胃幽門螺桿菌感染與TLR4基因G11367C、NADPH氧化酶基因His72Tyr多態(tài)性的交互作用和特發(fā)性成年骨質疏松癥的關系

張超賢 郭李柯 侯文根 秦詠梅

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科，河南 衛(wèi)輝 453100 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔科，河南 衛(wèi)輝 453100 3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科，河南 衛(wèi)輝 453100

特發(fā)性成年骨質疏松癥(idiopathic osteoporosis in adult，IOIA)是一種發(fā)生在成年女性閉經前, 男性在 60 歲前而沒有明顯誘因的全身骨代謝疾病，表現為成年人骨量低下和骨的微細結構破壞、導致骨的脆性增加易發(fā)生骨折為特征的系統的全身性骨病，嚴重危害公眾的健康[1]。IOIA病因和發(fā)病機制尚未完全明確，目前認為炎癥反應、胰島素抵抗和活性氧自由基損傷在IOIA發(fā)病中起重要作用，并與環(huán)境因素、遺傳因素密切相關[2,3]。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)作為消化系統最常見的感染細菌之一，其在慢性活動性胃炎消化性潰瘍胃黏膜相關淋巴組織( MALT) 淋巴瘤和胃癌等中的致病作用已得到證實 近年研究還發(fā)現，H.pylori感染不僅與胃腸疾病相關，而且與一些胃腸以外的疾病也存在密切的相關性，可通過影響血脂代謝、胰島素抵抗、炎癥反應和氧化應激來參與IOIA的發(fā)生、發(fā)展[4]。Toll樣受體4( toll-like receptor4，TLR4)TLR4是第一個被發(fā)現的Toll樣受體，幾乎存在于所有細胞表面，包括肝臟、脂肪組織、骨骼肌等，主要通過TLR4/核轉錄因子-κB(NF-κB)通路調控炎癥因子的表達，繼而調節(jié)胰島素敏感性，影響胰島素抵抗的發(fā)生。在基因突變或其他因素作用下，TLR4/NF-κB通路異常激活，導致炎癥因子大量釋放和胰島素敏感性下降，促進IOIA的發(fā)生、進展[5]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是機體產生活性氧自由基的關鍵酶，其活性變化將直接影響機體活性氧自由基水平，在IOIA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重大作用[6]。TLR4、NADPH氧化酶基因具有多態(tài)性，即具有多個等位基因，不同的等位基因編碼的TLR4或NADPH氧化酶活性有差異。TLR4或NADPH氧化酶基因的多態(tài)性可使機體對外界環(huán)境(如H.pylori感染)的反應能力有所不同，這是決定機體IOIA易感性的一個重要因素。TLR4、NADPH氧化酶基因多態(tài)性與IOIA易感性的研究日漸增多，但尚未見H.pylori感染與上述基因多態(tài)性的聯合作用對IOIA易感性影響的報道。為了研究TLR4、NADPH氧化酶在當地人群中的分布狀態(tài)，進而探索其和H.pylori感染相互作用與IOIA高發(fā)的關系，我們在國內首次開展了TLR4 和NADPH氧化酶聯合基因多態(tài)性與IOIA易感性關系的研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2011年5月～2015年7月在我院門診和病房收治的IOIA確診患者160例，無甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺病變者，不合并嚴重肝、膽、腎等疾病和類風濕性關節(jié)炎、 營養(yǎng)缺乏性疾病及其它引發(fā)骨質疏松疾病和因素，不合并免疫系統疾病，納入研究時均為第一次就診，未經任何藥物和手術治療，IOIA的診斷參照中華醫(yī)學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會2011年制定的原發(fā)性骨質疏松癥診治指南(2011年)[7]。對照組為160例同期健康體檢者，兩組按照年齡(±3)、性別、居住地進行1∶1配對，均為豫北居民或在豫北10年及以上，各組性別比(男∶女)均為97∶63例；IOIA組年齡19-50歲，平均(38.27±7.46)歲；對照組年齡18-49歲，平均(38.32±10.64)歲。兩組在年齡、性別、民族和籍貫統計學處理差異無顯著性，無血緣關系。采用統一的流行病學調查表，由經過專門培訓的調查員對病例和對照組進行詢問調查，收集研究對象的一般情況、 健康相關行為、 吸煙、飲酒、飲食習慣、 運動情況、 疾病史。飲食因素主要包括:飲食習慣、碳水化合物、蔬菜水果、肉類、蛋類、油脂、 家禽內臟、家畜內臟、煎炸食品等。飲食調查采用詢問法，對主要膳食因素詳細記錄并折算成各種食物成分攝入量和產熱量。飲食狀況分為低脂飲食、高脂飲食(飲食中脂肪的產熱量占總熱量百分比超過25%持續(xù)1年以上定義為高脂飲食)，吸煙狀況本文分為不吸煙者、吸煙者(將每天至少吸1支煙，持續(xù)半年以上定義為吸煙者)。飲酒定義為飲酒折合乙醇量男性大于140g/周(女性>70g/周)，持續(xù)半年以上。

1.2 H.pylori檢測

14C-UBT試劑盒由深圳市中核海得威生物科技有限公司提供，所有待用試劑的配制均按試劑盒說明書進行。檢測儀器為HUBT-01卡式幽門螺桿菌檢測儀(深圳市中核海得威生物科技有限公司)。患者在清晨空腹時或至少禁食6 h以后受試，受試前漱口，口服14C-尿素膠囊一粒，囑受試者整粒服下，20 ml溫水送服，不得咬碎膠囊，3 min后再飲水20 ml，然后靜坐15～20 min，等待采樣。開啟CO2吸收劑一瓶，傾入一潔凈的液閃瓶內，囑受試者通過吹氣導管向CO2吸收劑徐徐吹氣，不能倒吸入嘴內，力度適中，避免液體濺出，當CO2吸收劑的紫紅色褪盡變?yōu)闊o色透明時，停止吹氣。此時CO2吸收劑剛好吸收到所需的CO2采樣量。向已采集呼氣樣品的液閃瓶內加入稀閃爍液4.5 ml，搖勻，測量樣品每分鐘衰變數(disntegration per minute, DPM)，以試劑盒提供的DPM≥100為陽性標準，本研究將H.Pylori感染狀況分為未感染者(DPM<100)、100≤DPM<500感染者和DPM≥500感染者。

1.3 標本采集

每人各抽取靜脈血2～3 ml，置乙二胺四乙酸鈉抗凝管,分離白細胞層。用QIAampDNA提取試劑盒提取白細胞DNA，DNA置-30℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因測定

1.4.1TLR4基因G11367C基因型檢測[8]：采用單管雙向等位基因特異性擴增技術對TLR4基因G11367C進行基因分型，引物序列為：外引物上游引物5′-：GTCATTCCAAAGTTATTGC CTACTAAG 3′，下游引物5′-GTGATATCTCATTGTGGTTTTTATTTTC-3′；內引物上游引物5′-：TAAACCCGGGGTGACC TCATGAAATCAG 3′，下游引物5′-TCTGAAAAAAA TAAACTTCTGCTGCTAG-3′。PCR反應體系包括：基因組DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶Mix液12.5 μL。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性40 s，68℃退火1 min，72℃延伸40 s，20個循環(huán)，每個循環(huán)下降0.5℃，直到最適退火溫度58℃，再進行95℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共10個循環(huán)。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，goldenview核酸染料染色，紫外透射凝膠成像系統確定可見3種帶型: TLR4基因G11367C(GG)純合子基因型個體顯示為398和 599bp 兩條DNA帶，TLR4基因G11367C(GC)雜合子基因型個體顯示257、398和599bp三條DNA帶， 在各組中均未發(fā)現突變純合子 CC基因型(圖1)。每組隨機抽取15個初步確定了基因型的樣本，用PCR擴增后，送上海生工生物工程技術服務公司進行DNA序列測定進行驗證，獲得了100%的一致。

圖1 TLR4基因G11367C PCR 產物檢測Fig.1 The electrophoretogram of PCR product s of TLR4 gene G11367C.M: Marker; 1, 2: GG; 3, 4: GC

1.4.2NADPH氧化酶基因His72Tyr多態(tài)性分析[9]:引物序列為: 上游引物5′TGCTTGTGGGTA AACCAAGGCCGGTG3′，下游引物: 5′AACACTGAG GTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT′，由上海生工生物技術有限公司合成。應用T aKaRa PCR Am-plification Kit( 大連寶生物工程有限公司) PCR 試劑盒在 25 μL PCR 反應體系中進行基因組 DNA 擴增, 0.5 μg DNA基因組DNA， 10×PCR Buffer2.5 μL，含M gCl21.5 μL(25 mol/ L)，2dNT P M ix ture 2 μL、TaKaRa Taq DN A 聚合酶0.125 μL ( 5 U /μL) , 引物各 1 μL (10 pmol/ L)，滅菌去離子水 17.375 μL。PCR反應條件如下：94 ℃ 4 min, 94 ℃變性30 s, 65℃ 3 min, 70 ℃ 1 min，33 個循環(huán)，最后 70 ℃延伸10 min。PCR 擴增后的基因片段為 348bp。取12 μL的 PCR 反應產物與限制性內切酶RsaⅠ(NEB公司)于37 ℃溫浴過夜。酶切產物經 3.5% 瓊脂糖凝膠電泳(含 0.5 μg/ ml 溴乙啶)進行分析，His72Tyr(HH)純合子基因型個體顯示 1條 348bp長的 DNA 片段, His72Tyr(TT)純合子基因型個體顯示188bp和160bp兩條區(qū)帶, His72Tyr(HT)雜合子基因型個體則顯示348bp、188bp和160bp的3條區(qū)帶(圖1)。

對于上述PCR酶切法的結果，每組隨機抽取了20個樣本用PCR-單鏈構象多態(tài)性(PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)方法進行了驗證, 擴增片段614bp，上游引物5′- TGGGGAA GTCGACTGCCT-3′，下游引物5′-：CAGTGCGTAGCAGTGGAATGAAC-3′，應用從65℃開始，每循環(huán)下降退火溫度0.5℃，30個循環(huán)后在50℃退火溫度上再進行15個循環(huán)。PCR產物用12%聚丙烯酰胺凝膠循環(huán)水冷35 W恒功率電泳5 h(Bio-Rad伯樂公司Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳槽)，銀染后與PCR酶切法的分型結果進行比對，獲得了100%的一致。

圖2 NADPH氧化酶基因His72TyrPCR 產物檢測Fig.2 The electrophoretogram of PCR products of NADPH oxidase gene His72Tyr.M: Marker; 1, 2: HT; 3, 4: TT; 5, 6: HH

1.5 統計方法

Hardy-Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性，以P>0.05為符合 Hardy-Weinberg規(guī)律。用比值比(OR)值和95%可信區(qū)間 (95% CI)評價相對風險，病例組和對照組之間的基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。非條件logistic回歸模型分析交互作用。根據Khoury和Wagener提出的交互作用模型和交互系數(γ=βeg/βe)判斷基因一環(huán)境交互作用模型以及交互作用類型[10]。判定依據1：γ>1，表示基因對環(huán)境暴露的效應有放大作用，正向交互作用；γ<1，表示基因對環(huán)境暴露的效應有減弱作用，負向交互作用；γ=1，表示基因對環(huán)境暴露沒有交互作用。在病例對照研究中，γ為兩變量lgOR的比值。判定依據2：OReg=ORe×ORg為相乘模型；OReg>ORe×ORg為超相乘模型；OReg

2 結果

2.1 IOIA組和對照組的一般資料分析

IOIA組和對照組性別、年齡分布差異無顯著性意義(P>0.05)； IOIA組高脂飲食率、吸煙率和飲酒率均顯著高于對照組(P<0.05)(表1)。

表1IOIA組和對照組的一般資料
Table1General information of IOIA and control group

指標對照組Control groupIOIA組IOIA groupP性別(Gender) [ n(%) ]0.2143 男(Male) 97(60 .63%) 97(60 .63%) 女(Female)63(39 37%)63(39 37%) 年齡(歲)[Age( year)] 38.27±7.4638.32±10.640.2835飲食習慣(Diet status) 0.0068 低脂飲食(Low-fat diet)129(80.63%) 84(52.50%) 高脂飲食(High-fat diet) 31(18.37%) 76(47.50%)飲酒狀況(Drinking status)0.0075 不飲酒(No)125(78.13%)86(53.75%) 飲酒(Yes)35(21.87%)74(46.25%)吸煙狀況(Smoking status)0.0212 不吸煙(No)105(65.63%)83(51.88%) 吸煙(Yes)55(34.37%)77(48.12%)

2.2 IOIA易感性與 H.pylori感染的相關性分析

100≤DPM<500和DPM≥500H.pylori 感染者頻率分布在在IOIA組分別為28.75%和40.63%，在對照組分別為15.63%和11.87%，上述H.pylori 感染狀況頻率在IOIA組與對照組之間均有顯著差異(P均<0.01)。100≤DPM<500和DPM≥500H.pylori 感染者患IOIA的風險性均明顯增高(OR=4.4463，OR=8.0238)，而DPM≥500H.pylori 感染者患LSCC的風險性則又明顯高于100≤DPM<500H.pylori 感染者( P<0.01)(表2)。

表2 IOIA易感性與 H.pylori感染的相關性分析Table 2 Correlation analysis between IOIA susceptibility and H.pylori infection

a: 按照性別、年齡、飲食習慣、飲酒和吸煙狀況調整；與100≤DPM<500相比，*P<0.01
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status*P<0.01vs100≤DPM<500

2.3 TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因-C242T基因型和等位基因頻率關聯分析

經Hardy-Weinberg 平衡檢驗，TLR4基因G11367C各基因型在對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg 規(guī)律(P>0.05)，說明研究群體具有代表性(見表3)。GG和GC基因型頻率在病例組和對照組差異有顯著性(P<0.01)；等位基因C在IOIA組和對照組之間的分布差異具有統計學意義(P<0.01)，且OR值大于1，說明含等位基因C的個體發(fā)生IOIA的風險相對較高；兩位點的不同基因型在病例、對照組之間的分布差異均具有統計學意義(P< 0.01)。結果表明：TLR4基因G11367C(G→C突變)可能增加IOIA的患病風險(表2)。NADPH氧化酶基因His72Tyr 3種基因型、等位基因頻率亦符合上述規(guī)律(表4)。

表3TLR4基因G11367C基因型與等位基因分布
Table3Distribution of polymorphisms of TLR4 gene G11367C genotypes and alleles

指標IOIA組IOIA group對照組Control groupORa95% CIP基因型 (Genotype) GG47(29.38%)115 (71.88%)1. 00 GC113(70.62%)45(28.12%)6.14423. 4725-9.80360.0073等位基因 (Allele) G207(64.69%)275(85.94%)1. 00 C113(35.31%)45 (14.06%)3.33601. 8790-7.97870.0086

a: 按照性別、年齡、飲食習慣、飲酒、吸煙狀況和H.Pylori感染狀況調整
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status , smoking status and H.pylori infection status

表4 NADPH氧化酶基因His72Tyr與等位基因分布Table 4 Distribution of NADPH oxidase gene His72Tyr polymorphism genotypes and alleles

a: 按照性別、年齡、飲食習慣、飲酒、吸煙狀況和H.Pylori感染狀況調整
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status , smoking status and H.pylori infection status

2.4 IOIA危險因素的多因素非條件Logistic回歸

為進一步分析IOIA的危險因素，將H.pylori感染狀況、G11367C和His72Tyr基因型作為自變量，以是否發(fā)生IOIA作為因變量Y(0：未患IOIA；1：患IOIA)，采用逐步后退法進行非條件Logistic回歸，主要變量賦值見表5。結果顯示，H.pylori感染、 G11367C和His72Tyr與IOIA發(fā)生有統計學關聯，見表6。

表5 非條件Logistic回歸分析變量賦值表Table 6 The variables in non-conditional logistic regression analysis

表6 IOIA危險因素的非條件Logistic回歸分析Table 6 The results of the non-conditional logistic regression analysis on the risk factors of IOIA

2.5 TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因His72Tyr多態(tài)性在IOIA發(fā)病中的交互作用

基因突變的協同分析發(fā)現G11367C(GC)/His72Tyr (TT)基因型者頻率在IOIA組和對照組的分布頻率分別為25.63%和3.75%，此基因型頻率經χ2檢驗在兩組之間有顯著性差異(P<0.01)。G11367C(GC)/His72Tyr(TT)基因型者患IOIA的風險顯著增加(OR=39.5731)，G11367C(GC)和His72Tyr(TT)基因型在IOIA發(fā)生、發(fā)展存在正向的交互作用 (γ2=β2*3/β3，γ3=β2*3/β2；γ2=2.0887，γ3=1.9856)，另外G11367C(GC)和His72Tyr(HT)之間也存在正向交互作用(γ>1) (表7)。

2.6 H.pylori感染和TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因His72Tyr多態(tài)性在IOIA發(fā)病中的交互作用

單純100≤DPM<500的H.pylori感染的ORe1為4.4111，單獨攜帶G11367C(GC)型的ORg為6.2879，兩者同時存在時，交互作用ORe1g為27.1020，交互系數γ=βe1g/βe=>1，ORe1g>ORe1×ORg為超相乘模型；另外數據分析顯示在DPM≥500和-C34G (CG) 之間也存在正向交互作用(γ=βe1g/βe=>1)(表8)。同樣在100≤DPM<500 和His72Tyr(HT)之間、100≤DPM<500 和 His72Tyr (TT)之間、DPM≥500 和His72Tyr(HT)之間及DPM≥500和His72Tyr(TT)在IOIA發(fā)生、發(fā)展中也存在正向交互作用(γ均大于1)(表9)。

表7 TLR4基因G11367C和NADPH氧化酶基因His72Tyr多態(tài)性在IOIA發(fā)病中的交互作用Table 7 Interaction of polymorphisms between TLR4 gene G11367C and NADPH oxidase gene His72Tyr in IOIA.

a: 按照性別、年齡、飲食習慣、飲酒、吸煙狀況和H.Pylori感染狀況調整;b: 單純His72Tyr雜合突變型暴露的OR值(OR1)；c: 單純His72Tyr純合突變型暴露的OR值( (OR2)；d: 單純G11367C雜合突變型暴露的OR值(OR3)；e: G11367C 雜合突變型和His72Tyr雜合突變型交互后的OR值 (OR1*3)；f: G11367C 雜合突變型和His72Tyr純合突變型交互后的OR值 (OR2*3)
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status;b: OR value by simple His72Tyr heterozygote exposure (OR1)；c: OR value by simple His72Tyr homozygous mutant exposure (OR2)；d: OR value by simple G11367C heterozygote exposure(OR3)；e: OR value by the interaction of G11367C heterozygote and His72Tyr heterozygote (OR1*3)；f: OR value by the interaction of His72Tyr homozygous mutant and G11367C heterozygote (OR2*3)

表8 H.pylori感染和TLR4基因G11367C多態(tài)性在IOIA發(fā)病中的交互作用Table 8 Interaction between H.pylori infection and TLR4 gene G11367C polymorphism in IOIA

a: 按照性別、年齡、飲食習慣、飲酒和吸煙狀況調整；b: 單純100≤DPM<500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe1)；c: 單純DPM≥500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe2)；d: 單純雜合突變型暴露的OR值 (ORg)；e: 100≤DPM<500 H.pylori感染與雜合突變型交互后的OR值 (ORe1g)；f: DPM≥500 H.pylori感染與雜合突變型交互后的OR值(ORe2g)
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status;b: OR value by simple 100≤DPM<500 exposure (ORe1)；c: OR value by simple DPM≥500 exposure (ORe2)；d: OR value by simple heterozygote type exposure (ORg)；e: OR value by the interaction of 100≤DPM<500 and heterozygote (ORe1g)；f: OR value by the interaction of DPM≥500 and heterozygote (ORe2g)

表9 兩組 H.pylori感染和NADPH氧化酶基因His72Tyr多態(tài)性在IOIA發(fā)病中的交互作用Table 9 Interaction between H.pylori infection and NADPH oxidase gene His72Tyr polymorphism in IOIA

a: 按照性別、年齡、飲食習慣、飲酒和吸煙狀況調整；b: 單純100≤DPM<500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe1)；c: 單純DPM≥500 H.pylori感染暴露的OR值(ORe2)；d: 單純雜合突變型暴露的OR值 (ORg1)；e: 100≤DPM<500 H.pylori感染與雜合突變型交互后的OR值 (ORe1g1)；f: DPM≥500 H.pylori感染與雜合突變型交互后的OR值(ORe2g1)；g: 單純純合突變型暴露的OR值e (ORg2)；h: 100≤DPM<500 H.pylori感染與純合突變型交互后的OR值 (ORe1g2)；i: DPM≥500 H.pylori感染與純合突變型交互后的OR值(ORe2g2)
a:adjusted according to gender, age, diet status, drinking status and smoking status;b: OR value by simple 100≤DPM<500 exposure (ORe1)；c: OR value by simple DPM≥500 exposure (ORe2)；d: OR value by simple heterozygote type exposure (ORg1)；e: OR value by the interaction of 100≤DPM<500 and heterozygote (ORe1g1)；f: OR value by the interaction of DPM≥500 and heterozygote (ORe2g1)；g: OR value by simple homozygous mutant type exposure (ORg2)；h: OR value by the interaction of 100≤DPM<500 and homozygous mutant (ORe1g2)；i: OR value by the interaction of DPM≥500 and homozygous mutant (ORe2g2)

3 討論

TLR4在自然配體LPS作用下導致NF-κB激活從而釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β( IL-1β)等大量炎癥因子，這些細胞因子可調控骨的吸收或轉化，在破骨細胞生成的早期，能誘導骨組織中破骨細胞活化因子的表達，刺激較原始的破骨細胞前體分裂和增殖， 促進破骨細胞形成及骨吸收，從而導致局部或全身的骨質疏松。另外上述的TNF-α、 IL-1β等各種炎癥因子大量分泌入血，進而發(fā)生全身性低度慢性炎癥反應，最終使機體發(fā)生了胰島素抵抗，胰島素抵抗通過影響腎1a-羥化酶的活性，影響腎對鈣磷的調節(jié)， 以及繼發(fā)甲狀旁腺激素等激素分泌異常從而干擾骨代謝，胰島素敏感性降低還引起蛋白質代謝障礙，蛋白質分解增加，合成受抑制，而蛋白質是構成骨架的基本物質，其減少可導致骨質減少，使鈣、 磷不能在骨骼中沉積，造成骨質疏松[11]。人類TLR4基因定位于9q329q33，目前研究較多的是Asp299Gly 和Thr399Ile變異，但這兩個多態(tài)位點在中國人群中非常罕見。研究發(fā)現在中國正常人群中發(fā)現TLR4基因3′未翻譯區(qū)(3′UTR)11367位點的多態(tài)性，此突變屬于功能性變異，可改變血液和組織中TLR4的表達，影響其生物學效應。TLR4基因3′未翻譯區(qū)11367多態(tài)性具有三種基因型: 野生型純合子G11367C(GG)、雜合子G11367C(GC)和突變純合子G11367C(CC)，國內外已有研究報道認為G11367C位點的多種炎性疾病有關[12-13]。本研究各組未發(fā)現突變純合子G11367C(CC)基因型，發(fā)現雜合子G11367C(GC)基因型與IOIA發(fā)生、發(fā)展有關，與對照組比較差異有統計學顯著性，攜帶G11367C(GC)基因型者患IOIA的風險高于攜帶G11367C(GG)的個體(OR=6.1442，95% CI 3.4725-9.8036，P<0.01)，與G11367C位點變異增加炎癥相關性疾病發(fā)病風險的結論一致。G11367C(GC)基因型基因型者易患IOIA的機理還不清楚，相關研究顯示C等位基因可能通過活化TLR4基因轉錄過程，增加TLR4表達，促進炎癥因子的釋放，降低胰島素敏感性[14]，從而增加IOIA發(fā)生的危險性。

人體過多的活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)能抑制成骨家屬譜系細胞的增殖分化，導致成骨家屬譜系細胞的死亡，促進破骨細胞形成和分化，在骨質疏松的發(fā)生過程中起重要作用[15,16]。氧化應激機制中，NADPH氧化酶是生成活性氧簇的主要來源，其主要亞基中質膜結合成分p22phox為跨膜亞基，是NADPH氧化酶酶促的核心作用部分，p22phox亞基的多態(tài)性影響NADPH氧化酶的功能。位于16號染色體4號外顯子上的第242密碼子存在C→T基因突變, 使得編碼的72號氨基酸由組氨酸變?yōu)槔野彼帷?2號組氨酸殘基是p22phox結合血紅素的部位，由于基因的改變使p22phox結合血紅素的能力下降,從而影響了NADPH氧化酶的活性[17]。研究證明NADPH氧化酶p22phox亞基基因His72Tyr多態(tài)性可增加氧化應激相關疾病如冠心病、腦血管疾病等的的發(fā)病率[18,19]。本研究發(fā)現His72Tyr (HT)和His72Tyr(TT)基因型與IOIA的發(fā)生有關，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，攜帶His72Tyr (HT)和His72Tyr(TT)基因型者患IOIA的風險高于攜帶His72Tyr(HH)的個體(OR=6.7773，95% CI 3.4192-10.2130，P<0.01；OR=6.4737，95% CI 3.1795-10.2159，P<0.01)，與相關研究結果一致。

IOIA是涉及環(huán)境因子和多種基因相互作用的復雜過程，本研究提示TLR4基因G11367C雜合突變型與NADPH氧化酶基因His72Tyr突變基因型的個體屬 IOIA高危險人群, IOIA診治方案中應加以重視。雖然尚不能通過改變其 IOIA易感的基因型來防治 IOIA，但可以通過TLR4基因G11367C與NADPH氧化酶基因His72Tyr基因檢測，預測個體發(fā)生 IOIA的風險性，采取相應的控制環(huán)境病因的措施如根除H.Pylori或調控基因表達以達到有效預防 IOIA的目的。另外通過基因預測個體成年后發(fā)生 IOIA的風險性，為預測運動員的發(fā)展前途、早期選拔運動員提供參考。