陳釀時間對發(fā)酵型香菇酒香氣成分及酒體風味的影響

王大為，馬巖石，李 娜，金鳳石（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

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陳釀時間對發(fā)酵型香菇酒香氣成分及酒體風味的影響

王大為，馬巖石，李 娜，金鳳石
（吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對發(fā)酵型香菇酒陳釀早期香氣成分變化進行動態(tài)檢測，通過峰面積歸一法計算各香氣成分相對含量，并結(jié)合相對香氣活度值（relative odor activity value，ROAV）進行分析。結(jié)果表明：發(fā)酵型香菇酒在陳釀早期形成大量香氣成分，檢出54 種，其中1-辛烯-3-醇、異戊醇、癸酸乙酯等8 種揮發(fā)性香氣化合物是發(fā)酵型香菇酒具有獨特風味的主要原因。陳釀早期香菇酒香氣成分變化較大，醇類與酸類香氣物質(zhì)的相對含量總體下降，酯類香氣物質(zhì)相對含量明顯上升，其他類香氣物質(zhì)變化不大。陳釀60 d及陳釀180 d的成品香菇酒的香氣成分相對含量及ROAV，差異不顯著（P＞0.05）。證明在陳釀早期即形成了發(fā)酵型香菇酒的主體香，提示生產(chǎn)中可適當縮短發(fā)酵型香菇酒的陳釀時間，縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。

香菇酒；陳釀；氣相色譜-質(zhì)譜法；香氣成分

香菇（Lentinus edodes （Berk.） Sing），又名花菇、香蕈，僅次于雙孢蘑菇的世界第二大菇類食用菌。我國是世界上最大的香菇生產(chǎn)、出口國和消費國，香菇產(chǎn)量占世界香菇總量的80%左右［1］。香菇營養(yǎng)價值高，是重要的藥食兼用菌類，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖與維生素，其中麥角甾醇含量比大豆高20 倍，是海帶的8 倍［2］。另外，香菇還具有降低膽固醇，預防心血管病、糖尿病、佝僂病、抗病毒及抗腫瘤等功效［3］。

目前，香菇主要作為蔬菜以干、鮮形式銷售，消費形式單一且附加值低，香菇的綜合利用與精深加工已成為促進香菇產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的重中之重［4］。發(fā)酵型香菇酒是以香菇為原料發(fā)酵而成的含酒精飲料［5-7］，不僅能夠保留香菇本身的有效成分，還可以通過發(fā)酵、陳釀，富集有益的發(fā)酵產(chǎn)物，提高香菇的應用價值。酒中香氣成分是決定酒風味重要因素之一，是確定酒體風格的重要指標。陳釀是一個緩慢且復雜的物理、化學和生物化學變化過程，隨著陳釀時間的延長，經(jīng)過氧化還原、酯化和聚合沉淀作用后，一些不良風味減少，芳香物質(zhì)增加，酒體變得柔順、協(xié)調(diào)，形成持久穩(wěn)定的特殊酒香及典型性風格特征。傳統(tǒng)釀造工藝陳釀時間多在180 d以上，以達到完美的酒體香型與風格，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)效率低，占用設(shè)備多，占地面積大。近年來，關(guān)于其他飲料酒在陳釀過程中風味成分變化的研究很多［8-10］，但對于香菇酒研究卻鮮見報道。本研究采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase micro extraction，HS-SPME）方法［11-12］對發(fā)酵型香菇酒的香氣物質(zhì)進行收集萃取，并用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對成品香菇酒及陳釀早期（15、30、45、60 d）香菇酒的香氣物質(zhì)進行檢測分析，通過相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法獲得陳釀早期不同時間段主體香氣成分的變化，探索香菇酒陳釀早期的風味物質(zhì)變化規(guī)律，并與陳釀180 d的香菇酒芳香成分進行比較，為縮短發(fā)酵型香菇酒陳釀時間，提高生產(chǎn)效率提供科學數(shù)據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇干品（含水量13%）、綿白糖（符合GB 1445—2000《綿白糖》一級品要求）、酵母營養(yǎng)劑（食品級）市售；水（符合GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》要求） 實驗室自供；釀酒高活干酵母 廣西丹寶利酵母有限公司；2-辛醇（分析純） 上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1502CN型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；VS-1300型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CT15RT型離心機 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；干燥/培養(yǎng)兩用箱 上海一恒科學儀器有限公司；5975-6890N GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；手動SPME進樣器 美國鉑金-埃爾默公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯（polydimethylsiloxane/ divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇酒釀制工藝流程

調(diào)整香菇漿料的糖酸比例后再接種經(jīng)活化及馴化處理的釀酒酵母并在適當?shù)臈l件下發(fā)酵［5］，其工藝流程如下。

1.3.2 操作要點

按配方準確稱取干香菇，用流動水沖洗去除雜質(zhì)，按料水比1∶10（g/g）加入24 ℃水浸泡至香菇無硬芯，瀝干，置于沸水中漂燙冷卻，破碎得到3～5 mm的顆粒料，調(diào)配、殺菌軟化處理8～10 min，冷卻，加入質(zhì)量分數(shù)20%糖，調(diào)整初始糖度與pH值為3.5，添加質(zhì)量分數(shù)1.2%活化及馴化酒酵母，置于27 ℃進行發(fā)酵，發(fā)酵期間要隨時檢測糖度、pH值。7 d后，酒液中的糖度不再變化，酒精體積分數(shù)達到12%時結(jié)束發(fā)酵。于溫度18 ℃條件下進行陳釀，然后過濾、澄清處理、經(jīng)巴氏殺菌、灌封即為香菇酒成品。

1.3.3 香菇酒香氣成分萃取

分別取陳釀早期15、30、45、60 d酒樣及陳釀180 d的香菇酒成品5 mL，加入20 mL頂空瓶中，采用HSSPME的方法對香菇酒中的揮發(fā)性香氣成分進行萃取收集，將SPME針管穿透頂空瓶的密封墊，加入微型轉(zhuǎn)子進行攪拌，在60 ℃條件下進行水浴平衡20 min［13-14］。待揮發(fā)性物質(zhì)與上部空氣、下部溶液互相平衡后，停止攪拌，推手柄使纖維頭伸出，在水浴60 ℃條件下萃取吸附40 min，萃取完畢后，將萃取針插入GC進樣口，在250 ℃條件下解吸3 min，用于GC-MS聯(lián)用分析。每次取相同樣品3 次進行平行樣測量，提高結(jié)果準確度。

1.3.4 GC-MS條件

GC條件：HP-INNO Wax毛細管色譜柱（60 m× 250 μm，0.25 μm）；手動進樣；進樣口溫度250 ℃；載氣為He；載氣流量為1.0 mL/min；不分流進樣；升溫程序：柱初始溫度60 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升溫至100 ℃，以10 ℃/min升溫至250 ℃保持10 min，汽化室溫度250 ℃。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；接口溫度260 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 20.00～450.00。

1.3.5 香氣成分定性及定量分析

測定結(jié)果通過計算機檢索與NIST 05提供的標準質(zhì)譜對照，當匹配度大于85%的鑒定結(jié)果時為有效。再利用C6～C20正構(gòu)烷烴計算各個化合物的保留指數(shù)（retention index，RI），結(jié)合文獻報道對化合物進行定性分析。

采用面積歸一化法定量計算香菇酒中揮發(fā)性香氣成分相對含量，重復3 次，取平均值。并在每次測量中加入相同質(zhì)量濃度的內(nèi)標物2-辛醇（0.955 mg/mL，無水乙醇），以排除不同陳釀階段揮發(fā)性成分相對含量變化的不準確性及誤差。

1.3.6 主體風味成分確定

采用ROAV法［15］評價揮發(fā)性成分對香菇酒風味影響的大小。定義對樣品風味貢獻最大的組分為ROAVstan=100，其他組分（A）的ROAV按下式計算：

式中：CA、TA分別為各揮發(fā)性組分的相對含量/%和香氣閾值/（μg/kg）；Cstan、Tstan分別為對樣品風味貢獻最大組分的相對含量/%和香氣閾值/（μg/kg）。

1.3.7 陳釀早期香菇酒與陳釀完成香菇酒香氣成分差異性分析

利用SPSS軟件采用t檢驗法對陳釀60 d香菇酒與陳釀180 d香菇成品酒的香氣成分相對含量及ROAV的差異顯著性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳釀早期香菇酒香氣成分

在香菇酒的不同陳釀時期（陳釀15、30、45、60 d 和180 d），采用HS-SPME的方法對香菇酒香氣成分進行富集萃取，經(jīng)過GC-MS聯(lián)用儀分析鑒定，面積歸一法計算各香氣成分相對含量（除乙醇外）。

圖1 香菇酒香氣成分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components of fermented Lentinula edodes wine

表1 陳釀 不同 階段 香菇 酒香 氣成 分G C-MS 分析 結(jié)果Table 1 Changes in aromacomp on ents of the Le nt in u la ed od esw in e du r in g a g in g

續(xù)表1

2.2 香菇酒主體風味的確定

采用ROAV分析各個組分對樣品總體風味形成的貢獻程度［20-21］。香菇中的揮發(fā)性成分主要有八碳化合物和含硫化合物［22-23］，含硫化合物的形成受pH值與溫度的影響很大，由于在香菇酒釀造過程中pH值在不斷變化，使含硫化合物降解，因此并未檢測到含硫化合物。在陳釀過程中檢測到以1-辛烯-3-醇代表的八碳化合物，根據(jù)表1中部分化合物的香氣閾值及相對含量，1-辛烯-3-醇在陳釀早期不同階段的相對含量均在1%以上，且香氣閾值為1 μg/kg，對香菇酒特殊風味的形成貢獻最大，為構(gòu)成酒特征性香氣的組分之一，因此以1-辛烯-3-醇在陳釀早期不同階段中ROAVstan=100［24-26］，計算得到其他化合物的ROAV；當ROAV不小于1時，確定為揮發(fā)性物質(zhì)為香菇酒的主體風味成分；當0.1≤ROAV＜1時，確定為揮發(fā)物質(zhì)對香菇酒總體風味具有重要貢獻［15］。表2所示在陳釀不同階段香菇酒ROAV，大于0.1的香氣化合物，共有24 種，其中1-辛烯-3-醇、異戊醇、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、正己酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇及辛酸乙酯有較高的ROAV，并對香菇酒總體香氣具有重要影響，賦予香菇酒獨特的香氣及風格。隨著時間的變化，各種香氣成分相對含量亦發(fā)生變化，使香菇酒的香氣趨于穩(wěn)定、持久，酒體純凈、細致、柔順。

表2 香菇酒揮發(fā)性成分的ROAVTable2 RO AV of volatile flavor comp ounds in Le nt in u la ed od esw in e s ag ed for differ en t day s

2.3 陳釀期間香菇酒芳香物質(zhì)分類

香菇酒的香氣是由原料香氣、發(fā)酵香氣和陳釀香氣組成［27］。在香菇酒的陳釀過程中，氧化作用、還原作用、酯化作用等化學反應使香菇酒的香氣向更濃厚、持久、穩(wěn)定的方向轉(zhuǎn)化，趨于平衡、融合、協(xié)調(diào)。其主要芳香物質(zhì)包括醇類、酸類、酯類以及其他類化合物［28］。由表1可知，在陳釀15、30、45、60 d的不同階段香菇酒香氣成分種類數(shù)量及相對含量分別為40（（92.23±3.71）%）、44（（92.39±3.70）%）、43（（96.41±3.90）%）、45 種（（96.62±4.20）%）。共檢測出香氣成分54 種，各階段都含有的香氣成分33 種。如圖2所示，在香菇酒陳釀期間各類化合物的相對含量由高到低依次是醇類、酯類、酸類以及其他類化合物，其中相對含量最高的為醇類和酯類。

圖2 香菇酒香氣成分類型及相對含量Fig.2 The types and contents of aroma components in fermented Lentinula edodes wine

2.3.1 陳釀早期香菇酒醇類芳香物質(zhì)的變化

由表1與圖2A可知，醇類物質(zhì)的相對含量最高，對香菇酒香型特征的形成具有重要作用［29］。在陳釀15、30、45、60 d的香菇酒中醇類香氣物質(zhì)的種類及相對含量分別為11（（51.21%±1.27）%）、10（（48.18±0.92）%）、9（（49.32±0.67）%）、9 種（（47.65±0.90）%），相對含量呈減少趨勢。在陳釀早期，香氣成分相對含量較高的是異戊醇、苯乙醇、異丁醇及1-辛烯-3-醇。異丁醇雖然相對含量較高，但是其閾值高，ROAV小，其香氣體現(xiàn)性較弱。1-辛烯-3-醇是來自香菇原料的蘑菇香氣成分［30］，高級醇是酒精發(fā)酵過程產(chǎn)生的氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物，其含量受發(fā)酵條件、醪液理化指標及原料品質(zhì)等因素影響［31］。少量的高級醇不僅能夠賦予酒優(yōu)雅的香氣，同時又是其他香氣物質(zhì)的良好溶劑，對總體香型的形成具有重要的提攜作用［32］。隨著陳釀時間的延長，除苯乙醇與（R）-（+）-β-香茅醇外，其他醇類物質(zhì)的相對含量減少，說明在陳釀過程中一些醇類化合物發(fā)生了酯化、氧化還原等化學反應。

2.3.2 陳釀早期香菇酒酯類芳香物質(zhì)的變化

由表1和圖2B可知，在陳釀早期香菇酒酯類芳香物質(zhì)的相對含量略少于醇類香氣物質(zhì)。但是酯類香氣物質(zhì)的種類多于醇類香氣物質(zhì)。在陳釀15、30、45、60 d時香菇酒中酯類香氣物質(zhì)的種類及相對含量依次是21（（38.94±1.92）%））、23（（41.80±1.99）%）、24（（43.77±2.46）%）、27 種（（46.02±2.4）%），種類與相對含量隨著陳釀時間的延長而增多。酯類是酒體香型的特征性成分，我國白酒的香型即以酯類的種類及含量進行分類。在香菇酒陳釀早期各個階段，癸酸乙酯、月桂酸乙酯及辛酸乙酯相對含量最高，除癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯及癸酸異戊酯的相對含量有所下降外，其他酯類物質(zhì)的相對含量都有明顯升高，在陳釀過程中，生成豐富酯類，形成香菇酒特殊的香型與風格，酒體柔和順暢，香氣豐滿持久。

2.3.3 陳釀早期香菇酒酸類芳香物質(zhì)的變化

在陳釀15、30、45、60 d時，香菇酒中酸類芳香物質(zhì)的種類及相對含量依次是3（（0.79±0.03）%），4（（0.37±0.02）%）、3（（0.24±0.03）%）、2 種（（0.12±0.04）%）。酸類物質(zhì)的種類及相對含量（除棕櫚酸外）都有所下降，在陳釀15 d時酸類香氣物質(zhì)的相對含量較高，在陳釀15～30 d時，酸類香氣物質(zhì)的相對含量下降明顯，在陳釀30 d后下降平緩，提示其可能與醇生成了酯類。由圖2C可知，相比于其他類香氣成分，酸類香氣物質(zhì)在香菇酒中香氣成分所占比例最少，但酸味物質(zhì)有助于提高香菇酒的利口性，酒體爽冽。

2.3.4 陳釀早期香菇酒其他類香氣物質(zhì)的變化

由圖2D可知，香菇酒陳釀15、30、45、60 d時還產(chǎn)生醛類、酚類、酮類、萜烯類以及烷烴類等芳香類化合物，種類及相對含量結(jié)果依次為：5（（1.29±0.49）%）、7（（2.04±0.77）%）、7（（3.08±0.74）%）、7 種（（2.83±0.86）%）。在陳釀15 d時其種類與相對含量最少，隨著陳釀時間的延長，種類及相對含量升高，在陳釀45 d時相對含量達到最高，陳釀60 d時又有下降趨勢。說明某些香氣物質(zhì)為中間產(chǎn)物，為香菇酒持久香氣成分的形成提供反應物。在這些化合物中個別組分例如萜烯類L-芳樟醇、香茅醇、反式石竹烯等雖然其相對含量低，但其感官閾值非常低，ROAV很高，香味獨特，為香菇酒的香氣組分的穩(wěn)定成分。

2.4 陳釀時間對香菇酒芳香成分及主體風格的影響

成品香菇酒陳釀180 d，香菇酒體呈琥珀色，澄清、有光澤，風味純正、持久，回味綿長。香菇酒香氣成分44 種，相對含量為（96.78±3.54）%。其中酯類香氣成分27 種，相對含量為（46.03±2.04）%。醇類香氣成分11 種，相對含量為（47.76±0.76）%。酸類香氣成分2 種，相對含量為（0.12±0.10）%。其他類香氣成分7種，相對含量為（2.87±0.64）%。香菇酒主體香氣成分為1-辛烯-3-醇、癸酸乙酯、異戊醇。對陳釀60 d及陳釀180 d香菇成品酒香氣成分相對含量及ROAV的差異性進行分析，差異不顯著（P＞0.05）。證明香菇酒陳釀60 d時香氣成分的種類及相對含量、香氣閾值與陳釀180 d的香菇酒差別較小，所以陳釀60 d已基本形成香菇酒的特征性香氣及風格，可適當縮短香菇酒陳釀時間，縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。

表3 陳釀60 d與陳釀180 d香菇酒香氣成分相對含量及ROAVt檢驗 結(jié)果Table3t-Te stresults of aroma compo ne ntsc on ten t and ROAV value of fermented L ent in u la edo des w in e sa ge d fo r60 and 18 0 d

3 結(jié) 論

采用HS-SPME法與GC-MS聯(lián)用技術(shù)對香菇酒陳釀早期香氣成分進行了動態(tài)檢測，共檢測出香氣成分54 種，共同擁有香氣成分33 種，綜合相對含量與ROAV分析，其中1-辛烯-3-醇、異戊醇、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、正己酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇及辛酸乙酯8 種物質(zhì)是香菇酒香型及風格的形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

在陳釀早期的不同階段，香菇酒的香氣成分種類以及相對含量都在變化，醇類物質(zhì)在整個陳釀早期的相對含量最高，呈下降趨勢；酯類物質(zhì)的種類最多，相對含量僅次于醇類物質(zhì)，呈上升趨勢；酸類物質(zhì)的種類及相對含量最低，呈下降趨勢；其他類化合物的變化不是很明顯。

陳釀過程是香氣形成的過程，初始的原料香氣及發(fā)酵香氣隨著陳釀時間的延長逐漸轉(zhuǎn)變成復雜濃郁的香菇酒香，酒體豐滿細膩，澄清透明具有光澤，口感柔順，香氣純凈。陳釀60 d的香菇酒芳香成分種類、相對含量、ROAV已接近陳釀180 d的成品香菇酒。證明適宜條件下可適當縮短陳釀時間，縮短香菇酒生產(chǎn)周期，提高發(fā)酵型香菇酒生產(chǎn)效率。

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Influence of Aging Time on Aroma Components and Full-Bodied Flavor of Fermented Lentinula edodes Wine

WANG Dawei， MA Yanshi， LI Na， JIN Fengshi
（College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

In order to investigate the influence of initial aging on aroma components in fermented Lentinula edodes wine，solid-phase micro extraction （SPME） and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） were applied to detect the dynamic changes in aroma components during initial aging stage.The relative contents of aroma components were calculated by a peak area normalization method and the contribution of each compound to the aroma was evaluated by relative odor activity value （ROAV）.The results indicated that a total of 54 aroma components were identified in the initial stage of wine aging.Among the tested components， 8 aroma components including 3-methyl-1-butanol， phenethyl alcohol， decanoic acid，and ethyl ester had larger effect upon the aroma than the others.As aging proceeded， the relative contents of esters and acids were decreased proportionally whereas the proportion of esters was increased significantly.The other aromas remained stable.The contents of aroma components and ROAV after aging for 60 and 180 d were not significantly different （P ＞ 0.05）.It was shown that the main aroma of the wine was formed in the early stage of aging， indicating that the aging time could be appropriately shortened during production， in turn shortening the production cycle and improving the production efficiency.

fermented Lentinula edodes wine； aging； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）； aroma components

10.7506/spkx1002-6630-201614014

TS261.4

A

1002-6630（2016）14-0080-06

王大為， 馬巖石， 李娜， 等.陳釀時間對發(fā)酵型香菇酒香氣成分及酒體風味的影響［J］.食品科學， 2016， 37（14）: 80-85.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614014. http://www.spkx.net.cn

WANG Dawei， MA Yanshi， LI Na， et al.Influence of aging time on aroma components and full-bodied flavor of fermented Lentinula edodes wine［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 80-85.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614014. http://www.spkx.net.cn

2016-02-10

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD16B08）；長春市科技計劃項目（14NK007）

王大為（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧油植物蛋白工程與功能食品。E-mail：xcpyfzx@163.com