t=2.8686，P<0.05；假手術(shù)組與模型組RNAKL蛋白表達比較，非參數(shù)檢驗Z=1.965，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異，說明模型組的RNAKL蛋白表達水平顯著高于假手術(shù)組。其他組間OPG、RNAKL比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

組別NOPG/ACTINRNAKL/ACTIN模型組100.543±0.2601.488±0.723假手術(shù)組100.705±0.1960.951±0.475※鈣爾奇D組90.702±0.5330.624±0.571?續(xù)苓健骨方組100.788±0.252?0.670±0.352△

注：與模型組比較，“*”P<0.05，“△”P<0.01，“※”P<0.05(非參數(shù)檢驗)

3 討論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥歸屬為中醫(yī)“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇。根據(jù)中醫(yī)“腎藏精”、“腎主骨”理論，腎精虧虛是本病發(fā)生的基本病機，并與中醫(yī)肝、脾等臟腑功能密切相關(guān)。常見證型：腎陽虛證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證、脾胃虛弱證和血瘀氣滯證等。中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的原則是“辨證施治，整體調(diào)節(jié)，防治結(jié)合”，依據(jù)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)證候遣方用藥，達到“改善臨床癥狀，延緩骨量丟失，或增加骨量，降低骨折風(fēng)險，提高生存質(zhì)量”的目的[4]。在此原則指導(dǎo)下，作者研發(fā)的續(xù)苓健骨方具有補肝腎、壯筋骨、健脾胃、活血行氣、散瘀止痛、清熱涼血的功效，主治肝腎虧虛，兼有脾胃虛弱和血瘀證候的骨質(zhì)疏松癥患者，實驗證明：續(xù)苓健骨方能夠顯著提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度和BALP水平。

為了探討續(xù)苓健骨方提高骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度的作用機制，本實驗觀察了OPG/RANKL/RANK信號系統(tǒng)中相關(guān)基因蛋白表達的變化。OPG/RANKL/RANK是破骨細胞分化成熟過程中的調(diào)控樞紐和關(guān)鍵信號途徑[5]，RANKL是破骨細胞增殖分化和活化的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]，RANK和RANKL結(jié)合可導(dǎo)致破骨細胞前體分化、成熟，而OPG能夠和RANK競爭性地結(jié)合RANKL，間接地降低破骨細胞的活性和分化，OPG和RANKL通過控制破骨細胞上RANK的激活狀態(tài)調(diào)控骨吸收，正或負調(diào)控骨密度[7]，OPG缺乏會導(dǎo)致骨重建的增強和骨質(zhì)疏松。目前，應(yīng)用OPG/RANKL/RANK信號系統(tǒng)來詮釋骨質(zhì)疏松發(fā)病、治療機制已是常見的科研思路之一。本實驗采用這一研究方法，觀察到骨質(zhì)疏松模型組的RANKL蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組，經(jīng)過續(xù)苓健骨方干預(yù)，OPG蛋白表達顯著提高，RNAKL蛋白表達明顯降低，說明續(xù)苓健骨方提高模型大鼠骨密度的分子機制與其有關(guān)，這與其他研究人員報道復(fù)方或單味中藥對OPG/RANKL/RANK 信號系統(tǒng)的作用基本一致。如萬春飛等[8,9]報道獨活寄生湯含藥血清能夠促進體外細胞OPG表達，抑制RANKL表達；萬雷等[10]報道骨康含藥血清可改變OPG/RANKL的比例,間接影響破骨細胞的功能活性；馮建書等[11]報道仙靈骨葆可促進骨質(zhì)疏松模型大鼠OPG mRNA表達，抑制RANK 及RANKL mRNA表達；馮佳等[12]報道強骨康疏膠囊能提高骨質(zhì)疏松模型大鼠OPG蛋白表達，抑制RANKL蛋白表達；朱曉峰等[13]報道益骨膠囊含藥血清提高晚期糖基化終末產(chǎn)物作用下成骨細胞分化和礦化能力,提高OPG的表達；王瑩等[14]報道巴戟天能夠抑制骨質(zhì)疏松模型大鼠OB 和MSC RANKL蛋白表達；何劍全等[15]報道巴戟天可降低骨質(zhì)疏松模型大鼠RANK mRNA表達；董佳梓等[16]報道枸杞子能促進骨質(zhì)疏松模型大鼠OPG蛋白表達，抑制RANKL蛋白表達，桑寄生促進OPG蛋白表達；張穎等[17]報道杜仲對大鼠脛骨OB和MSC RANKL 蛋白和mRNA表達有明顯的抑制作用，千年健能抑制RANKL蛋白和mRNA的表達，增加OB 和MSC OPG 蛋白和mRNA的表達。綜上所述：中藥治療骨質(zhì)疏松的作用機制之一是：上調(diào)OPG表達，下調(diào)RANKL表達，干擾RANKL與RANK的結(jié)合，降低破骨細胞的活性和分化，使骨代謝朝有利于骨密度的方向發(fā)展，從而達到治療目的。

盡管本實驗從OPG/RANKL/RANK信號系統(tǒng)初步闡述了續(xù)苓健骨方提高骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度的部分機制，但因復(fù)方中藥成分的復(fù)雜性，作用途徑的多樣性，后續(xù)需要深入的研究來全面闡明其治療機制，為新藥研發(fā)做準(zhǔn)備。