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    補(bǔ)骨脂素對去勢雌鼠E2、ERβ、TNF-α、IL-17的影響

    2016-08-06 12:35:04楊琳曾英李勁平劉珊王文杰楊巖冰莫新民
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2016年4期
    關(guān)鍵詞:補(bǔ)骨脂素壯骨低劑量

    楊琳 曾英 李勁平 劉珊 王文杰 楊巖冰 莫新民

    1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 長沙 410007 2. 中南大學(xué)藥學(xué)院, 長沙 410013

    補(bǔ)骨脂素為補(bǔ)骨脂的主要化學(xué)成分,具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化,可用于骨質(zhì)疏松癥治療[1-3]。近年有研究表明補(bǔ)骨脂素可與雌激素受體(ER)結(jié)合,啟動雌激素受體元件,具有擬雌激素活性[4-6]。壯骨止痛膠囊是本課題組研發(fā)的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松的已上市六類中藥新藥,補(bǔ)骨脂是壯骨止痛膠囊中的君藥,而補(bǔ)骨脂素是壯骨止痛膠囊的主要定量控制指標(biāo)之一。課題組已有研究表明補(bǔ)骨脂素對于雙側(cè)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型具有良好抗骨質(zhì)疏松作用[7]。近年來的研究表明免疫系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色,本研究通過觀察補(bǔ)骨脂素對去勢骨質(zhì)疏松雌鼠血清雌激素(E2)、ERβ、TNF-α、IL-17水平及骨組織ERβ、TNF-α、IL-17基因表達(dá)的影響,探討補(bǔ)骨脂素抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    SPF級雌性SD大鼠72只,3月齡,體重210~250 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,動物質(zhì)量合格證號NO.43004700005517,湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心許可證號:SCXK(湘)2013-0004。

    1.2 藥品

    壯骨止痛膠囊(四川美大康藥業(yè)股份有限公司,批準(zhǔn)文號:Z20050118)、補(bǔ)骨脂素(中國藥品生物制品檢定所,純度>98%),戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,批準(zhǔn)文號:J20130009),青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠,批號:A1301022417)。

    1.3 試劑

    大鼠腫瘤壞死因子-α檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,批號:201410),大鼠白介素-17檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,批號:201406),大鼠ERβ免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司),雌二醇E2檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司,批號:201406),TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司,批號:28218),Go Taq Green MasterMix(美國Promega公司,批號:0000110146),DNA Marker I(天能生物科技有限公司,批號:20140714),瓊脂糖(天能生物科技有限公司,批號:111860),TBE液(天能生物科技有限公司,批號:20140714),水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號:20120110),無水乙醇(上海振興化工一廠,批號:201408301),氯仿(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:T20101202),異丙醇(國藥集團(tuán)試劑有限公司,批號:20120627),液氮(長沙日臻氣體有限公司)。

    1.4 儀器

    凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad),PCR 擴(kuò)增儀(北京六一儀器廠,型號:WD-9402A),核酸蛋白分析儀(Eppendorf Biophotometer plus,型號:GPS-9160MBE),立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠,型號:LDZX-30KBS),全自動雪花制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司,型號:IMS-30),電泳儀槽(北京六一儀器廠,型號:DYY-8c),電泳槽(北京六一儀器廠,型號:DYCP-31DN),電子天平(奧豪斯儀器有限公司,型號:CP214),-80度冰箱(Thermo scientific),-20度冰箱(Haier 低溫冷柜),-4度冰箱(Haier 冷藏箱),微波爐(Midea 417-ykk),移液槍(規(guī)格0.5~10 ul;20~200ul;100~1 000 ul),液氮生物容器(YDS-10 型 編號:20060282)。

    1.5 分組及造模方法

    72只雌性SD雌鼠,按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、戊酸雌二醇對照組、壯骨止痛膠囊對照組、補(bǔ)骨脂素高劑量組、補(bǔ)骨脂素低劑量組共6組,每組12只。每只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后,在無菌條件下從距離第一腰椎兩側(cè)外1 cm處縱向切開,除假手術(shù)組僅切除少許脂肪組織外,其余各組大鼠完整摘除雙側(cè)卵巢,徹底止血后分兩層縫合切口。術(shù)后各組大鼠切口嚴(yán)格用絡(luò)合碘消毒,連續(xù)3 d肌注獸用青霉素 (4萬u/只/天)抗炎,5 d后拆線。

    1.6 給藥方法

    各組均從術(shù)后一周開始給藥,每天灌胃1次,連續(xù)13周。除假手術(shù)組和模型組每天灌胃相應(yīng)體積蒸餾水外,其余各組開始灌胃相應(yīng)藥物(1 ml/100 g)。劑量按人鼠體表面積折算,戊酸雌二醇對照組按0.21 mg/kg給藥,壯骨止痛膠囊對照組按相當(dāng)于生藥6.6 g/kg給藥,補(bǔ)骨脂素高、低劑量組分別按8 mg/kg和4 mg/kg給藥。

    1.7 指標(biāo)檢測

    實(shí)驗(yàn)過程中,所有大鼠自由飲水?dāng)z食,每10天稱體重1次。給藥l3周后,每組選取10只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后,切開腹腔,分離腹主動脈插管取血2 ml,待凝固后500 g/min離心分離血清,ELISA法檢測血清中E2、TNF-α、IL-17的含量。提取左股骨組織mRNA樣本進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測TNF-α、ERβ、IL-17的基因表達(dá),取右股骨脫鈣切片免疫組化檢測ERβ。

    1.7.1RT-PCR:(1)總RNA提?。喝?80℃保存的左股骨,在研缽中加入液氮研碎,加入1 ml Trizol,按Trizol說明書抽提總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測定其濃度及純度,A260/A280均在1.8~2.0之間。(2)cDNA合成:采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,內(nèi)含2 μg待測RNA,操作嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄合成說明書執(zhí)行。(3)引物序列及擴(kuò)增條件:按照PCR反應(yīng)條件,取2 μL cDNA模板配成25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。ERβ有意義鏈5′- TCACCGTCGAGCCTTAGTTC -3′,反意義鏈5′- TCTGCATAGAGGAGCGATGA -3′;TNF-α有意義鏈5′-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′,反意義鏈5′-CTGGGAGTAGATAAGGTACA-3′;IL-17有意義鏈5′ATCCATGTGCCTGATGCTGT-3′,反意義鏈5′-GTTATTGGCCTCGGCGTTTG-3′;內(nèi)對照β-actin有意義鏈5′- CCTAGCACCATGAAGATCAA -3′,反意義鏈5′- TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTT -3′。ERβPCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。TNF-αPCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、53℃退火30s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,擴(kuò)增片段141 bp。IL-17PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,擴(kuò)增片段106 bp。β-acin擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,擴(kuò)增片段227 bp。(4)半定量分析:各取PCR產(chǎn)物3 ul,用2%的瓊脂糖電泳及溴化已錠染色,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad) 進(jìn)行拍照,用Image Lab 5.0軟件進(jìn)行定量分析。計(jì)算ERβ、TNF-α、IL-17產(chǎn)物電泳條帶灰度與β-actin產(chǎn)物電泳條帶灰度比值。

    1.7.2免疫組化檢測ERβ:取大鼠的完整右股骨,去除附著的肌肉和筋膜后浸泡在10%福爾馬林PBS中脫鈣后按常規(guī)切片、脫蠟至水洗后經(jīng)抗原修復(fù)。加3%H202PBS溶液室溫孵育10 min,PBS沖洗3次,滴加正常山羊血清(1∶10)室溫孵育10 min。滴加兔抗大鼠ERβ抗體,陰性對照切片采用正常羊血清代替一抗,4℃孵育過夜。然后PBS浸洗3次,再滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG,室溫反應(yīng)30 min,PBS浸洗3次,然后滴加HRP鏈霉菌抗生物素蛋白,室溫反應(yīng)20 min;PBS浸洗3次;然后用0.06%DAB顯色8 min;蘇木精復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片。Olympus BX51型顯微鏡下觀察、拍照,在Image-Pro Plus4.5進(jìn)行圖像分析。

    1.8 統(tǒng)計(jì)方法

    2 結(jié)果

    2.1 補(bǔ)骨脂素對大鼠血清E2測定結(jié)果

    與假手組相比,模型組大鼠血清E2水平非常顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,壯骨止痛膠囊顯著升高血清E2水平(P<0.05),補(bǔ)骨脂素高劑量組血清E2水平顯著升高(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組血清E2水平升高趨勢明顯,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

    表1 不同組別補(bǔ)骨脂素對去卵巢雌鼠血清E2水平的影響(n=6)Table 1 Effect of psoralen on the serum level of E2 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    2.2 補(bǔ)骨脂素對大鼠股骨ERβ表達(dá)的影響

    與假手組相比,模型組股骨ERβ的mRNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均顯著降低(P<0.01或P<0.05)。與模型組相比,戊酸雌二醇組ERβ的表達(dá)顯著升高(P<0.01或P<0.05);壯骨止痛膠囊組股骨ERβ基因表達(dá)顯著升高(P<0.05);補(bǔ)骨脂素高劑量組股骨ERβ基因表達(dá)顯著升高(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組對股骨ERβ基因表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表2。各組ERβmRNA表達(dá)電泳圖見圖1,股骨ERβ免疫組化染色見圖2。

    2.3 補(bǔ)骨脂素對大鼠血清TNF-α水平及基因表達(dá)的影響

    與假手組相比,模型組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達(dá)均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,戊酸雌二醇組血清TNF-α水平和股骨

    表2 不同組別補(bǔ)骨脂素對去卵巢雌鼠股骨ERβ表達(dá)的影響(n=6)Table 2 Effect of psoralen on ERβ in the femur in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    圖1 各組ERβmRNA表達(dá)電泳圖譜 1:補(bǔ)骨脂素低劑量;2:補(bǔ)骨脂素高劑量;3:戊酸雌二醇;4:假手術(shù)組;5:模型組;6:壯骨止痛方;M=DNA MarkerFig.1 The ERβ mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

    TNF-α基因表達(dá)均非常顯著降低(P<0.01);壯骨止痛膠囊組股骨TNF-α基因表達(dá)非常顯著降低(P<0.01),血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05);補(bǔ)骨脂素高劑量組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達(dá)均顯著降低(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05),而股骨TNF-α基因表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表3。各組TNF-αRNA表達(dá)電泳趨勢圖譜見圖3。

    表3 不同組別補(bǔ)骨脂素對去卵巢雌鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)的影響(n=6)Table 3 Effect of psoralen on serum TNF-α and the gene expression of TNF-α in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    2.4 補(bǔ)骨脂素對大鼠血清IL-17水平及其基因表達(dá)的影響

    與假手組相比,模型組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,戊酸雌二醇組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均非常顯著降低(P<0.01);壯骨止痛膠囊組股骨IL-17基因表達(dá)非常顯著降低(P<0.01),血清IL-17水平顯著降低(P<0.05);補(bǔ)骨脂素高劑量組血清IL-17水平非常顯著降低(P<0.01),而股骨IL-17基因表達(dá)顯著降低(P<0.05),補(bǔ)骨脂素低劑量組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均顯著降低(P<0.05),見表4。各組IL-17 mRNA表達(dá)電泳圖譜見圖4。

    表4 不同組別補(bǔ)骨脂素對去勢雌鼠血清IL-17水平及股骨IL-17基因表達(dá)的影響(n=6)Table 4 Effect of psoralen on serum IL-17 and the gene expression of IL-17 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

    注:與模型組比較,**P<0.01,*P<0.05

    圖3 各組TNF-αRNA表達(dá)電泳趨勢圖譜 1:補(bǔ)骨脂素低劑量組;2:補(bǔ)骨脂素高劑量組;3:假手術(shù)組;4:陽性對照組;5:模型組;6:壯骨止痛方組;M:DNA Marker Fig.3 The TNF-α mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

    圖4 各組IL-17 mRNA表達(dá)電泳圖譜 1:補(bǔ)骨脂素低劑量組;2:補(bǔ)骨脂素高劑量組;3:壯骨止痛方組;4:假手術(shù)組;5:陽性對照組;6:模型組;M:DNA Marker Fig.4 The IL-17 mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

    3 討論

    補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的主要活性成分,可與雌激素受體(ER)結(jié)合,啟動雌激素受體元件調(diào)控一系列基因的表達(dá)而發(fā)揮擬雌激素活性[4]。研究表明補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化,增加成骨細(xì)胞骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá),抑制核因子 kB 受體激活因子配體(RANKL)的表達(dá)而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟,從而抑制骨吸收發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[8]。

    雌激素受體有ERα和ERβ兩種亞型,在骨組織內(nèi)主要是ERβ,大部分分布在胞漿中,少部分分布在細(xì)胞膜。雌激素受體與雌激素結(jié)合后,雌激素受體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)。絕經(jīng)后婦女的體內(nèi)不僅雌激素水平大幅下降,而且組織細(xì)胞內(nèi)的ER也下降[9-10]。由于ER是一種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其表達(dá)水平的下降必然影響到受其調(diào)控的一系列基因的表達(dá)。因此,在補(bǔ)充體內(nèi)雌激素的同時,適當(dāng)提高體內(nèi)ER水平能更好地延緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)展。本研究結(jié)果表明,大鼠去卵巢3個月后,其體內(nèi)血清E2水平和股骨ERβ水平顯著下降。給予戊酸雌二醇能顯著提升ERβ的表達(dá)水平。壯骨止痛膠囊不僅提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)E2水平,而且促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨內(nèi)ERβ的表達(dá)。補(bǔ)骨脂素高劑量(8 mg/kg)也具有同時升高骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)E2和ERβ水平的作用。補(bǔ)骨脂素在低劑量(4 mg/kg)時對體內(nèi)E2和ERβ的調(diào)節(jié)作用沒有顯著影響。

    IL-17主要由輔助性T17細(xì)胞(Th17)分泌,IL-17受體廣泛存在于人體各種組織與細(xì)胞中,包括軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)雌激素缺乏可以上調(diào)IL-17,促進(jìn)RANKL的表達(dá)和骨的重吸收,且特異性拮抗IL-17或者IL-17受體缺失的小鼠在切除卵巢后不會發(fā)生骨質(zhì)疏松[11]。因此,IL-17作為Th17細(xì)胞與骨細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)因子,可以作為抗骨質(zhì)疏松藥物的一個新的作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒M大鼠血清IL-17非常顯著升高(P<0.01),而且股骨的IL-17基因表達(dá)也顯著增強(qiáng)(P<0.01),表明去卵巢造成體內(nèi)雌激素缺乏導(dǎo)致股骨內(nèi)的T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá)增強(qiáng),從而提高骨微環(huán)境的IL-17水平,促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收。補(bǔ)充戊酸雌二醇則非常顯著抑制股骨內(nèi)的T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá),降低血清IL-17水平。補(bǔ)骨脂素高劑量(8 mg/kg)和低劑量(4 mg/kg)均能抑制去卵巢大鼠股骨T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá)和血清IL-17水平。

    TNF-α是目前發(fā)現(xiàn)的一種強(qiáng)有力的骨吸收誘導(dǎo)劑,在雌激素缺乏的小鼠中,T細(xì)胞分泌的TNF-α通過與骨髓單核細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合,加強(qiáng)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成[12]。雌激素缺乏時,激活和增殖T細(xì)胞,T細(xì)胞增多,TNF-α、等細(xì)胞因子分泌增多[13],促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和活化,增強(qiáng)破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收過程。本實(shí)驗(yàn)中,去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)升高非常顯著(P<0.01)。給予戊酸雌二醇后,去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)下降非常顯著(P<0.01),這進(jìn)一步證實(shí)雌激素缺乏后T細(xì)胞功能失衡在骨代謝失常中扮演了重要角色。補(bǔ)骨脂素高劑量(8 mg/kg)顯著降低去卵巢大鼠血清TNF-α水平(P<0.05),同時股骨TNF-α基因表達(dá)也明顯下調(diào)(P<0.05)。

    本實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)骨脂素呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系提高去卵巢大鼠血清雌激素水平,同時對去卵巢大鼠TNF-α、IL-17的調(diào)節(jié)也呈現(xiàn)量效關(guān)系。補(bǔ)骨脂素在低劑量(4 mg/kg)對E2和ERβ的影響與模型組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但其仍然能夠抑制TNF-α、IL-17基因表達(dá)和降低血清TNF-α、IL-17水平。這種現(xiàn)象提示補(bǔ)骨脂素可能從兩個方面發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用:一方面補(bǔ)骨脂素通過調(diào)節(jié)體內(nèi)雌激素和雌激素受體水平對TNF-α、IL-17基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),其中包括補(bǔ)骨脂素與雌激素受體結(jié)合;另一方面,補(bǔ)骨脂素可能通過其它非雌激素信號途徑調(diào)節(jié)TNF-α、IL-17基因表達(dá)。相關(guān)的具體作用細(xì)節(jié)需要借助有關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動物和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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