• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    補(bǔ)骨脂素對去勢雌鼠E2、ERβ、TNF-α、IL-17的影響

    2016-08-06 12:35:04楊琳曾英李勁平劉珊王文杰楊巖冰莫新民
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2016年4期
    關(guān)鍵詞:補(bǔ)骨脂素壯骨低劑量

    楊琳 曾英 李勁平 劉珊 王文杰 楊巖冰 莫新民

    1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 長沙 410007 2. 中南大學(xué)藥學(xué)院, 長沙 410013

    補(bǔ)骨脂素為補(bǔ)骨脂的主要化學(xué)成分,具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化,可用于骨質(zhì)疏松癥治療[1-3]。近年有研究表明補(bǔ)骨脂素可與雌激素受體(ER)結(jié)合,啟動雌激素受體元件,具有擬雌激素活性[4-6]。壯骨止痛膠囊是本課題組研發(fā)的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松的已上市六類中藥新藥,補(bǔ)骨脂是壯骨止痛膠囊中的君藥,而補(bǔ)骨脂素是壯骨止痛膠囊的主要定量控制指標(biāo)之一。課題組已有研究表明補(bǔ)骨脂素對于雙側(cè)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型具有良好抗骨質(zhì)疏松作用[7]。近年來的研究表明免疫系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色,本研究通過觀察補(bǔ)骨脂素對去勢骨質(zhì)疏松雌鼠血清雌激素(E2)、ERβ、TNF-α、IL-17水平及骨組織ERβ、TNF-α、IL-17基因表達(dá)的影響,探討補(bǔ)骨脂素抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    SPF級雌性SD大鼠72只,3月齡,體重210~250 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,動物質(zhì)量合格證號NO.43004700005517,湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心許可證號:SCXK(湘)2013-0004。

    1.2 藥品

    壯骨止痛膠囊(四川美大康藥業(yè)股份有限公司,批準(zhǔn)文號:Z20050118)、補(bǔ)骨脂素(中國藥品生物制品檢定所,純度>98%),戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,批準(zhǔn)文號:J20130009),青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠,批號:A1301022417)。

    1.3 試劑

    大鼠腫瘤壞死因子-α檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,批號:201410),大鼠白介素-17檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,批號:201406),大鼠ERβ免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司),雌二醇E2檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,批號:201406),TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司,批號:28218),Go Taq Green MasterMix(美國Promega公司,批號:0000110146),DNA Marker I(天能生物科技有限公司,批號:20140714),瓊脂糖(天能生物科技有限公司,批號:111860),TBE液(天能生物科技有限公司,批號:20140714),水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號:20120110),無水乙醇(上海振興化工一廠,批號:201408301),氯仿(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:T20101202),異丙醇(國藥集團(tuán)試劑有限公司,批號:20120627),液氮(長沙日臻氣體有限公司)。

    1.4 儀器

    凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad),PCR 擴(kuò)增儀(北京六一儀器廠,型號:WD-9402A),核酸蛋白分析儀(Eppendorf Biophotometer plus,型號:GPS-9160MBE),立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠,型號:LDZX-30KBS),全自動雪花制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司,型號:IMS-30),電泳儀槽(北京六一儀器廠,型號:DYY-8c),電泳槽(北京六一儀器廠,型號:DYCP-31DN),電子天平(奧豪斯儀器有限公司,型號:CP214),-80度冰箱(Thermo scientific),-20度冰箱(Haier 低溫冷柜),-4度冰箱(Haier 冷藏箱),微波爐(Midea 417-ykk),移液槍(規(guī)格0.5~10 ul;20~200ul;100~1 000 ul),液氮生物容器(YDS-10 型 編號:20060282)。

    1.5 分組及造模方法

    72只雌性SD雌鼠,按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、戊酸雌二醇對照組、壯骨止痛膠囊對照組、補(bǔ)骨脂素高劑量組、補(bǔ)骨脂素低劑量組共6組,每組12只。每只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后,在無菌條件下從距離第一腰椎兩側(cè)外1 cm處縱向切開,除假手術(shù)組僅切除少許脂肪組織外,其余各組大鼠完整摘除雙側(cè)卵巢,徹底止血后分兩層縫合切口。術(shù)后各組大鼠切口嚴(yán)格用絡(luò)合碘消毒,連續(xù)3 d肌注獸用青霉素 (4萬u/只/天)抗炎,5 d后拆線。

    1.6 給藥方法

    各組均從術(shù)后一周開始給藥,每天灌胃1次,連續(xù)13周。除假手術(shù)組和模型組每天灌胃相應(yīng)體積蒸餾水外,其余各組開始灌胃相應(yīng)藥物(1 ml/100 g)。劑量按人鼠體表面積折算,戊酸雌二醇對照組按0.21 mg/kg給藥,壯骨止痛膠囊對照組按相當(dāng)于生藥6.6 g/kg給藥,補(bǔ)骨脂素高、低劑量組分別按8 mg/kg和4 mg/kg給藥。

    1.7 指標(biāo)檢測

    實(shí)驗(yàn)過程中,所有大鼠自由飲水?dāng)z食,每10天稱體重1次。給藥l3周后,每組選取10只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后,切開腹腔,分離腹主動脈插管取血2 ml,待凝固后500 g/min離心分離血清,ELISA法檢測血清中E2、TNF-α、IL-17的含量。提取左股骨組織mRNA樣本進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測TNF-α、ERβ、IL-17的基因表達(dá),取右股骨脫鈣切片免疫組化檢測ERβ。

    1.7.1RT-PCR:(1)總RNA提?。喝?80℃保存的左股骨,在研缽中加入液氮研碎,加入1 ml Trizol,按Trizol說明書抽提總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測定其濃度及純度,A260/A280均在1.8~2.0之間。(2)cDNA合成:采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,內(nèi)含2 μg待測RNA,操作嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄合成說明書執(zhí)行。(3)引物序列及擴(kuò)增條件:按照PCR反應(yīng)條件,取2 μL cDNA模板配成25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。ERβ有意義鏈5′- TCACCGTCGAGCCTTAGTTC -3′,反意義鏈5′- TCTGCATAGAGGAGCGATGA -3′;TNF-α有意義鏈5′-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′,反意義鏈5′-CTGGGAGTAGATAAGGTACA-3′;IL-17有意義鏈5′ATCCATGTGCCTGATGCTGT-3′,反意義鏈5′-GTTATTGGCCTCGGCGTTTG-3′;內(nèi)對照β-actin有意義鏈5′- CCTAGCACCATGAAGATCAA -3′,反意義鏈5′- TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTT -3′。ERβPCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。TNF-αPCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、53℃退火30s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,擴(kuò)增片段141 bp。IL-17PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,擴(kuò)增片段106 bp。β-acin擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,擴(kuò)增片段227 bp。(4)半定量分析:各取PCR產(chǎn)物3 ul,用2%的瓊脂糖電泳及溴化已錠染色,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad) 進(jìn)行拍照,用Image Lab 5.0軟件進(jìn)行定量分析。計(jì)算ERβ、TNF-α、IL-17產(chǎn)物電泳條帶灰度與β-actin產(chǎn)物電泳條帶灰度比值。

    1.7.2免疫組化檢測ERβ:取大鼠的完整右股骨,去除附著的肌肉和筋膜后浸泡在10%福爾馬林PBS中脫鈣后按常規(guī)切片、脫蠟至水洗后經(jīng)抗原修復(fù)。加3%H202PBS溶液室溫孵育10 min,PBS沖洗3次,滴加正常山羊血清(1∶10)室溫孵育10 min。滴加兔抗大鼠ERβ抗體,陰性對照切片采用正常羊血清代替一抗,4℃孵育過夜。然后PBS浸洗3次,再滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG,室溫反應(yīng)30 min,PBS浸洗3次,然后滴加HRP鏈霉菌抗生物素蛋白,室溫反應(yīng)20 min;PBS浸洗3次;然后用0.06%DAB顯色8 min;蘇木精復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片。Olympus BX51型顯微鏡下觀察、拍照,在Image-Pro Plus4.5進(jìn)行圖像分析。

    1.8 統(tǒng)計(jì)方法

    2 結(jié)果

    2.1 補(bǔ)骨脂素對大鼠血清E2測定結(jié)果

    與假手組相比,模型組大鼠血清E2水平非常顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,壯骨止痛膠囊顯著升高血清E2水平(P<0.05),補(bǔ)骨脂素高劑量組血清E2水平顯著升高(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組血清E2水平升高趨勢明顯,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

    表1 不同組別補(bǔ)骨脂素對去卵巢雌鼠血清E2水平的影響(n=6)Table 1 Effect of psoralen on the serum level of E2 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    2.2 補(bǔ)骨脂素對大鼠股骨ERβ表達(dá)的影響

    與假手組相比,模型組股骨ERβ的mRNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均顯著降低(P<0.01或P<0.05)。與模型組相比,戊酸雌二醇組ERβ的表達(dá)顯著升高(P<0.01或P<0.05);壯骨止痛膠囊組股骨ERβ基因表達(dá)顯著升高(P<0.05);補(bǔ)骨脂素高劑量組股骨ERβ基因表達(dá)顯著升高(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組對股骨ERβ基因表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表2。各組ERβmRNA表達(dá)電泳圖見圖1,股骨ERβ免疫組化染色見圖2。

    2.3 補(bǔ)骨脂素對大鼠血清TNF-α水平及基因表達(dá)的影響

    與假手組相比,模型組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達(dá)均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,戊酸雌二醇組血清TNF-α水平和股骨

    表2 不同組別補(bǔ)骨脂素對去卵巢雌鼠股骨ERβ表達(dá)的影響(n=6)Table 2 Effect of psoralen on ERβ in the femur in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    圖1 各組ERβmRNA表達(dá)電泳圖譜 1:補(bǔ)骨脂素低劑量;2:補(bǔ)骨脂素高劑量;3:戊酸雌二醇;4:假手術(shù)組;5:模型組;6:壯骨止痛方;M=DNA MarkerFig.1 The ERβ mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

    TNF-α基因表達(dá)均非常顯著降低(P<0.01);壯骨止痛膠囊組股骨TNF-α基因表達(dá)非常顯著降低(P<0.01),血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05);補(bǔ)骨脂素高劑量組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達(dá)均顯著降低(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05),而股骨TNF-α基因表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表3。各組TNF-αRNA表達(dá)電泳趨勢圖譜見圖3。

    表3 不同組別補(bǔ)骨脂素對去卵巢雌鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)的影響(n=6)Table 3 Effect of psoralen on serum TNF-α and the gene expression of TNF-α in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    2.4 補(bǔ)骨脂素對大鼠血清IL-17水平及其基因表達(dá)的影響

    與假手組相比,模型組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,戊酸雌二醇組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均非常顯著降低(P<0.01);壯骨止痛膠囊組股骨IL-17基因表達(dá)非常顯著降低(P<0.01),血清IL-17水平顯著降低(P<0.05);補(bǔ)骨脂素高劑量組血清IL-17水平非常顯著降低(P<0.01),而股骨IL-17基因表達(dá)顯著降低(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均顯著降低(P<0.05),見表4。各組IL-17 mRNA表達(dá)電泳圖譜見圖4。

    表4 不同組別補(bǔ)骨脂素對去勢雌鼠血清IL-17水平及股骨IL-17基因表達(dá)的影響(n=6)Table 4 Effect of psoralen on serum IL-17 and the gene expression of IL-17 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    圖3 各組TNF-αRNA表達(dá)電泳趨勢圖譜 1:補(bǔ)骨脂素低劑量組;2:補(bǔ)骨脂素高劑量組;3:假手術(shù)組;4:陽性對照組;5:模型組;6:壯骨止痛方組;M:DNA Marker Fig.3 The TNF-α mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

    圖4 各組IL-17 mRNA表達(dá)電泳圖譜 1:補(bǔ)骨脂素低劑量組;2:補(bǔ)骨脂素高劑量組;3:壯骨止痛方組;4:假手術(shù)組;5:陽性對照組;6:模型組;M:DNA Marker Fig.4 The IL-17 mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

    3 討論

    補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的主要活性成分,可與雌激素受體(ER)結(jié)合,啟動雌激素受體元件調(diào)控一系列基因的表達(dá)而發(fā)揮擬雌激素活性[4]。研究表明補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化,增加成骨細(xì)胞骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá),抑制核因子 kB 受體激活因子配體(RANKL)的表達(dá)而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟,從而抑制骨吸收發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[8]。

    雌激素受體有ERα和ERβ兩種亞型,在骨組織內(nèi)主要是ERβ,大部分分布在胞漿中,少部分分布在細(xì)胞膜。雌激素受體與雌激素結(jié)合后,雌激素受體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)。絕經(jīng)后婦女的體內(nèi)不僅雌激素水平大幅下降,而且組織細(xì)胞內(nèi)的ER也下降[9-10]。由于ER是一種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其表達(dá)水平的下降必然影響到受其調(diào)控的一系列基因的表達(dá)。因此,在補(bǔ)充體內(nèi)雌激素的同時,適當(dāng)提高體內(nèi)ER水平能更好地延緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)展。本研究結(jié)果表明,大鼠去卵巢3個月后,其體內(nèi)血清E2水平和股骨ERβ水平顯著下降。給予戊酸雌二醇能顯著提升ERβ的表達(dá)水平。壯骨止痛膠囊不僅提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)E2水平,而且促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨內(nèi)ERβ的表達(dá)。補(bǔ)骨脂素高劑量(8 mg/kg)也具有同時升高骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)E2和ERβ水平的作用。補(bǔ)骨脂素在低劑量(4 mg/kg)時對體內(nèi)E2和ERβ的調(diào)節(jié)作用沒有顯著影響。

    IL-17主要由輔助性T17細(xì)胞(Th17)分泌,IL-17受體廣泛存在于人體各種組織與細(xì)胞中,包括軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)雌激素缺乏可以上調(diào)IL-17,促進(jìn)RANKL的表達(dá)和骨的重吸收,且特異性拮抗IL-17或者IL-17受體缺失的小鼠在切除卵巢后不會發(fā)生骨質(zhì)疏松[11]。因此,IL-17作為Th17細(xì)胞與骨細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)因子,可以作為抗骨質(zhì)疏松藥物的一個新的作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒M大鼠血清IL-17非常顯著升高(P<0.01),而且股骨的IL-17基因表達(dá)也顯著增強(qiáng)(P<0.01),表明去卵巢造成體內(nèi)雌激素缺乏導(dǎo)致股骨內(nèi)的T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá)增強(qiáng),從而提高骨微環(huán)境的IL-17水平,促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收。補(bǔ)充戊酸雌二醇則非常顯著抑制股骨內(nèi)的T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá),降低血清IL-17水平。補(bǔ)骨脂素高劑量(8 mg/kg)和低劑量(4 mg/kg)均能抑制去卵巢大鼠股骨T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá)和血清IL-17水平。

    TNF-α是目前發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)有力的骨吸收誘導(dǎo)劑,在雌激素缺乏的小鼠中,T細(xì)胞分泌的TNF-α通過與骨髓單核細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合,加強(qiáng)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成[12]。雌激素缺乏時,激活和增殖T細(xì)胞,T細(xì)胞增多,TNF-α、等細(xì)胞因子分泌增多[13],促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和活化,增強(qiáng)破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收過程。本實(shí)驗(yàn)中,去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)升高非常顯著(P<0.01)。給予戊酸雌二醇后,去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)下降非常顯著(P<0.01),這進(jìn)一步證實(shí)雌激素缺乏后T細(xì)胞功能失衡在骨代謝失常中扮演了重要角色。補(bǔ)骨脂素高劑量(8 mg/kg)顯著降低去卵巢大鼠血清TNF-α水平(P<0.05),同時股骨TNF-α基因表達(dá)也明顯下調(diào)(P<0.05)。

    本實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)骨脂素呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系提高去卵巢大鼠血清雌激素水平,同時對去卵巢大鼠TNF-α、IL-17的調(diào)節(jié)也呈現(xiàn)量效關(guān)系。補(bǔ)骨脂素在低劑量(4 mg/kg)對E2和ERβ的影響與模型組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但其仍然能夠抑制TNF-α、IL-17基因表達(dá)和降低血清TNF-α、IL-17水平。這種現(xiàn)象提示補(bǔ)骨脂素可能從兩個方面發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用:一方面補(bǔ)骨脂素通過調(diào)節(jié)體內(nèi)雌激素和雌激素受體水平對TNF-α、IL-17基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),其中包括補(bǔ)骨脂素與雌激素受體結(jié)合;另一方面,補(bǔ)骨脂素可能通過其它非雌激素信號途徑調(diào)節(jié)TNF-α、IL-17基因表達(dá)。相關(guān)的具體作用細(xì)節(jié)需要借助有關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動物和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    補(bǔ)骨脂素壯骨低劑量
    壯骨止痛膠囊對去卵巢大鼠股骨組織Runx2、Osx及DKK1蛋白表達(dá)的影響
    壯骨湯與閉合復(fù)位內(nèi)固定術(shù)對脛腓骨干骨折患者骨折愈合的影響
    16排螺旋CT低劑量掃描技術(shù)在腹部中的應(yīng)用
    新工藝止痛壯骨膠囊治療腰椎間盤突出癥臨床對比觀察
    補(bǔ)腎壯骨湯治療骨質(zhì)疏松脊柱骨折臨床效果觀察
    自適應(yīng)統(tǒng)計(jì)迭代重建算法在頭部低劑量CT掃描中的應(yīng)用
    低劑量輻射致癌LNT模型研究進(jìn)展
    正常和慢心率CT冠狀動脈低劑量掃描對比研究
    HPLC法測定補(bǔ)腎益腦片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量
    HPLC法測定補(bǔ)骨脂藥材中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素
    中成藥(2012年8期)2012-09-06 14:28:58
    一级作爱视频免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久香蕉国产精品| 91国产中文字幕| 一级作爱视频免费观看| a级毛片在线看网站| 天天一区二区日本电影三级| 看黄色毛片网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产91精品成人一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 久99久视频精品免费| 成人亚洲精品av一区二区| 久久精品国产综合久久久| 悠悠久久av| 欧美午夜高清在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 一本精品99久久精品77| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲 国产 在线| 不卡一级毛片| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美成人午夜精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 中文字幕久久专区| 国产精品av久久久久免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 黄片小视频在线播放| 国产精品精品国产色婷婷| 天堂动漫精品| 免费高清视频大片| 亚洲av成人av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲三区欧美一区| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 两个人看的免费小视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 满18在线观看网站| svipshipincom国产片| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| a级毛片a级免费在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 日韩视频一区二区在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 看片在线看免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 三级毛片av免费| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜福利在线在线| 久久中文字幕一级| 人妻久久中文字幕网| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一本大道久久a久久精品| 精品电影一区二区在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 在线观看日韩欧美| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品影院久久| 日日干狠狠操夜夜爽| www国产在线视频色| 亚洲国产欧美网| 日韩精品青青久久久久久| 视频区欧美日本亚洲| 成人午夜高清在线视频 | 久久久国产欧美日韩av| 国产成人精品久久二区二区91| 特大巨黑吊av在线直播 | 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 女人被狂操c到高潮| 日韩国内少妇激情av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久精品成人免费网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 999精品在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 免费在线观看黄色视频的| 国产激情偷乱视频一区二区| 此物有八面人人有两片| 国产成人精品无人区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄色成人免费大全| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲最大成人中文| 久久久久久久久久黄片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| av欧美777| 国产精品 国内视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩精品青青久久久久久| 老司机福利观看| 国产成人精品无人区| 十八禁人妻一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 一进一出好大好爽视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 这个男人来自地球电影免费观看| 女警被强在线播放| 久久99热这里只有精品18| 2021天堂中文幕一二区在线观 | xxxwww97欧美| 日日爽夜夜爽网站| 精品不卡国产一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 91成年电影在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一级毛片高清免费大全| www日本在线高清视频| 身体一侧抽搐| 一区福利在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 午夜免费激情av| 色av中文字幕| 9191精品国产免费久久| 国产午夜福利久久久久久| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产区一区二久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 精品高清国产在线一区| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利18| 亚洲精品美女久久av网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日日爽夜夜爽网站| 日本成人三级电影网站| 波多野结衣av一区二区av| 久久香蕉国产精品| 午夜精品在线福利| 校园春色视频在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 欧美日韩一级在线毛片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲av美国av| 亚洲av熟女| 国产熟女午夜一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 999久久久国产精品视频| 岛国视频午夜一区免费看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成年免费大片在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产视频一区二区在线看| 精华霜和精华液先用哪个| 精品久久久久久久毛片微露脸| 又大又爽又粗| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 香蕉av资源在线| 日韩视频一区二区在线观看| 麻豆国产av国片精品| 校园春色视频在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 日日爽夜夜爽网站| 自线自在国产av| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费观看人在逋| 黄色成人免费大全| 国产单亲对白刺激| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 女性被躁到高潮视频| 好男人电影高清在线观看| 国产又爽黄色视频| 变态另类丝袜制服| 亚洲五月天丁香| 成人三级做爰电影| 女性被躁到高潮视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 草草在线视频免费看| 啦啦啦 在线观看视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 日本一本二区三区精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美日韩黄片免| 国产91精品成人一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 黄色片一级片一级黄色片| 制服人妻中文乱码| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲第一电影网av| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 美女大奶头视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 三级毛片av免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲无线在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产成人av教育| 欧美一级a爱片免费观看看 | 精品国产国语对白av| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产精品永久免费网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 97碰自拍视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 男人操女人黄网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费无遮挡裸体视频| 国产又爽黄色视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲av美国av| 亚洲五月婷婷丁香| 最近最新中文字幕大全电影3 | 午夜福利欧美成人| 国产成人精品无人区| 精品日产1卡2卡| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产在线观看jvid| 1024香蕉在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 又紧又爽又黄一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久久国产成人精品二区| 一本大道久久a久久精品| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 看片在线看免费视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美中文综合在线视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久香蕉国产精品| 久久久久久久久免费视频了| 欧美黑人精品巨大| 特大巨黑吊av在线直播 | aaaaa片日本免费| 午夜两性在线视频| 欧美黑人巨大hd| 在线国产一区二区在线| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久伊人香网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| av福利片在线| 欧美三级亚洲精品| 久久精品成人免费网站| 午夜激情av网站| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 免费观看精品视频网站| 岛国视频午夜一区免费看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| ponron亚洲| 久久精品成人免费网站| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产精品电影一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 欧美另类亚洲清纯唯美| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜精品久久久久久毛片777| 777久久人妻少妇嫩草av网站| a级毛片a级免费在线| 91大片在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 夜夜爽天天搞| 国产成+人综合+亚洲专区| 变态另类丝袜制服| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日本 av在线| 国产视频内射| 久久欧美精品欧美久久欧美| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品不卡国产一区二区三区| 精品久久久久久久末码| 又黄又爽又免费观看的视频| 99国产综合亚洲精品| 国产99久久九九免费精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 狂野欧美激情性xxxx| 久久精品人妻少妇| 操出白浆在线播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 18美女黄网站色大片免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美性猛交黑人性爽| 国内精品久久久久精免费| 国产av一区二区精品久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 90打野战视频偷拍视频| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲国产欧美网| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品亚洲av一区麻豆| 男人舔奶头视频| 麻豆成人午夜福利视频| 日韩欧美 国产精品| 午夜福利视频1000在线观看| 国产视频一区二区在线看| 色播亚洲综合网| 欧美性长视频在线观看| а√天堂www在线а√下载| 国产熟女xx| 女性生殖器流出的白浆| 看片在线看免费视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久国产精品人妻蜜桃| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美激情高清一区二区三区| 日日爽夜夜爽网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美久久黑人一区二区| 黄片小视频在线播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美黑人精品巨大| 国产精品永久免费网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产真实乱freesex| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品久久久久久久末码| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一区二区三区精品91| 国产精品亚洲一级av第二区| 一本久久中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 一本久久中文字幕| 亚洲精品国产区一区二| 在线观看日韩欧美| 日韩精品青青久久久久久| 操出白浆在线播放| 欧美又色又爽又黄视频| 国内精品久久久久久久电影| 国产三级在线视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 91成人精品电影| 无人区码免费观看不卡| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久这里只有精品19| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 国产精品久久视频播放| 久久香蕉精品热| 午夜免费激情av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩大码丰满熟妇| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91国产中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品国产区一区二| 99精品久久久久人妻精品| 国产成人欧美| 三级毛片av免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| xxxwww97欧美| www日本黄色视频网| 成人亚洲精品av一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 不卡一级毛片| 免费搜索国产男女视频| 看黄色毛片网站| 亚洲国产看品久久| 麻豆国产av国片精品| 日韩国内少妇激情av| 国产av不卡久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 嫩草影视91久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美日韩黄片免| 欧美激情极品国产一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 久久国产精品影院| 色综合亚洲欧美另类图片| 高清毛片免费观看视频网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费看美女性在线毛片视频| 听说在线观看完整版免费高清| 免费看美女性在线毛片视频| 桃红色精品国产亚洲av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 两个人看的免费小视频| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 一夜夜www| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 在线观看免费日韩欧美大片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 999精品在线视频| 久热这里只有精品99| 久久久久久大精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费在线观看日本一区| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产成年人精品一区二区| 欧美成人性av电影在线观看| 热99re8久久精品国产| 在线观看免费视频日本深夜| 天堂√8在线中文| 中国美女看黄片| 精品久久蜜臀av无| 麻豆一二三区av精品| 国产午夜福利久久久久久| 国产高清激情床上av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线观看免费午夜福利视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美精品啪啪一区二区三区| 波多野结衣高清无吗| 亚洲久久久国产精品| 亚洲国产欧美一区二区综合| www国产在线视频色| 精品卡一卡二卡四卡免费| 12—13女人毛片做爰片一| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美成人性av电影在线观看| e午夜精品久久久久久久| 看片在线看免费视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一进一出好大好爽视频| 欧美黑人巨大hd| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品乱码一区二三区的特点| 男女午夜视频在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 丁香欧美五月| 免费高清视频大片| 两性夫妻黄色片| 国产精品一区二区免费欧美| 在线观看免费视频日本深夜| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久久久精品吃奶| 特大巨黑吊av在线直播 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 三级毛片av免费| 9191精品国产免费久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 美女 人体艺术 gogo| 国产激情欧美一区二区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲 欧美一区二区三区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 韩国av一区二区三区四区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | www日本黄色视频网| 免费搜索国产男女视频| 高清在线国产一区| 成人特级黄色片久久久久久久| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 啦啦啦韩国在线观看视频| 自线自在国产av| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲色图av天堂| 国产精品免费一区二区三区在线| 一区二区三区精品91| 怎么达到女性高潮| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日本一区二区免费在线视频| 午夜视频精品福利| 在线观看日韩欧美| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产高清有码在线观看视频 | 黄片大片在线免费观看| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲av成人av| 黄色丝袜av网址大全| 欧美午夜高清在线| 91老司机精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品 国内视频| 国内精品久久久久精免费| 在线永久观看黄色视频| 一本精品99久久精品77| 成人国产一区最新在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久香蕉精品热| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 最新美女视频免费是黄的| 久久精品人妻少妇| 国产成人精品无人区| 91老司机精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 中亚洲国语对白在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 国产野战对白在线观看| 国产亚洲欧美98| 最好的美女福利视频网| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 自线自在国产av| 久久香蕉激情| 一区二区三区激情视频| 久久亚洲真实| 欧美性长视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 91老司机精品| 久久中文看片网| 国产激情久久老熟女| 国产在线观看jvid| 99久久综合精品五月天人人| 妹子高潮喷水视频| 国产伦人伦偷精品视频| 国内精品久久久久精免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久午夜亚洲精品久久| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av美国av| 婷婷丁香在线五月| 999精品在线视频| 欧美在线一区亚洲| 国产1区2区3区精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 两人在一起打扑克的视频| 日本黄色视频三级网站网址| or卡值多少钱| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲专区国产一区二区| 99国产综合亚洲精品| 国内精品久久久久精免费| 男女下面进入的视频免费午夜 | 婷婷丁香在线五月| 日韩免费av在线播放| www.www免费av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产一区二区在线av高清观看| 成人18禁在线播放| 无遮挡黄片免费观看| 久99久视频精品免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 18禁美女被吸乳视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 一级作爱视频免费观看| 欧美成人午夜精品| 免费看美女性在线毛片视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品久久久久久精品电影 | 久久久久久久久免费视频了| 男女下面进入的视频免费午夜 | 伦理电影免费视频| 国产又爽黄色视频| 国产区一区二久久| 男人舔奶头视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美zozozo另类| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 女性生殖器流出的白浆| 久久 成人 亚洲| av视频在线观看入口| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 人人妻人人澡人人看|