孫乃坤,王耀宗,劉志剛,付代杰,尚希福,李旭
(1.廈門大學附屬第一醫(yī)院 骨科,福建 廈門 361003;2.廈門大學附屬中山醫(yī)院 骨科,福建 廈門 361003;3.吉林大學附屬第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130041;4.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院 骨二科,安徽 合肥 230001)
木犀草素對骨肉瘤干細胞增殖的影響
孫乃坤1Δ,王耀宗2,劉志剛3,付代杰4,尚希福4,李旭4
(1.廈門大學附屬第一醫(yī)院 骨科,福建 廈門 361003;2.廈門大學附屬中山醫(yī)院 骨科,福建 廈門 361003;3.吉林大學附屬第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130041;4.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院 骨二科,安徽 合肥 230001)
目的 研究木犀草素對骨肉瘤干細胞增殖的影響。方法 用免疫磁珠分選法分離人骨肉瘤細胞株MG-63中的CD133+骨肉瘤干細胞。MTT法檢測0、0.01、0.02、0.04 mg/mL木犀草素溶液對骨肉瘤干細胞增殖的影響。Western blot檢測木犀草素對骨肉瘤干細胞Ki67蛋白以及對骨肉瘤干細胞JAK2/STAT3信號通路的影響。結果 用免疫磁珠分選法,得到比率為(87.60±5.06)%的骨肉瘤干細胞。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn),與對照組比較,0.01、0.02、0.04 mg/mL木犀草素能夠抑制骨肉瘤干細胞的增殖(P<0.05)。Western blot實驗表明,與對照組比較,木犀草素各濃度抑制骨肉瘤干細胞Ki67蛋白的表達(P<0.05)。與對照組比較,木犀草素各濃度組對骨肉瘤干細胞JAK2/STAT3信號通路中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達具有抑制作用(P<0.05)。結論 木犀草素對骨肉瘤干細胞具有抑制作用。
木犀草素;骨肉瘤干細胞;增殖;Ki67;JAK2/STAT3信號通路
骨肉瘤是臨床相對常見的惡性腫瘤,多發(fā)于少兒或青少年,該病預后不良,相當多的患者因該病而死亡[1]。近幾年來,隨著保肢手術的不斷發(fā)展以及全新化療藥物的研制成功,骨肉瘤的療效有了較大的提高。但是,轉移以及復發(fā)的骨肉瘤患者預后差,并且繼發(fā)轉移以及耐化療藥物骨肉瘤的出現(xiàn)仍然是嚴重的問題[2]。
木犀草素是來源于植物的一種黃酮類物質,木犀草素能夠抑制骨肉瘤細胞的生長增殖,干擾骨肉瘤細胞新陳代謝從而誘導其凋亡,對于骨肉瘤的治療具有較高的應用價值[3]。骨肉瘤細胞株中存在腫瘤干細胞[4]。但是木犀草素對骨肉瘤干細胞增殖的影響未見報道?,F(xiàn)有的治療手段并沒有將腫瘤干細胞完全殺滅,只要有腫瘤干細胞的存在,骨肉瘤就可以繼續(xù)自我更新和不斷增殖分化重新形成腫瘤,導致復發(fā)和轉移[5]。因此研究新的針對腫瘤干細胞的藥物有很重要的現(xiàn)實意義[6]。
本研究旨在從MG63中分離骨肉瘤干細胞,并且探討木犀草素對骨肉瘤干細胞的抑制效應及其機制,為臨床治療骨肉瘤提供依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 細胞系:MG63骨肉瘤細胞系購自廈門大學。
1.1.2 試劑:DMEM高糖細胞培養(yǎng)液、0.02% EDTA+0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司),木犀草素、二甲基亞砜(DMSO)、MTT噻唑藍(美國Sigma公司),人CD133+細胞分選試劑盒(德國Miltenyi Biotec公司),GAPDH(上海康成生物工程有限公司),BCA蛋白定量試劑盒、Ki67單克隆抗體、小鼠抗兔二抗(美國Cell Signaling Tec公司)。
1.1.3儀器:恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),多功能酶標儀(德國Miltenyi BioTec公司),流式細胞分選儀BD FACSAria II、流式細胞儀ACSCalibur(美國Becton Dickinson公司)
1.2 方法
1.2.1 骨肉瘤細胞系的培養(yǎng):將MG63骨肉瘤細胞(1×106/mL)培養(yǎng)在25 cm2培養(yǎng)瓶里的DMEM-高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2~3 d換液一次,每3~4 d傳代一次。用混合消化液(0.02% EDTA+0.25%胰蛋白酶)進行消化,然后收集細胞離心1 000 r/min,5 min,傳代培養(yǎng)。
1.2.2 CD133+骨肉瘤干細胞分選:將培養(yǎng)瓶中的MG63骨肉瘤細胞進行消化離心,重懸浮后,按CD133免疫磁珠分選試劑盒說明書操作,計數(shù)1×108個細胞,用300 μL分選緩沖液重懸,加入FcR阻斷試劑和CD133磁珠試劑各100 μL,4 ℃溫育30 min后清洗,MACS磁性分選柱分離出CD133+細胞,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng),分選后取用傳4~6代的細胞用于實驗。應用流式細胞儀分析測定CD133+干細胞的純度。
1.2.3 細胞分組及培養(yǎng):將CD133+細胞以每孔1×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板,設6個復孔。待細胞細胞貼壁后每孔加入木犀草素,使終濃度依次為0、0.01、0.02、0.04 mg/mL。置于常規(guī)條件培養(yǎng)24 h。
1.2.4 MTT法檢測木犀草素對骨肉瘤干細胞增殖的影響:按1.2.3中方法培養(yǎng)細胞,分別向每孔加入濾過的5 mg/mL MTT工作液繼續(xù)培養(yǎng)5 h后終止培養(yǎng)。棄去96孔板原有液體,每孔加入150 μL DMSO,充分溶解后在λ=490 nm處檢測各孔吸光度(A值)。
1.2.5 Western blot檢測木犀草素對骨肉瘤干細胞Ki67蛋白及JAK2/STAT3信號通路的影響:按1.2.3中方法培養(yǎng)細胞,將細胞用冷的PBS洗2次,使用RIPA裂解液(添加蛋白酶抑制劑cocktail)裂解細胞,4℃,12000g離心5 min,取上清,BCA法定量細胞總蛋白濃度,每組樣品取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳,電泳完畢后將蛋白從膠轉移至PVDF膜上,100 V轉膜1 h。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入鼠抗Ki67、兔抗JAK2、兔抗STAT3、兔抗p-JAK2、兔抗p-STAT3及GAPDH的抗體作為一抗,以GAPDH作為內參,37 ℃孵育2 h。HRP標記的山羊抗兔、山羊抗鼠作為二抗,37 ℃孵育1 h。加入ECL顯色液,膠片曝光檢測蛋白表達,使用IPP6.0灰度掃描軟件分析蛋白相對表達水平。
2.1 免疫磁珠分選后CD133+骨肉瘤干細胞比例 利用免疫磁珠分選技術,從MG63普通骨肉瘤細胞中分選CD133+的骨肉瘤細胞,分選后的CD133+陽性比例從(1.12±0.03)%上升到(87.6±5.06)%(P<0.001),見圖1。
圖1 CD133+骨肉瘤干細胞分選前后所占的細胞比例***P<0.001,與分選前相比Fig.1 Proportion of CD133+ osteosarcoma stem cells pre- and ***P<0.001,compared with pre-separation
2.2 木犀草素對骨肉瘤干細胞增殖的影響 MTT結果顯示,木犀草素各濃度組與對照組吸光度差異有統(tǒng)計學意義(F=52.76,P<0.05)。加木犀草素的CD133+骨肉瘤干細胞的增殖率[0.01 mg/mL(71.81±5.31)%、0.02 mg/mL(51.06±4.72)%、0.04 mg/mL(36.09±2.82)%]明顯低于對照組(89.65±6.04)%,經(jīng)進一步兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。結果表明,隨著木犀草素濃度的增大,骨肉瘤干細胞的增殖率逐漸減小。見圖2。
圖2 MTT法檢測不同濃度木犀草素對CD133+骨肉瘤干細胞增殖的影響*P<0.05,與對照組相比Fig.2 Effect of luteolin at different concentrations on the proliferation of CD133+ sosteosarcoma stem cells by MTT(n=5,±s)*P<0.05,compared with control group
2.3 木犀草素對骨肉瘤干細胞Ki67蛋白表達的影響 木犀草素各濃度組與對照組Ki67蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=46.67,P<0.05)。加木犀草素的CD133+骨肉瘤干細胞的Ki67蛋白表達[0.01 mg/mL(0.87±0.09)、0.02 mg/mL(0.62±0.08)、0.04 mg/mL(0.42±0.03)]明顯低于對照組(1.00±0.11)(n=3),經(jīng)進一步兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。結果表明,隨著木犀草素濃度的增大,骨肉瘤干細胞Ki67蛋白表達明顯受抑制。見圖3。
圖3 木犀草素對CD133+骨肉瘤干細胞Ki67蛋白表達的影響Fig.3 Effect of luteolin at different concentrations on Ki67 expression in CD133+ osteosarcoma stem cells
2.4 木犀草素對骨肉瘤干細胞JAK2/STAT3信號通路的影響 木犀草素各濃度組與對照組磷酸化JAK2蛋白(F=67.03)和磷酸化STAT3蛋白(F=81.72)表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明木犀草素能抑制骨肉瘤干細胞JAK2/STAT3信號通路。結果顯示,隨著木犀草素濃度的增加,JAK2/STAT3信號通路明顯受抑制。見圖4、表1。
圖4 木犀草素對CD133+骨肉瘤干細胞JAK2/STAT3信號通路的影響Fig.4 Effect of luteolin at different concentrations on JAK2/STAT3 signal pathway in CD133+ osteosarcoma stem cells
木犀草素濃度(mg/mL)JAK2p?JAK2STAT3p?STAT30100±009100±010100±008100±008001098±009071±006099±010068±006002106±012050±007102±009055±007004097±008032±005107±011028±005
骨肉瘤主要來源于間葉細胞,是由具有極強惡性增殖能力的肉瘤細胞產(chǎn)生的不成熟骨組織或者骨腫瘤性組織,是最常見的原發(fā)骨腫瘤,好發(fā)于青少年[2,7-9]。轉移對骨肉瘤的預后有重要影響,多項研究表明[10-12]在骨肉瘤轉移進程中,腫瘤的轉移及侵襲與腫瘤干細胞密切相關。腫瘤干細胞的存在是腫瘤進展、轉移、復發(fā)和耐藥的根源[13-14]。目前腫瘤治療失敗的原因,很可能就是沒有針對腫瘤干細胞的有效藥物[15]。因此對骨肉瘤干細胞進行分離,并且研究新的針對腫瘤干細胞的藥物有很重要的現(xiàn)實意義。
木犀草素是一種天然黃酮類化合物,存在于多種植物中[16]。最初是從木犀草科分離出而得名,可從多種天然藥材、蔬菜果實中分離得到。木犀草素具有豐富的藥理及生物學活性,如消炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等,有著廣闊的應用前景[17-20]。近年來,木犀草素的抗癌活性引起人們的關注。木犀草素對多種腫瘤細胞的增殖具有不同程度的抑制作用,如肝癌、前列腺癌、胃癌、食管癌等,機制包括抑制腫瘤細胞增殖,停止細胞生長周期,促進細胞凋亡,抑制血管生成,抑制DNA拓撲異構酶,抗氧化、抗突變等[21-24]。蔡良真[25]采用臺盼藍拒染法檢測木犀草素對HL-60細胞體外增殖,發(fā)現(xiàn)木犀草素能顯著地抑制HL-60細胞增殖,并呈時間-劑量效應。王旭光等[26]發(fā)現(xiàn),木犀草素在誘導K562細胞凋亡過程中存在Caspase-3的活化,提示木犀草素可能通過激活Caspase-3誘導K562細胞凋亡。同時,Chen等[27]發(fā)現(xiàn)木犀草素能通過抑制IGF-1而使前列腺癌PC-3和DU145細胞中IGF-1R、AKT活化,AKT的抑制可使其下游蛋白p70S6K1,GSK-3beta和FKHR/FKHRL1的磷酸化。木犀草素也能抑制IGF-1誘導的EGFR和MAPK/ERK途徑的激活,抑制cyclinD1的表達,增加p21的表達,從而抑制了前列腺癌細胞的增殖[27-29]。
王永宏等[30]研究表明,木犀草素對骨肉瘤細胞也有很強的抑制效應,研究發(fā)現(xiàn)木犀草素對于骨肉瘤細胞MG63的生長、增殖、運動遷移能力、穿膜細胞數(shù)量以及IL-6蛋白表達水平均有一定的抑制作用,并且其抑制作用隨著木犀草素濃度的增加而逐漸增強,說明木犀草素對于骨肉瘤細胞具有極強的抑制作用,但其作用機制仍不清楚。木犀草素對骨肉瘤干細胞的研究也未見報道。
在本研究中,采用免疫磁珠分選法從MG63骨肉瘤細胞中分離出純度較高CD133+骨肉瘤干細胞。經(jīng)木犀草素處理后,骨肉瘤干細胞的增殖受到抑制,明顯不如未經(jīng)木犀草素處理及低濃度木犀草素處理的骨肉瘤干細胞生長狀況(P<0.05),初步證實木犀草素能夠抑制骨肉瘤干細胞的生長增殖。為進一步探明木犀草素可能對骨肉瘤干細胞增殖存在的抑制效應,本研究還從分子水平上分析了木犀草素對增殖標志物Ki67和增殖相關信號通路JAK2/STAT3通路的影響。本研究結果顯示,木犀草素處理可顯著降低Ki67表達及磷酸化JAK2蛋白和磷酸化STAT3蛋白的表達(P<0.05)。表明木犀草素能抑制骨肉瘤干細胞增殖及JAK2/STAT3信號通路。其中,JAK2/STAT3信號通路是一種與細胞增殖關系密切的信號通路,而且目前已證實其高表達和異??纱龠M腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,并與多種惡性腫瘤患者愈后差呈正相關[31-33]。劉艷武等[34]證實抑制JAK2/STAT3信號通路能夠抑制人骨肉瘤細胞的活性。JAK/STAT通路對體內多種信號的轉導都非常的關鍵[35-37]。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2,這4個蛋白結構及功能相似。JAK的活化在細胞增殖、分化、遷移及凋亡中均有重要的作用[38-39]。結構活化的JAKs會使細胞內許多重要的物質磷酸化,其中包括STAT家族,STAT家族中的STAT3與許多腫瘤的信號通路相關[40-41]。結構活化后的STAT3和人實體腫瘤細胞的存活與生長關系密切[42]。STAT3還可上調人腫瘤細胞抗凋亡基因編碼的Mcl-1、Bcl-xL蛋白[43-44]。磷酸化的STAT3是一種腫瘤快速生長的標志。更為重要的是活化的JAK2/STAT3信號作為治療實體腫瘤一個重要的目標分子已經(jīng)被廣泛地確認其有效性[31,45-47]。
綜上所述,使用木犀草素處理的骨肉瘤干細胞其增殖能力顯著降低,并且與細胞增殖密切相關的Ki67蛋白表達和JAK2/STAT3信號通路均受到抑制,并且其抑制程度隨著木犀草素濃度的升高而增強。
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(編校:王儼儼)
2016中國生化藥物前沿-精準醫(yī)學·創(chuàng)新藥物學術論壇暨《中國生化藥物雜志》編委會年會會議通知
由中國藥學會生化與生物技術藥物專業(yè)委員會、北京大學藥學院、浙江大學藥學院、分子腫瘤學國家重點實驗室、天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室、醫(yī)視界共同主辦,《中國生化藥物雜志》和北京數(shù)字時代科技有限公司共同承辦的“2016中國生化藥物前沿-精準醫(yī)學·創(chuàng)新藥物學術論壇暨《中國生化藥物雜志》編委會年會”將于2016年12月8日-10日在北京召開。
一、大會組織
主辦單位:
中國藥學會生化與生物技術藥物專業(yè)委員會
北京大學藥學院
浙江大學藥學院
分子腫瘤學國家重點實驗室
天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室
醫(yī)視界
承辦單位:
《中國生化藥物雜志》
北京數(shù)字時代科技有限公司
大會主席:詹啟敏
二、大會網(wǎng)站:2016fafbp.cbcpharm.com
三、聯(lián)系方式
學術聯(lián)系人:吳 茜 010-84280076-8720;13581939531
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DOI:10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.007
Effects of luteolin on proliferation of osteosarcoma stem cells
SUN Nai-kun1Δ, WANG Yao-zong2, LIU Zhi-gang3, FU Dai-jie4, SHANG Xi-fu4, LI Xu4
(1.Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, China; 2.Department of Orthopaedics, Zhongshan Hospital, Xiamen University, Xiamen 361003, China; 3.Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, China; 4.Department of Orthopaedics, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001, China)
ObjectiveTo explore the effect of luteolin on the proliferation of osteosarcoma stem cells.MethodsCD133+osteosarcoma stem cells were separated from MG63 cells by flow cytometer.MTT was used to investigate the effects of luteolin(0,0.01,0.02,0.04 mg/mL)on the proliferation of osteosarcoma stem cells.Western blot was used to detect the levels of Ki67 protein and components of JAK2/STAT3 signal pathway in osteosarcoma stem cells induced.ResultsAfter sorting,the content of the CD133+fraction was enriched up to(87.60±5.06)%.MTT assay showed that,compared with the control group,luteolin(0.01,0.02,0.04 mg/mL)inhibited proliferation of CD133+osteosarcoma stem cells(P<0.05).Western blot also showed that luteolin significantly decreased the level of Ki67 compared with the control group(P<0.05).In addition,the luteolin inhibited the expression of p-JAK2 and p-STAT3 in JAK2/STAT3 signal pathway of CD133+osteosarcoma stem cells compared with the control group(P<0.05).ConclusionLuteolin might be a suppressor of osteosarcoma stem cells.
luteolin;osteosarcoma stem cells;proliferation;Ki67;JAK2/STAT3 signal pathway
10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.006
安徽省教育廳自然科學基金(KJ2001Z204)
孫乃坤,通信作者,男,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:骨科疾病,E-mail:sunnaikunsnk@163.com。
R738.1
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