肺腺癌患者胸水中腫瘤耐藥相關(guān)基因蛋白的表達(dá)及臨床意義

馬秦榕　鄭錦花　鐘玲玲　胡　潔　陳　顥

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西　桂林　541001)

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·腫瘤·

肺腺癌患者胸水中腫瘤耐藥相關(guān)基因蛋白的表達(dá)及臨床意義

馬秦榕鄭錦花鐘玲玲胡潔陳顥

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西桂林541001)

〔摘要〕目的檢測(cè)P-糖蛋白(P-gp)、肺癌耐藥蛋白(LRP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)在肺腺癌及惡性間皮瘤患者胸水沉渣包埋組織中的表達(dá)及臨床意義。方法采用S-P免疫組化方法，對(duì)63例未做放化療的肺腺癌或惡性間皮瘤患者進(jìn)行檢測(cè)，記錄其胸水沉渣包埋組織中P-gp、LRP、MRP的表達(dá)水平。結(jié)果肺腺癌患者胸水沉渣包埋組織中P-gp、LRP、MRP的陽(yáng)性率均高于非腫瘤性胸水患者(P<0.05)；惡性間皮瘤患者胸水沉渣包埋組織中P-gp、LRP的陽(yáng)性率均高于非腫瘤性胸水患者(P<0.05)，但兩者M(jìn)RP陰性率無(wú)顯著差異(P>0.05)。P-gp、LRP、MRP與肺腺癌患者年齡、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)密切相關(guān)(P>0.05)。結(jié)論肺腺癌及惡性間皮瘤腫瘤細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類(lèi)耐藥基因有較強(qiáng)的耐藥性，檢測(cè)P-gp、LRP、MRP的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)指導(dǎo)臨床化療方案的實(shí)施有重要意義。

〔關(guān)鍵詞〕沉渣包埋；耐藥相關(guān)基因蛋白；免疫組化；化學(xué)治療

肺腺癌和惡性間皮瘤常導(dǎo)致胸腔積液，化療中也常常會(huì)出現(xiàn)耐藥問(wèn)題影響其療效。胸水沉渣石蠟包埋技術(shù)是通過(guò)多次離心胸水后將沉渣包埋制片，具有組織塊優(yōu)勢(shì)，可連續(xù)切片并可用于免疫組化染色，有利于胸水的確診并指導(dǎo)臨床治療。本文擬探討耐藥基因蛋白在肺腺癌及惡性間皮瘤患者胸水沉渣組織中的表達(dá)及臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料63例惡性胸腔積液的沉渣包埋組織均來(lái)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年1月～2014年6月住院患者，均在抽取胸腔積液之前未經(jīng)過(guò)放、化療，收治的均經(jīng)病理活檢確診，其中肺腺癌53例，惡性間皮瘤10例。肺腺癌中男23例，女30例，年齡39～80歲，平均65歲；惡性間皮瘤中男6例，女4例，年齡38～77歲，平均66歲。另設(shè)60例非腫瘤性胸水(結(jié)核性胸水)作為對(duì)照。

1.2方法采用S-P免疫組化方法，主要檢測(cè)試劑盒由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供，取肺腺癌、惡性間皮瘤和非腫瘤性胸水沉渣標(biāo)本用4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)P-糖蛋白(P-gp)、肺癌耐藥蛋白(LRP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)在胸水沉渣包埋組織中的表達(dá)，用已知切片作陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，胸水沉渣包埋切片的免疫組化結(jié)果與組織病理免疫組化結(jié)果一致。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)P-gp和MRP的陽(yáng)性表達(dá)部位在胞膜/胞質(zhì)，LRP陽(yáng)性表達(dá)部位在胞質(zhì)。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分〔1〕：染成淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分；再根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分：<25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分，將每例兩項(xiàng)得分相乘計(jì)入總分，若總分為0～3分判為-，4～8分判為+，9～12分判為。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1P-gp、LRP和MRP在肺腺癌及惡性間皮瘤患者胸水沉渣包埋組織中的表達(dá)肺腺癌患者胸水中P-gp、LRP、MRP陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于非腫瘤性胸水(P<0.05)；惡性間皮瘤患者的胸水中P-gp和LRP陽(yáng)性表達(dá)率高于非腫瘤性胸水(P<0.05)，但兩者M(jìn)RP表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。染色陽(yáng)性部位主要位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色顆粒強(qiáng)于背景著色(圖1)。

表1　耐藥基因蛋白在肺腺癌及惡性間皮瘤胸水沉渣包埋組織中的表達(dá)〔n(%)〕

A：腺癌細(xì)胞環(huán)狀排列，核大深染，胞質(zhì)空泡狀或含黏液(HE，×400)；B：惡性間皮瘤細(xì)胞呈散在排列并可見(jiàn)核仁(HE，×400)；C：P-gp陽(yáng)性表達(dá)位于肺腺癌細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)(S-P法，×400)；D：LRP陽(yáng)性表達(dá)位于肺腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜(S-P法，×400)；E：P-gp陽(yáng)性表達(dá)位于惡性間皮瘤細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)(S-P法，×400)；F：LRP陽(yáng)性表達(dá)位于惡性間皮瘤細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜(S-P法，×400)圖1　P-gp、LRP在肺腺癌、惡性間皮瘤中的表達(dá)

2.2P-gp、LRP、MRP的協(xié)同表達(dá)關(guān)系三種耐藥基因相關(guān)蛋白在肺腺癌及惡性間皮瘤患者胸水中協(xié)同表達(dá)，肺腺癌患者胸水中三種耐藥基因蛋白協(xié)同表達(dá)為18例(33.96%)，其中P-gp和LRP協(xié)同表達(dá)為42例(79.25%)，而惡性間皮瘤患者三種耐藥基因蛋白協(xié)同表達(dá)僅為1例(10.0%)，P-gp和LRP協(xié)同表達(dá)則高達(dá)7例(70.0%)，可見(jiàn)P-gp和LRP的協(xié)同表達(dá)率較高。

2.3胸水沉渣包埋組織中耐藥基因蛋白的表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系P-gp、LRP、MRP的表達(dá)與肺腺癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者年齡無(wú)密切關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　胸水中P-gp、LRP、MRP的表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%),n=53〕

3討論

近年來(lái)我國(guó)肺癌的發(fā)病率逐年快速上升，死亡率較高，約占18.2%〔2〕，其中肺腺癌是常見(jiàn)的組織學(xué)分型，屬于非小細(xì)胞肺癌，因其早期確診率低，所以很多肺腺癌患者就診時(shí)已為中晚期，患者常伴有胸腔積液，而腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，因此常導(dǎo)致腫瘤化療失敗〔3〕。

P-gp基因分子量為170 kD，是一種能量依賴(lài)性藥物泵，當(dāng)細(xì)胞膜上的P-gp合成增加時(shí)，可將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，降低許多化療藥物在細(xì)胞內(nèi)有效濃度，削弱其殺傷作用而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生〔4〕。P-gp陽(yáng)性表達(dá)使阿霉素(ADM)、柔紅霉素、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿(VCR)、足葉乙甙(VP16)、紫杉醇等對(duì)腫瘤抑制率降低〔5，6〕。MRP基因位于染色體16號(hào)P13區(qū)1帶，分子量190 kD。該蛋白表達(dá)位于細(xì)胞膜上，如果MRP的基因轉(zhuǎn)染給正常細(xì)胞則使該細(xì)胞對(duì)VP16、ADM、VCR、柔紅霉素等發(fā)生耐藥。MRP可以促使細(xì)胞排出藥物而致胞內(nèi)藥物濃度降低，或?qū)⑺幬镂肽遗荻淖兯幬锓植?，最終均導(dǎo)致耐藥。LRP 基因位于16號(hào)染色體P13區(qū)1帶與P11區(qū)2帶間，分子量為110 kD，是與聚泡相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞微粒體。LRP使胞質(zhì)中的藥物吸入運(yùn)輸囊泡，通過(guò)胞吐方式排出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降。LRP導(dǎo)致耐藥的另一機(jī)制是將藥物從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，從而降低細(xì)胞核內(nèi)靶點(diǎn)藥物濃度〔7〕。LRP介導(dǎo)的耐藥底物有蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤抗生素、長(zhǎng)春堿類(lèi)等，還包括順鉑、卡鉑、烷化劑等。由于這些藥物主要作用于DNA，提示核屏蔽作用可能是LRP特有的作用機(jī)制。通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，高度耐藥的腫瘤細(xì)胞株中大多數(shù)存在LRP和MRP的共同表達(dá)，這些結(jié)果表明這兩種基因在定位功能表達(dá)中存在某種關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果表明，肺腺癌患者胸水沉渣包埋組織中P-gp、LRP、MRP較非腫瘤性胸水沉渣包埋組織均有過(guò)度表達(dá)其陽(yáng)性率與參考文獻(xiàn)〔8〕相似。Mahond等〔9〕實(shí)驗(yàn)表明，用藥后P-gp表達(dá)陽(yáng)性的病例死亡危險(xiǎn)率大于P-gp陰性病例3倍，因此認(rèn)為P-gp陽(yáng)性表達(dá)與預(yù)后不良明顯相關(guān)。周庚寅等〔10〕報(bào)道P-gp陽(yáng)性患者3年生存率明顯低于P-gp陰性患者，提示P-gp表達(dá)陽(yáng)性患者對(duì)化療藥物不敏感，有明顯的耐藥性，從而治療效果及預(yù)后差。因此P-gp、LRP、MRP在肺腺癌化療過(guò)程中起到的藥物減毒作用，可導(dǎo)致肺腺癌化療失敗〔11〕。本研究結(jié)果提示肺腺癌對(duì)化療不敏感，與臨床化療隨訪(fǎng)結(jié)果相符，可見(jiàn)胸水沉渣包埋組織中耐藥基因蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率可以為肺腺癌患者選擇化療方案提供參考依據(jù)。另有作者報(bào)道，腫瘤耐藥相關(guān)基因表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，認(rèn)為其過(guò)度表達(dá)也是癌細(xì)胞生物學(xué)行為的惡性標(biāo)志〔12〕。本研究結(jié)果表明，肺腺癌病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者年齡，不宜作為判斷肺腺癌惡性程度和預(yù)后的指標(biāo)。另外P-gp和LRP兩種耐藥基因蛋白可以作為臨床選擇化療方案的參考依據(jù)，但因?yàn)榛颊呃龜?shù)較少，還需要進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2016-02-18修回〕

(編輯滕欣航)

基金項(xiàng)目：廣西區(qū)衛(wèi)計(jì)委自籌課題(Z2015414)

通訊作者：鄭錦花(1970-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤發(fā)病機(jī)制、鑒別診斷及綜合治療研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R734.2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3193-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.047

第一作者：馬秦榕(1991-)，女，在讀碩士，主要從事胸部腫瘤發(fā)病機(jī)制、鑒別診斷及綜合治療研究。