青葉膽開花動態(tài)及有性生殖特征的解剖學研究

李　鸝，龍　華，張愛麗，黃衡宇*

(1 吉首大學 植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首 416000；2 云南中醫(yī)學院 中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，昆明 650500)

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青葉膽開花動態(tài)及有性生殖特征的解剖學研究

李鸝1，龍華1，張愛麗2，黃衡宇2*

(1 吉首大學 植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首 416000；2 云南中醫(yī)學院 中藥材優(yōu)良種苗繁育工程研究中心，昆明 650500)

摘要:對中國云南區(qū)域性特色藥用植物青葉膽(Swertia mileensis)單花開放、雌雄配子體形成、胚胎發(fā)育過程進行了觀察研究。結(jié)果顯示：(1)青葉膽繁殖生長始于每年8月底9月初，蕾期較長，一般為35 d左右；花期較短，2～3 d即完成開花；果實期最長，為40～45 d。(2)青葉膽具有一系列機制來保證其異花授粉，如：花藥為丁字著藥；雌雄異熟，雄蕊比雌蕊早熟23 h左右，在性成熟時間上二者僅有1～2 h的重疊期；此外，發(fā)現(xiàn)一種新的避免自花授粉機制，即雄蕊與雌蕊在空間上位置的變化，花藥正面由最先與雌蕊緊貼，倒轉(zhuǎn)180°后，變成背面面對雌蕊，同時花絲發(fā)生30°的偏移，導致花藥位置最后發(fā)生了210°的變化。(3)解剖學觀察顯示：青葉膽花藥4室，花藥壁發(fā)育為基本型，分化完全的花藥壁由5 層細胞組成；絨氈層單層，2型起源，為腺質(zhì)絨氈層，藥室內(nèi)的“類胎座”或“橫格”是早期該層細胞有絲分裂凸入藥室中央并原位退化形成的；中層2層；藥室內(nèi)壁退化；表皮宿存，纖維狀加厚。小孢子母細胞減數(shù)分裂為同時型，四分體排列方式主要為四面體形；成熟花粉為2-細胞或3-細胞類型。子房上位，2心皮，1室；側(cè)膜胎座，薄珠心，單珠被；倒生胚珠；大孢子母細胞減數(shù)分裂形成4個大孢子直線形排列，合點端的大孢子具功能，雌配子體發(fā)育為蓼型。3個反足細胞宿存，每個細胞均多核和異常膨大，反足吸器明顯，并在胚乳之外形成染色較深的類似“外胚乳”的結(jié)構(gòu)。珠孔受精，屬有絲分裂前類型。胚乳發(fā)育為核型；胚胎發(fā)育為茄型。果實成熟時，種子發(fā)育至早心形胚階段，具發(fā)達的胚柄。發(fā)達的反足細胞和胚柄結(jié)構(gòu)對青葉膽種子的后熟具有重要的生殖適應與進化意義。

關(guān)鍵詞:青葉膽；開花；胚胎學；獐牙菜屬；生態(tài)適應

青葉膽(SwertiamileensisT. N. Ho & W. L. Shi)為獐牙菜屬多枝組多枝系一年生草本[1]，主要分布于云南紅河州的彌勒、開遠等地，生于海拔1 300～1 650 m的荒坡稀疏小灌木叢或黃茅草叢間，生長在沙地的陽性山坡或向陽石灰?guī)r坡地上。青葉膽在云南紅河哈尼族、彝族地區(qū)用于治療肝炎等疾病具有悠久的歷史[2-3]，是中國藥典歷版(1977～2010)收載品種。青葉膽自20世紀70年代從云南省開遠、彌勒等地民間發(fā)掘出來后，即作為新的藥物資源被1974年版的《云南省藥品標準》以及1977～2010版的《中華人民共和國藥典》所收載。

近年來，國內(nèi)學者對青葉膽的化學成分以及藥理活性進行了一些研究，研究結(jié)果[4-5]表明青葉膽具有保肝、抗菌、降血糖、抗膽堿及解痙等多種藥理活性。由青葉膽水提取物開發(fā)研制的青葉膽片，廣泛應用于臨床治療急性病毒性肝炎，療效顯著，能夠明顯降低患者體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)水平[6]。隨著對青葉膽研究的愈加深入，市場對其的需求量也不斷擴大，而毀滅性的采挖行為致使野生種群已不多見，同時由于各種人類活動因素的影響，使其生境不斷遭到破壞，分布范圍日益縮減，野生資源量銳減，遺傳多樣性大量喪失，趨于漸危狀態(tài)[7]。因此，對青葉膽開展保護性研究工作已勢在必行。導致植物漸瀕、瀕危的原因很多，在眾多的致瀕因素中，植物的繁殖過程顯得特別重要，已成為當今植物保護生物學領(lǐng)域的一個熱點問題[8-9]。另一方面，由于植物胚胎學性狀通常受外部環(huán)境因素影響較小，具有相對較大的遺傳穩(wěn)定性，一直是系統(tǒng)學研究的重要依據(jù)，特別在屬以上的系統(tǒng)發(fā)育研究中更具重要意義[10-11]。龍膽科的胚胎學性狀常被用于討論該科下的系統(tǒng)位置及科下系統(tǒng)發(fā)育[12]，獐牙菜屬植物的胚胎學研究已有一些報道[12-21]，但尚未見青葉膽有關(guān)有性生殖方面的報道。本研究對青葉膽單花開放過程、大小孢子發(fā)生、雌雄配子體形成以及胚胎發(fā)育進行研究，旨在為青葉膽的生殖生物學和保護生物學提供新資料，并為探討龍膽科內(nèi)各屬間的系統(tǒng)進化關(guān)系提供有性生殖方面的證據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

觀察樣地設(shè)于云南省彌勒縣小蒼窩(24°15′32″ N，103°29′60″ E及附近，Alt: 1 620 m)，標本經(jīng)云南中醫(yī)學院黃衡宇教授鑒定為青葉膽(SwertiamileensisT. N. Ho & W. L. Shi)。

1.2方法

2013年8月25日～12月20日，間隔15 d至觀察樣地進行定株觀察記錄。其中，10月15～20日、11月5～10日2次進行單花開放記錄。

按單花標記時期，在同一種群內(nèi)分別取相應時期的花芽和花朵固定于改良的FAA固定液中(50%乙醇∶冰乙酸∶甲醛=89∶6∶5)。固定48 h后的材料經(jīng)50%乙醇沖洗后，愛氏蘇木精整染7 d，經(jīng)10個不同濃度乙醇梯度脫水，5個不同濃度二甲苯透明和滲透，切片石蠟包埋，Leitz切片機切片，切片厚度5～8 μm，中性樹膠封片。ZEISS-AxioskopⅡ型顯微鏡下觀察并攝影。

2結(jié)果與分析

2.1單花開放過程

青葉膽花基數(shù)為4(圖版Ⅰ，A)。每年8月底9月初開始繁殖生長，9月10日開始出現(xiàn)幼小花序(圖版Ⅰ，B)，花原基基本形成，此時苞片與其它部分相比生長較快。15 d后，即9月25日左右，幼小花蕾出現(xiàn)，其頂部略顯紫色，其他大部分呈現(xiàn)淺綠色(圖版Ⅰ，C)；花蕾出現(xiàn)第5 d，即9月30日，花蕾逐漸長大至花萼1/3處，上部由綠轉(zhuǎn)紫，且向下擴展(圖版Ⅰ，D)；10 d后，即10月10日，花蕾長至幾與花萼平齊，紫色區(qū)域加深，螺紋明顯(圖版Ⅰ，E)；5 d后，即10月15日，花蕾基部膨大，萼片展開，花瓣即將解螺旋開放(圖版Ⅰ，F(xiàn))，此時雄蕊花絲已生長至與雌蕊柱頭平齊，花藥正面相對花柱并與之平行緊鄰(圖版Ⅰ，G)。至此，青葉膽繁殖期內(nèi)的花蕾期結(jié)束，歷時約35 d左右。

青葉膽開花時期較短，約2～3 d，單花開放時間不固定，大多數(shù)集中在上午6：30～8：30間。以1朵花為例，10月16日7：05開花時，花瓣從外向內(nèi)解旋，先是1個花瓣打開(圖版Ⅰ，H)，5 min后，即7:10，其余3個花瓣同時展開(圖版Ⅰ，I)；8：10在完成解旋后的60 min內(nèi)，花藥完成了與柱頭由最初正面相對翻轉(zhuǎn)至垂直并略高于柱頭(圖版Ⅰ，J)；30 min后，即8：40，花藥完成了與柱頭背面相對的另一個90°翻轉(zhuǎn)，同時花絲逐漸偏移柱頭約30°，此時花藥開始散粉，但柱頭處于不可授狀態(tài)(圖版Ⅰ，K)，這一時期持續(xù)時間較長，可達23 h；第2天，即10月17日7：40，花藥處于散粉高峰期，花藥、藥絲顏色逐漸加深，而柱頭仍處于不可授狀態(tài)(圖版Ⅰ，L)；4 h后，即11：40，花藥進入散粉末期，顏色變黑并開始萎縮，宿存于淡藍色花絲上，偶見脫落，此時柱頭進入可授期(圖版Ⅰ，M)；2 h后，即13：40，柱頭進入最佳可授期，同時子房持續(xù)膨大呈寶瓶狀(圖版Ⅰ，N)，這一時期持續(xù)約5 h。授粉完成后，柱頭顏色逐漸加深變黑，子房進一步膨大(圖版Ⅰ，O)。2～3 d后，花萼花瓣逐漸以雌蕊為中心，緊緊向內(nèi)包攏，花瓣紙質(zhì)化皺縮，進入果期。青葉膽果實期較長，約40～45 d，以后蒴果從上部裂開，散出種子。青葉膽單花繁殖期從花序出現(xiàn)至蒴果成熟約需80～90 d，期間完成了生活史中最重要的兩個過程——減數(shù)分裂和受精作用。整個種群花期約120 d。

此外，對青葉膽進行繁育系統(tǒng)檢測時發(fā)現(xiàn)，種群在盛花期中大約有5%花朵雄蕊在發(fā)育早期敗育，在花瓣解螺旋打開時雄蕊即已枯萎死亡。這樣的小花在以后的發(fā)育中，雌蕊生長極好，蒴果內(nèi)的種子數(shù)明顯高于平均種子數(shù)，表明雄蕊敗育不僅是異花授粉的保障之一，同時能將更多的能量資源分配給雌蕊。

2.2小孢子發(fā)生和雄配子體形成

青葉膽每枚雄蕊具4個小孢子囊(圖版Ⅱ，A)，每個小孢子囊的4個角隅處分化出的孢原細胞平周分裂向外產(chǎn)生初生壁細胞，向內(nèi)產(chǎn)生初生造孢細胞(圖版Ⅱ，B)，初生壁細胞繼續(xù)平周分裂產(chǎn)生外層和內(nèi)層；外層細胞分裂形成藥室內(nèi)壁和中層，內(nèi)層細胞分裂形成中層和絨氈層(圖版Ⅱ，C)，至小孢子母細胞時期，分化完全的花藥壁由5層細胞組成，由外向內(nèi)依次為：表皮、藥室內(nèi)壁、2層中層和絨氈層(圖版Ⅱ，D)。中層由外層和內(nèi)層分裂產(chǎn)生的細胞共同組成，按Davis[22]的劃分，青葉膽花藥壁發(fā)育屬于基本型。而絨氈層主要來源于初生壁內(nèi)層，部分來自藥隔細胞，為二型起源。

外觀大多為多邊形的次生造孢細胞經(jīng)過生長發(fā)育，體積進一步增大，變?yōu)閳A形的小孢子母細胞。青葉膽小孢子母細胞時期較為短暫，一經(jīng)形成即進行減數(shù)分裂，減數(shù)分裂大約經(jīng)歷10 d，花朵外形如圖版Ⅰ，D。小孢子母細胞進入減數(shù)分裂期時，中層細胞開始退化，而起源于藥隔部分的絨氈層細胞在發(fā)育過程中進行平周分裂凸入藥室腔內(nèi)，形成“類胎座”或“橫格”(圖版Ⅱ，E)。小孢子母細胞經(jīng)減數(shù)分裂(圖版Ⅱ，F(xiàn)～I)后形成小孢子四分體(圖版Ⅱ，J)，其胞質(zhì)分裂為同時型，四分體排列方式主要為四面體形，花朵外形如圖版Ⅰ，F(xiàn)；此時，絨氈層細胞強烈解體，原位退化，藥室內(nèi)具有的退化絨氈層核是早期該層細胞有絲分裂凸入藥室中央并原位退化形成的(圖版Ⅱ，J)，而非周緣的絨氈層細胞退化后流動進入所致。剛從四分體釋放出來的小孢子核位于中央，細胞質(zhì)中只有一些小液泡，壁較薄(圖版Ⅱ，K)；隨著生長發(fā)育，小孢子原生質(zhì)開始出現(xiàn)許多小液泡(圖版Ⅱ，L)，后匯集成一大液泡，位于細胞中央，原生質(zhì)遂分布于細胞壁的周邊，其核隨著細胞的液泡化由中央隨機地移到靠壁的一側(cè)(圖版Ⅱ，M)，這一過程大約需1.5 h，花朵外形如圖版Ⅰ，H～J。在花藥以與花絲相連“關(guān)節(jié)”處進行翻轉(zhuǎn)時(圖版Ⅰ，J、K)，靠邊小孢子核進行有絲分裂，產(chǎn)生大小懸殊的2個核，隨后進行胞質(zhì)分裂，形成大小懸殊的2個細胞(圖版Ⅱ，N)。大的為營養(yǎng)細胞，包含著原先小孢子的大液泡和大部分原生質(zhì)，其核含有1個顯著的大核仁；貼壁的是生殖細胞，只含有少量的原生質(zhì)，這一時期可以稱為2-細胞花粉粒早期。以后，生殖細胞側(cè)邊脫離花粉壁向心突出，逐漸從花粉壁上脫落，細胞壁漸漸溶解，其核也不斷增大，最終游離在營養(yǎng)細胞的原生質(zhì)中，生殖細胞在散粉前分裂一次形成成熟的3-細胞花粉粒(圖版Ⅱ，O)。由于小孢子發(fā)育的不同步，少量花粉粒在花藥完成翻轉(zhuǎn)后即從藥隔斷裂處逸出，23 h后絕大多數(shù)小孢子始發(fā)育成熟，達到散粉高峰。此時，花藥壁僅宿存帶狀加厚的表皮。

圖版 Ⅰ　青葉膽單花開放過程A．花基數(shù)4；B．花序出現(xiàn)；C～F．花蕾期，約為20 d；G．尚未開放花朵雄蕊位置；H．初開放花朵；I．花藥開始翻轉(zhuǎn)；J．隨后60 min內(nèi)，花藥與柱頭由最初正面相對翻轉(zhuǎn)至垂直并略高于柱頭；K．30 min后，花藥完成了與柱頭背面相對的另一個90°翻轉(zhuǎn)，并開始散粉，此時柱頭不可授；L．23 h后，花藥處于散粉高峰，而柱頭仍不可授；M．4 h后，花藥進入散粉末期，柱頭進入可授期；N．2 h后，柱頭進入最佳可授期；O．完成授粉后的子房形態(tài)。PlateⅠ　The duration of the single flowerA. Tetramerous flower; B. Inflorescence emergence; C-F. The bud time, which lasts for about 20 days; G. The position of stamens in unopened flower； H. The flower bud opens; I. The anthers turn outwards; J. The anther position is vertical to pistil and higher than stigma for 60 minutes; K. After 30 minutes, the anther keep on turning outwards 90° to face against the pistil, the pollen begin falling while the stigma is still unreceptive; L. The shedding of pollen peaks at 23 hours after it starts while the stigma is still unreceptive; M. 4 hours later the anthers are in the late stage of pollen shedding while the stigma is receptive; N. The stigma is optimal for pollination 2 hours later; O. Ovary shape after pollination

圖版 Ⅱ　小孢子發(fā)生和雄配子體形成(標尺：A=100 μm；B～E、J=20 μm；F～I、K～O=10 μm)A. 4枚花藥；B. 初生壁細胞(PP)和初生造孢細胞(PS)；C. 次生造孢細胞時期的花藥壁：表皮(EP)、外層(OL)和內(nèi)層(IL)及分裂相(箭頭)；D. 小孢子母細胞(MIC)時期分化完全的花藥壁：表皮(EP)、藥室內(nèi)壁(EN)、中層(M)、絨氈層(T)；E. 絨氈層細胞凸入藥室內(nèi)形成“類胎座”(PL)；F. 減Ⅰ中期；G. 減Ⅰ后期；H.減Ⅱ中期；I.減Ⅱ末期；J. 四分體時期由絨氈層細胞形成的“類胎座”(PL)；K. 剛從四分體釋放出來的小孢子；L. 小孢子中出現(xiàn)小液泡；M. 小孢子中出現(xiàn)大液泡； N. 2-細胞花粉粒早期，可見明顯的細胞壁；O. 成熟的3-細胞花粉粒Plate Ⅱ　Microsporegenesis and development of the male gametophyte (Scale Bar: A =100 μm; B-E, J=20 μm; F-I, K-O=10 μm)A. The transection of anther, showing four anthers; B. Primary parietal cells (PP) and primary sporogenous cells (PS); C. Anther wall in the time of secondary sporoginous cell: epidermis (EP), out layer (OL) and inner layer (IL) with its division phase; D. Anther wall in the time of microspore mother cells: epidermis (EP), endothelium (EN), middle layer (M), tapetum (T); E. “Placentoid (PL)” from the tapetum; F. Meiosis metaphaseⅠ; G. Meiosis anaphaseⅠ; H. Meiosis metaphaseⅡ; I. Meiosis telophase Ⅱ; J. “Placentoid (PL)” from the tapetum in the time of tetrads; K. Microspore had just formed from microspore tetrads; L. Some small vacuoles appear in the microspore; M. Vacuolate period of uninucleate microspore; N. Early 2-celled pollens, showing obvious cell wall; O. Mature 3-celled pollens

2.3大孢子發(fā)生和雌配子體形成

青葉膽為圓錐狀聚傘花序，多花，子房上位，2心皮，1室。雌蕊膨大成囊狀，心皮沒有愈合的部分分化為柱頭，不閉合。子房橫切面具多列胚珠，側(cè)膜胎座(圖版Ⅲ，A)。在珠心頂端表皮下一層細胞中分化出單個孢原細胞(圖版Ⅲ，B)。 孢原細胞不分裂，體積增大并伸長直接發(fā)育為大孢子母細胞，其質(zhì)濃厚，具大而顯著的細胞核(圖版Ⅲ，C)?？梢?，青葉膽大孢子母細胞與珠心表皮細胞間無周緣細胞層，故屬薄珠心胚珠。珠被始發(fā)生于孢原細胞晚期，由珠心基部細胞衍生而成，生長速度較快，由于兩側(cè)生長不均勻，至大孢子母細胞時期，胚珠處于倒生的位置(圖版Ⅲ，C)。

大孢子母細胞持續(xù)時間較長，約15～20 d，花朵外形如圖版Ⅰ，E。大孢子母細胞經(jīng)減Ⅰ分裂(圖版Ⅲ，D)形成大孢子二分體(圖版Ⅲ，E)；大孢子二分體經(jīng)減Ⅱ分裂形成直線形大孢子四分體(圖版Ⅲ，F(xiàn))。四分體中，珠孔端3個退合，合點端大孢子體積增大，發(fā)育為功能大孢子，此時可見退化大孢子痕跡(圖版Ⅲ，G)。這一發(fā)育時間也較長，持續(xù)至花藥完成翻轉(zhuǎn)并開始散粉，花朵外形如圖版Ⅰ，J、K。

功能大孢子體積繼續(xù)增大，在珠孔端出現(xiàn)小液泡，發(fā)育為單核雌配子體(圖版Ⅲ，H)；單核雌配子體經(jīng)2次有絲分裂形成二核雌配子體(圖版Ⅲ，I)和四核雌配子體(圖版Ⅲ，J)，四核雌配子體再經(jīng)一次有絲分裂形成八核雌配子體，隨即細胞化產(chǎn)生七細胞八核雌配子體(圖版Ⅲ，K～L)，此過程約持續(xù)24 h。此時，花藥散粉進入末期，柱頭進入可授期。成熟雌配子體中，珠孔端3個細胞形成卵器，卵細胞和2個助細胞呈“品”字形排列，卵細胞略小于助細胞，核位于合點端，珠孔端為一大液泡；2個助細胞大小幾乎相等，極性與卵細胞相反。合點端的3個反足細胞非常發(fā)達，在形成后不久，體積便迅速增大，幾占整個胚囊的1/3(圖版Ⅲ，M)。在以后的發(fā)育中，反足細胞體積進一步增大，核多次分裂形成內(nèi)源多倍體，其形成的反足吸器明顯，形成一個十分類似“外胚乳”的結(jié)構(gòu)。反足細胞宿存時間較長，2-細胞原胚時還很發(fā)達，到6-細胞原胚時期才開始退化。

圖版 Ⅲ　大孢子發(fā)生和雌配子體形成(標尺：A=100 μm； B=20 μm；C=30 μm；D～M=50 μm)A. 側(cè)膜胎座；B. 大孢子孢原(箭頭)；C. 大孢子母細胞(箭頭)；D. 大孢子母細胞減Ⅰ中期； E. 大孢子二分體；F. 直線形大孢子四分體；G. 功能大孢子(F)和退化的3個大孢子(箭頭)；H. 單核雌配子體；I. 二核雌配子體；J. 四核雌配子體；K～M. 七細胞雌配子體，示2個助細胞(SY)、卵細胞(E)、中央細胞(C)和反足細胞(ANT)Plate Ⅲ　Megasporogenesis and development of the female gametophyte (Scale Bar: A=100 μm ; B=20 μm; C=30 μm; D-M=50 μm)A. Parietal placenta; B. A female archesporium is hypodermal (arrow); C. Megasporocyte (arrow); D. Meiosis metaphaseⅠ; E. Megaspore dyad; F. Linear tetrad of megaspores; G. Functional megaspore (F) and the three degenerated megaspores (arrow); H. Mononucleate megagametophyte; I. Two-nucleated megagametophyte; J. Four--nucleated megagametophyte; K-M. Seven-celled megagametophyte, showing two synergids (SY), egg (E), central cell (C) and three antipodal cells (ANT)

2.4受精、胚和胚乳的發(fā)育

青葉膽成熟花粉粒在散粉前開始萌發(fā)出花粉管，經(jīng)媒介傳送至柱頭后，花粉管即在花柱中沿著通道細胞表面的粘液前進。到達子房后，經(jīng)珠孔進入胚珠，屬珠孔受精類型?；ǚ酃苓M入雌配子體囊腔時釋放出2個精子分別與卵細胞和中央細胞融合，產(chǎn)生合子及初生胚乳核，受精屬有絲分裂前類型。

初生胚乳核的分裂早于合子的分裂，在合子第一次絲分裂前，胚乳核已在囊腔內(nèi)達到了一定數(shù)目(圖版Ⅳ，A)，胚乳發(fā)育為核型。合子第一橫分裂(圖版Ⅳ，B)形成1個頂細胞CA和1個基細胞CB(圖版Ⅳ，C)；頂細胞先分裂產(chǎn)生L、L′，隨后基細胞進行分裂，最后產(chǎn)生一直線形4-細胞原胚L、L′、M和Ci(圖版Ⅳ，D)；細胞L和L′在基細胞CB分裂結(jié)束后不久分別再進行一次橫分裂，產(chǎn)生L1、L2和L1′、L2′，與M、Ci構(gòu)成直線形的6-細胞原胚(圖版Ⅳ，E)，這一時期，反足細胞開始呈現(xiàn)退化的跡象；以后L1、L2、L1′、L2′再分裂數(shù)次和M、Ci一起構(gòu)成球形原胚，此時胚乳核開始細胞化(圖版Ⅳ，F(xiàn))。青葉膽胚的發(fā)育過程中，由基細胞CB衍生而來的細胞在胚體建成中不起重要作用，因而胚的發(fā)育屬于茄型。

圖版 Ⅳ　受精、胚和胚乳的發(fā)育(標尺：A、F～H=50 μm；B、C=30 μm；D、E=20 μm)A. 合子(Z)和胚乳核；B.合子橫分裂相(箭頭)；C. 2-細胞原胚，頂細胞(CA)和基細胞(CB)；D. 4-細胞(L、L′、M、Ci)原胚；E. 6-細胞(L1、L2、L1′、L2′、M、Ci)原胚；F. 球形原胚早期，示細胞化胚乳和胚柄細胞；G. 球形胚；H. 球形胚時期發(fā)達的胚柄吸器Plate Ⅳ　Fertilization and development of embryo and endosperm (Scale Bar: A, F-H=50 μm; B, C=30 μm; D, E=20 μm)A. The zygote (Z) and endosperm nucleus; B. The dividing zygote (arrow); C. At the time of 2-celled proembryo, showing the apical cell (CA) and the base cell (CB); D. Liner 4-celled pro-embryo (L, L′, M, Ci); E. Liner 6-celled pro-embryo (L1, L2, L1′, L2′, M, Ci); F. Early globular embryo; G. Globular embryo; H. Developed suspensor haustorium at the time of globular embryo

在胚體形成后，由基細胞CB衍生的細胞加速分裂形成胚柄結(jié)構(gòu)，至球形胚時期可見發(fā)達的胚柄，而胚體附近細胞化的胚乳強烈解體，為胚的發(fā)育提供養(yǎng)料(圖版Ⅳ，G)。種子離開母體時，胚的分化不完全，大部分處于早心形胚階段，少數(shù)仍處于球形胚時期，此時胚柄高度發(fā)達，可以看到明顯的吸器結(jié)構(gòu)(圖版Ⅳ，H)。從受精到蒴果成熟，約需40～45 d。

3討論

3.1青葉膽對異花授粉的適應

通過對單花開放過程的觀察，青葉膽具有一系列機制來保證其異花授粉。從花部形態(tài)上看，花藥為丁字形著藥，散粉時背向雌蕊裂開。從雌雄蕊空間位置上的變化來看，花藥從發(fā)育早期處于與雌蕊相對位置到散粉時的背對位置，花藥要經(jīng)歷一個180°倒轉(zhuǎn)的過程，同時花絲也要偏離雌蕊近30°的向外偏轉(zhuǎn)，這樣花藥的位置幾乎發(fā)生了210°的變化，散粉時相對遠離雌蕊柱頭。在這一過程中，花絲頂部與花藥相連處的“關(guān)節(jié)”部位是一個特殊結(jié)構(gòu)?；ㄋ幷峭ㄟ^這一結(jié)構(gòu)才能夠完成其180°的倒轉(zhuǎn)，最終花藥處于與雌蕊相背的位置。與其近緣種川東獐牙菜S.davidii.不同的是，花藥發(fā)生180°倒轉(zhuǎn)是S.davidii.散粉的一個重要前提，否則便會在散粉前枯萎死亡。對青葉膽來說，如果花藥由于某些外力原因未能發(fā)生180°倒轉(zhuǎn)，花藥的發(fā)育就會滯后，略顯畸形，其花粉活力則低于正?；ǚ鄱⒉粚е缕渌劳觥?/p>

雌、雄蕊發(fā)育的相關(guān)性來看，雄蕊的發(fā)育早于雌蕊，當花藥成熟散粉時，雌配子體僅發(fā)育至功能大孢子時期；27 h后，雌配子體發(fā)育成熟，而花藥已進入散粉末期，兩者僅有1～2 h的重疊期。這樣，在發(fā)育時間上保證了青葉膽的異花授粉。

3.2青葉膽絨氈層類型

有學者[23]曾報道龍膽科植物的絨氈層有腺質(zhì)和變型兩種類型，并提到絨氈層發(fā)育早期具有結(jié)構(gòu)上的各種變化，如進行各種分裂凸入藥室腔內(nèi)形成“橫格”和“類胎座”。與S.davidii.的研究結(jié)果類似[24]，本研究認為它們是一種類型，是由于對絨氈層發(fā)育早期結(jié)構(gòu)變化所引起的退化具有不同認識所造成的。青葉膽絨氈層2型起源，其細胞在發(fā)育早期就縱向伸長，并擠入藥室腔內(nèi)，使絨氈層看上去似乎有2層至多層，特別是起源于藥隔的絨氈層細胞有時還形成“橫格”和“類胎座”結(jié)構(gòu)；隨著花粉的發(fā)育，這些進入藥室腔內(nèi)的絨氈層細胞原位解體，存在于小孢子周圍，以至于很容易從表象上誤認為是邊緣絨氈層“流動”進入藥室腔內(nèi)的；本文未觀察到青葉膽絨氈層細胞解體時有融合現(xiàn)象，直到消失之前，絨氈層細胞始終是單個存在的，沒有形成周原質(zhì)團。

3.3青葉膽有性生殖過程中的重要特征

一般認為，反足細胞為胚囊的成熟與受精提供營養(yǎng)，特別是那些具次生增殖的反足細胞[25]；此外，反足細胞有可能產(chǎn)生和釋放控制鄰近胚乳發(fā)育的成長物質(zhì)[26]。與龍膽科多數(shù)一年生植物相似[14-19,21,23-24]，青葉膽反足細胞存在次生增殖，在雙受精至胚乳形成前，具有顯著的吸器結(jié)構(gòu)，并宿存至4-細胞原胚或更久。而龍膽科多年生植物反足細胞則無顯著的反足吸器，少發(fā)生次生增殖，受精后就普遍開始消失[27]。

胚柄在胚胎發(fā)育過程中是一個暫時性結(jié)構(gòu)，在胚胎發(fā)育過程中，胚柄將胚體推入胚乳組織中，并從母體組織吸收營養(yǎng)物質(zhì)向胚體運輸，或者胚柄本身合成特殊物質(zhì)(如赤霉素)，為早期發(fā)育的胚胎提供營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[28]。與其他一些獐牙菜屬植物不同[12,15-18,20,24]，青葉膽在4-細胞原胚后，并不產(chǎn)生8-細胞原胚而產(chǎn)生6-細胞原胚，基細胞的分裂晚于頂細胞。至原胚體形成時，胚柄結(jié)構(gòu)才開始出現(xiàn)。至蒴果成熟種子散出時，胚柄高度發(fā)達并形成吸器結(jié)構(gòu)。在其他獐牙菜屬植物中，未見類似報道。

3.4青葉膽有性生殖特征的生態(tài)適應意義

胚胎學上的特定特征是與其功能相一致的，并在一定程度上反映了該物種的生活史與生殖策略[27]。青葉膽在原生境為每年9月初花序出現(xiàn)，單花開放期2～3 d左右；果期較長，約40～45 d。種子從蒴果中散落時，大多只發(fā)育至早心形胚階段，種子必須經(jīng)過后熟才能萌發(fā)。在漫長的后熟期中(4個月左右)，種子一方面可以休眠或后熟的方式避開不良生長季節(jié)，但另一方面，種子在母體時須貯存足夠養(yǎng)料以滿足離開母體后胚的繼續(xù)發(fā)育，而后熟期的養(yǎng)料猶顯重要。從種子的切片來看，發(fā)達的胚乳組織即為胚后熟養(yǎng)料的重要保證，這樣在早期胚的發(fā)育中，胚乳就不能被過度利用?？梢酝茰y，青葉膽發(fā)達的反足細胞可能是完成這一策略的主要載體：雌配子體成熟時期吸收珠被的營養(yǎng)，轉(zhuǎn)運并儲存于反足細胞內(nèi)；受精后，發(fā)達的反足細胞不僅促進胚乳的發(fā)育和養(yǎng)分積累，而且有可能在胚發(fā)育的早期代替胚乳為合子及胚提供營養(yǎng)。此外，青葉膽發(fā)達的胚柄結(jié)構(gòu)也具有重要意義。在胚的發(fā)育早期，由于胚柄的不斷伸長，將胚體逐漸向囊胚中推進，使之處于營養(yǎng)有利的環(huán)境中；而到了早心形胚，即種子脫離母體時，胚柄產(chǎn)生明顯的吸器結(jié)構(gòu)，從珠孔端伸入珠被組織，從珠被組織中轉(zhuǎn)移營養(yǎng)物質(zhì)至胚，進一步提供胚后熟過程中需要的養(yǎng)份；同時，發(fā)達的胚柄也有可能為胚體提供生長調(diào)節(jié)因子以保證種子中胚的正常發(fā)育[29]。

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(編輯:潘新社)

文章編號:1000-4025(2016)06-1146-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.06.1146

收稿日期:2016-03-24;修改稿收到日期:2016-06-08

基金項目:國家自然科學基金(31260077,31260102)；湖南省重點學科建設(shè)項目(JSU071301)

作者簡介:李鸝(1973-)，女，博士，教授，主要從事植物生態(tài)與分子生物學教學和科研工作，E-mail: lilyjsu@126.com *通信作者:黃衡宇，博士，教授，主要從事植物發(fā)育生物學研究。E-mail: hhyhhy96@163.com

中圖分類號:Q944.58

文獻標志碼:A

Study on Floral Dynamic and Sexual Reproduction ofSwertiamileensis,a Rare and Endemic Medicinal Plant

LI Li1, LONG Hua1, ZHANG Aili2, HUANG Hengyu2*

(1 Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of College of Hunan Province, Jishou University,Jishou, Hunan 416000, China;2 Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants, Yunnan University of Chinese Traditional Medicine, Kunming 650500, China)

Abstract:The blooming of the single flower, the development of microsporangium, male gametophyte, megasporogenesis, female gametophyte and embryogeny of Swertia mileensis, a special herb endemic to Yunnan, were studied in this article. (1) The reproductive growth of S. mileensis begins at late August or early September and the bud stage is last for approximately 35 days, flowering time is last for only 2-3 days while fruit stage is the longest, approximately 40-45 days. (2) There are a series of mechanism to guarantee the cross pollination in S. mileensis, such as the versatile anther; the dichogamy in which the maturity of stamen was about 23 hours earlier than the maturity of pistil, that means the overlapping time of the mature stamen and pistil is only 1-2 hours. Furthermore a new mechanism was observed in which the stamen and pistil would change their position in space to avoid self-pollination. At first anther clings to stamen and then turn around on the back of the pistil after a 180° reversion, while filament deviate lead to the anther bent down with 210°. Section shows: anthers are tetrasporangiate. The development of anther walls conforms to the basic type and comprises of epidermis, endothecium, two middle layers and tapetum at the mature stage. The tapetum cells have dual origin and belong to the glandular type. The anther locules have degenerating tapetum nuclei in the middle which are from the early dividing and intruding of the tapetum. Two middle layers are ephemeral; endothecium reduces and epidermis persists and develops to become fibrous-thickening. The cytokinesis of the microspore mother cell in meiosis is of the simultaneous type. Most of the microspore tetrads are tetrahedral and pollen grains are 2-celled and 3-celled when shed. The ovary is bicarpellate, unilocular with some series of ovules located at the parietal placentation. The ovule is unitegmic, enuinucellar and anatropous. The one chalazal megaspore in linear tetrad becomes the functional megaspore and the development of female gametophyte is the polygonum type. Three antipodal cells have multiseriate nuclei and distinct haustorium, and persist like a layer of “outer endosperm” just out of the endosperm nucleus layer. Fertilization is porogamous and of premitotic syngamy type. The development of endosperm conforms to nuclear type and the embryogeny corresponds to the solanum type. The embryo is at the late early heart-shaped stage when seeds released from the capsule. The developed antipodal cells and suspensor structure has magnificent significance for the reproductive adaptation and evolution of the seed after-ripening of S. mileensis.

Key words:Swertia mileensis; flowering; embryology; Swertia; ecological adaptation