Folin-Ciocalteu比色法測定烏飯樹葉中多酚含量

陳瑞嬌

（韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 韶關(guān) 512005）

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Folin-Ciocalteu比色法測定烏飯樹葉中多酚含量

陳瑞嬌

（韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 韶關(guān) 512005）

摘要：以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu比色法測定烏飯樹葉中的多酚含量.結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0～0.10 mg/mL范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=9.755 7x+0.003 4，R=0.999 3，測定方法的平均回收率為 102.85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.03%.該方法精密度高，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，可用于烏飯樹葉中多酚含量的測定.按照本方法測定烏飯樹葉中多酚的平均含量為 79.47 mg/g（RSD =1.13 %）.

關(guān)鍵詞：Folin-Ciocalteu比色法；烏飯樹葉；多酚

烏飯樹（Vaccsnium bracreatum Thunb）屬于杜鵑花科烏飯樹屬（又稱越桔屬）常綠灌木，又名南燭，是一種藥食兼用的植物［1-2］.全國各地均有分布，尤其以長江流域以南山區(qū)分布最多.《本草拾遺》中記載“南燭枝葉，味苦平，無毒，止泄除睡，堅筋益氣力，久服輕身長年，令人不饑，變白去老”.烏飯樹葉富含花青素和槲皮素為代表的植物多酚類化合物［2］，眾多的研究表明，植物多酚類化合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抑制心血管疾病等等［3-4］.因此，測定烏飯樹葉中多酚含量對于烏飯樹葉藥用價值的評價具有重要意義，目前烏飯樹葉中多酚含量測定的研究尚未見報道，本研究采用Folin-Ciocalteu比色法測定廣東本地野生烏飯樹葉中的多酚含量，以期為烏飯樹葉資源的進一步開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏飯樹葉：8月份采集于廣東韶關(guān)南雄市全安鎮(zhèn)，在55 ℃下烘干，粉碎，過35目篩備用.

沒食子酸：百靈威科技有限公司；乙醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、磷酸、無水碳酸鈉、濃鹽酸、過氧化氫等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

FW177中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；JYD-150智能型超聲波細胞粉碎機：上海之信儀器有限公司；Ultrospec 2000紫外可見光分光光度計：Amersham Pharmacia Biotech公司；BP221S電子分析天平：德國Sartorius公司；HH-S28S恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠.

1.3 方法

1.3.1 Folin-Ciocalteu 顯色劑的配制

稱取2 g鉬酸鈉和8 g鎢酸鈉于圓底燒瓶中，用56 mL蒸餾水溶解，加入4 mL 85 %的磷酸溶液和8 mL 濃鹽酸，文火回流10 h，然后加入1.2 g硫酸鋰及6 mL過氧化氫，加熱沸騰（開口沸）15 min 至亮黃色，不帶綠色為止.冷卻，移入100 mL 容量瓶中，蒸餾水定容，裝入棕色瓶中，置4 ℃冰箱保存［5］.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取10.0 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水適量，超聲溶解，放冷，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，即得0.1 mg / mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，低溫保存?zhèn)溆?精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液.精密量取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加蒸餾水3 mL，再加0.5 mL Folin-Ciocalteu顯色劑，充分搖勻，加入0.75 mL 20%碳酸鈉溶液，混勻，以蒸餾水定容至刻度.在40 ℃下水浴40 min，在 760 nm 處測定吸光度值，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.3 樣品溶液的制備

稱取干燥的烏飯樹葉粉末1 g，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 50%的乙醇，在超聲波細胞粉碎機中超聲提取，設(shè)置超聲波功率為150 W，溫度為45℃，超聲提取時間累計為425 s（超聲時間5秒/間隔時間5秒，超聲次數(shù)85次），提取次數(shù)為3次，每次溶劑量均為50 mL，抽濾，合并3次提取濾液，濃縮后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為待測樣品溶液.

1.3.4 多酚含量測定

準(zhǔn)確吸取1 mL樣品溶液于25 mL的容量瓶中加水稀釋定溶，再從中吸取1 mL置10 mL容量瓶中，加蒸餾水3 mL，加0.5 mL 福林試劑，充分搖勻，加入0.75 mL 20%碳酸鈉溶液，混勻，以蒸餾水定容至刻度，置于40℃恒溫水浴鍋中水浴40 min.以相應(yīng)試劑為空白， 在760 nm 處測定吸光度（ A ） 值.將所測得的吸光度值代入上述回歸方程求得其多酚濃度，然后再按下面公式計算烏飯樹葉多酚含量.

式中：C為提取液多酚質(zhì)量濃度，V為提取液體積，f為稀釋倍數(shù)，m為用于提取的烏飯樹葉粉末質(zhì)量. 1.3.5 Folin-Ciocalteu 比色法方法評價

精密度實驗：按上述樣品溶液的制備和測定方法對同一待測樣品溶液平行測定5 次， 并計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以評價該方法的精密度［6］.

穩(wěn)定性實驗：取待測樣品溶液1 mL，按1.3.4項下方法在工作液顯色完全后在室溫下避光放置， 分別在0、0.5、1、1.5、2、4、8 h 進行吸光度測定，計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以評價該比色法在一段時間內(nèi)的穩(wěn)定性.

重復(fù)性實驗：準(zhǔn)確稱取干燥烏飯樹葉粉末1.0 g，共5 份，按1.3.3樣品溶液的制備方法制備，按1.3.4項下方法測定吸光度，計算樣品多酚含量，并計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以評價該方法的重復(fù)性.

加標(biāo)回收率實驗：精密吸取已知多酚含量的樣品溶液5份，每份0.5 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，再加入0.1 mg /mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，測定并計算多酚的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評價該方法的準(zhǔn)確性和可靠性.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)液的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=9.755 7x+0.003 4（其中，x 表示沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL），y 表示吸光度），相關(guān)系數(shù)R為0.999 3，表明沒食子酸質(zhì)量濃度在0～0.10 mg/mL范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系，該方程可用于烏飯樹葉多酚的定量測定.

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 比色方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

由表1可知，精密度實驗中，對同一樣品溶液進行5次平行測定，測得烏飯樹葉中多酚平均含量為79.34 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60%，表明該方法具有較高的精密度.重復(fù)性實驗測得的5個樣品中，多酚平均含量為79.69 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.60 %，表明該方法重復(fù)性較好.

表1 精密度和重復(fù)性實驗結(jié)果

穩(wěn)定性實驗結(jié)果見表2，吸光值在2 h內(nèi)變化很小，隨著時間的延長，吸光度值略有下降，但下降幅度不大，8 h 內(nèi) RSD為0.96 %，表明顯色后溶液穩(wěn)定性良好，能夠滿足樣品分析的要求.

表2 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.3 加標(biāo)回收率實驗

由表3可知，5次加標(biāo)回收實驗的的回收率在101.11%～103.61%之間，平均回收率為102.85%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于烏飯樹葉多酚含量的測定.

表3 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

2.4 烏飯樹葉中多酚的含量

精密稱取1 g干燥的烏飯樹葉粉末3份，按照上述樣品溶液的制備和測定方法測定吸光度，計算樣品多酚含量.結(jié)果測得3份樣品中的多酚含量分別為78.62、80.41、79.39 mg/g，平均含量為79.47 mg/g，RSD 為 1.13 %.

3 討論

目前植物多酚含量測定方法常用的有高錳酸鉀滴定法、酒石酸亞鐵分光光度法、鐵氰化鉀分光光度法、Folin-Ciocalteu 比色法、高效液相色譜法等［7］.但由于高錳酸鉀滴定法滴定終點較難觀察；鐵氰化鉀分光光度法對測定條件要求嚴(yán)格；高效液相色譜法成本較高等原因，采用較多的方法為酒石酸亞鐵比色法和 Folin-Ciocalteu 比色法，但有文獻報道酒石酸亞鐵比色法測出的數(shù)據(jù)往往偏高［8-9］，F(xiàn)olin-Ciocalteu比色法測出的數(shù)據(jù)更接近真實值，目前我國茶葉茶多酚測定的國家標(biāo)準(zhǔn)也是采用Folin-Ciocalteu比色法.因此本試驗采用Folin-Ciocalteu比色法測定烏飯樹葉中的多酚含量，顯色后溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～0.10 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.方法的精密度高，RSD 為 0.60 % ；重現(xiàn)性好，RSD 為 1.60 % ；平均回收率為 102.85 %，RSD為1.03 %；測得烏飯樹葉中多酚平均含量為79.47 mg/g.李穎暢［10］等采用Folin-Ciocalteu法測得與烏飯樹同屬的藍莓4個品種葉中多酚含量為51.5～9.5 mg/g，其中北陸藍莓葉中多酚含量與本實驗結(jié)果較一致.而余清［11］使用酒石酸亞鐵比色法測定的烏飯樹葉多酚含量為113.6 mg/g，其測定的數(shù)據(jù)比本研究的數(shù)據(jù)高出43%，結(jié)果的偏差可能主要與測定方法不同有關(guān)，同時也與多酚提取方法、烏飯樹葉產(chǎn)地等的不同有一定的關(guān)系.本研究表明，F(xiàn)olin-Ciocalteu比色法操作簡便，精密度及準(zhǔn)確度較高， 重復(fù)性及穩(wěn)定性好， 是檢測烏飯樹葉中多酚的可靠方法.

參考文獻：

［1］ 魏振承，張名位.烏飯樹屬植物資源的營養(yǎng)功能及其開發(fā)應(yīng)用［J］.中國野生植物資源，2001， 20（2）：21-23.

［2］ 陳重明，張寧，王鳴.烏飯樹（ Vaccinium bracteatum Thunb. ）的民族植物學(xué)［J］.植物資源與環(huán)境，1998，7（1）：45-48.

［3］ 尹志娜.植物多酚分離提取方法和生物功能研究進展［J］.生命科學(xué)儀器，2010，8（3）：43-49.

［4］ 劉運榮，胡健華.植物多酚的研究進展［J］.武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2005，24（4）：63-65，106.

［5］ 周媛，喻玲玲，李新蘭，等.苧麻葉中總多酚的含量測定［J］.食品科技，2009，34 （4）：193-197.

［6］ 李文仙，俞丹，林玲，等.Folin-Ciocalteu 比色法應(yīng)用于蔬菜和水果總多酚含量測定的研究［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2011，33（3）：302-307.

［7］雷昌貴，陳錦屏，盧大新，等.食品中多酚類化合物的測定方法及其研究進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007，33（1）：100-104.

［8］王燁軍，徐奕鼎 ，黃建琴，等.酒石酸亞鐵比色法和高錳酸鉀滴定法測定茶多酚的比較［J］，茶葉通報，2010，32（2）：61-63.

［9］賈有青，谷晶閆，書婷.茶葉中茶多酚含量的測定方法比較［J］.中國茶葉，2014，36（1）：20-21.

［10］李穎暢，呂艷芳，勵建榮.Folin-Ciocalteu 法測定不同品種藍莓葉中多酚含量［J］.中國食品學(xué)報，2014，14（1）：273-278.

［11］余清.烏飯葉多酚提取工藝的研究［J］.福建輕紡，2011（6）：27-31.

（責(zé)任編輯：閆文龍）

中圖分類號：R284.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5348（2016）02-0037-04

［收稿日期］2015-12-20

［基金項目］2012年度韶關(guān)學(xué)院科研項目（韶關(guān)學(xué)院［2012］202號）.

［作者簡介］陳瑞嬌（1968-），女，廣東南雄人，韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院副教授；研究方向：植物活性成分研究.

Determination of Polyphenols Content in Vaccinium bracteatum Thunb Leaves by Folin-Ciocalteu Colorimetric Method

CHEN Rui-jiao
（ Yingdong College of Biological Sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

Abstract:With gallic acid as the standard， the content of polyphenols in Vaccinium bracteatum Thunb leaves was determined by Folin-Ciocalteu colorimetric method. The results showed that there was a good linearity between concentration of gallic acid and its absorbency in the range of 0～0.10 mg/mL， the regression equation was y=9.755 7x+0.003 4， R=0.999 3. The average recovery rate of the added sample was 102.85%， with relative standard deviation （RSD） of 1.03%. The method is highly precise， reproducible and stable. Thus， this method can be applied to determine the content of polyphenols in Vaccinium bracteatum Thunb leaves. The average content of polyphenols in Vaccinium bracteatum Thunb leaves was 79.47 mg/g （RSD =1.13 %） .

Key words:Folin-Ciocalteu colorimetry；Vaccinium bracteatum Thunb leaves；polyphenols