H PLC測(cè)定不同產(chǎn)地酒黃精中5-羥甲基糠醛含量

郭婕王英姿孫秀梅張兆旺（山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南5004；北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京000；山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南5004）

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H PLC測(cè)定不同產(chǎn)地酒黃精中5-羥甲基糠醛含量

郭婕1王英姿2孫秀梅3張兆旺3
（1山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南250014；2北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102；3山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014）

【摘要】目的：比較不同產(chǎn)地酒黃精中5-羥甲基糠醛的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Phenomenex-C18（150 mm×4.60 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸水（5∶95）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；進(jìn)樣量20 μL；線性范圍：2.016～40.32 μg/mL（r=0.999 9）。結(jié)果：云南版納、云南云龍、云南思茅、云南文山、貴州石阡、貴州安順、貴州遵義、湖南沅陵、湖南懷化、安徽宣城等地酒黃精5-羥甲基糠醛含量分別為：2.127，2.244，2.076，2.312，1.975，1.951，1.930，1.845，1.878，1.649 mg/g。結(jié)論：不同產(chǎn)地黃精中5-羥甲基糠醛的含量差異明顯，其中以云南文山產(chǎn)酒黃精中5-羥甲基糠醛的含量最高。

【關(guān)鍵詞】產(chǎn)地；酒黃精；5-羥甲基糠醛；高效液相色譜法；含量測(cè)定

黃精為百合科植物滇黃精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之功效［1］。既是藥品又是食品。因其生品有刺激咽喉的不良反應(yīng)，故需經(jīng)炮制后供使用。黃精經(jīng)酒制后，不僅可以消除刺激性，而且能增強(qiáng)補(bǔ)益療效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃精有明顯的提高免疫系統(tǒng)功能、抗疲勞、抗衰老、降血糖、降血脂等藥理作用［2-4］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)酒制后黃精中5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量增加明顯，王永祿及曾林燕等對(duì)炮制過程中5-HMF含量改變進(jìn)行探討［5-6］。5-HMF在醫(yī)藥領(lǐng)域作為有效成分制備抗心肌缺血的心血管病藥品，已被中國(guó)藥科大學(xué)作為專利進(jìn)行申請(qǐng)（申請(qǐng)專利號(hào)：CN97107191.8，公開號(hào)：CN1182589），這與現(xiàn)代研究中酒黃精對(duì)心血管的作用是相一致的。治療心律失常的步長(zhǎng)穩(wěn)心顆粒，其配方也是以黃精為主要原料制配而成［7］。多年來5-HMF的藥理作用研究取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一定的爭(zhēng)議，沒有公認(rèn)的結(jié)論［8］。之前有研究認(rèn)為，5-HMF有一定的毒副作用，對(duì)眼睛、黏膜、皮膚有刺激性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合后引起中毒，造成橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，并且具有神經(jīng)毒性，且存在潛在的遺傳及生殖毒性，有不少中藥品種也制定了有關(guān)5-HMF的含量測(cè)定方法［9］。近年來，對(duì)于5-HMF的藥理作用出現(xiàn)一些新的研究，發(fā)現(xiàn)它有很多對(duì)人體有益的積極作用，5-HMF是一種能有效防治神經(jīng)退行性疾病、認(rèn)知損害和抗心肌缺血的心血管病藥物，它很有可能是被人們忽視的存在于單味中藥及復(fù)方背后的一種活性成分［10］。本實(shí)驗(yàn)以不同產(chǎn)地酒黃精為研究對(duì)象，對(duì)5-HMF的含量進(jìn)行比較。

1　實(shí)驗(yàn)儀器與材料

DYQ420型參茸切片粉碎雙用機(jī)（浙江省瑞安市環(huán)球藥械廠）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器公司）；FA-1104型電子天平（上海精密儀器廠）；AE 240型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；721型分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；LDZ4-0.8北京醫(yī)用離心機(jī)；LC-10AT高效液相色譜儀（日本·島津）；SPD-10A檢測(cè)器；N2000色譜工作站。

黃精藥材經(jīng)專家鑒定為百合科植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖。取黃精藥材100 g，洗凈，加入黃酒 20 kg，水20 kg，潤(rùn) 1 h，蒸 7 h，悶3 h。取出，80℃烘至藥材不粘手，切厚片（3 mm），80℃干燥，即得。悶潤(rùn)后蒸制為黑褐色飲片，顯黏性，味甜。粉碎成粗粉（過《中國(guó)藥典》2號(hào)篩），備用。

5-HMF（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111626-200301），黃酒（安徽海神黃酒有限公司釀造）。甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1樣品的制備

分別取云南、貴州、湖南、安徽產(chǎn)黃精洗凈，按確定的中試工藝制備酒黃精，共10批，其中云南4批，貴州3批，湖南2批，安徽1批。本品為黑褐色飲片，顯黏性。味甜。粉碎成粗粉（過《中國(guó)藥典》2號(hào)篩），備用。

2.2酒黃精的含水量測(cè)定

取“2.1”項(xiàng)下樣品，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄53頁水分測(cè)定法中甲苯法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1　含水量測(cè)定結(jié)果

2.3酒黃精的5-HMF含量測(cè)定

2.3.1供試液的制備分別取“2.1”項(xiàng)下樣品各0.4 g，精密稱定，加甲醇15 mL，超聲提取20 min，濾過，濾渣加甲醇 10 mL，超聲提取 10 min，濾過，濾液依次定容至25 mL，制得供試液F1～10（每1 mL相當(dāng)于藥材約0.016 g），備用。

2.3.2對(duì)照液的制備取 5-HMF對(duì)照品 10 mg，精密稱定。用甲醇溶解定容至2 mL，備用。

2.3.3色譜條件色譜柱：Phenomenex-C18（150 mm× 4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸水（5:95）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；進(jìn)樣量20 μL；采用保留時(shí)間定性；分析方法：外標(biāo)兩點(diǎn)法。

2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取“2.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照液，分別稀釋，得到7個(gè)不同濃度的對(duì)照液，分別取 20 μL進(jìn)樣，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定。結(jié)果見表2。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，見圖2。回歸方程為：y=50 180x＋ 8 307.2（r=0.999 9），線性范圍：2.016～ 40.32 μg/mL。

圖1　5-HMF高效液相圖譜

表2　5-HMF高效液相吸收曲線測(cè)定結(jié)果

圖2　5-HMF高效液相標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5精密度試驗(yàn)精密移取“2.3.4”項(xiàng)下對(duì)照液（25.20 μg/mL）20 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定。連續(xù)測(cè)定5次，RSD為0.47%，表明精密度良好，見表3。

表3　精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.6重現(xiàn)性試驗(yàn)精密移取“2.1”項(xiàng)下樣品（湖南沅陵），按“2.3.1”項(xiàng)下條件制備供試液5份，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定。連續(xù)測(cè)定5次，RSD為0.71%，表明該測(cè)定方法重現(xiàn)性好（表4）。2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密移取“2.3.4”項(xiàng)下對(duì)照液（25.20 μg/mL）20 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，每隔24 h依法測(cè)定1次，連續(xù)5天，RSD為1.65%，表明5天內(nèi)穩(wěn)定性良好（表5）。

表4　重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

表5　穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.3.8樣品的5-HMF含量測(cè)定取“2.3.1”項(xiàng)下供試液 F1～10，稀釋至適宜濃度，精密移取 20 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定。計(jì)算各樣品中5-HMF含量。結(jié)果見表6。

表6　5-HMF含量測(cè)定結(jié)果

2.3.9回收率考察精密移取“2.3.1”項(xiàng)下供試液F8共 5份，每份 10 μL，分別加入“2.3.4”項(xiàng)下對(duì)照液10 μL，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表7。

表7　5-HMF回收率考察結(jié)果

3　討論

傳統(tǒng)中藥材講究道地藥材，道地藥材是指在一特定自然條件、生態(tài)環(huán)境的地域內(nèi)所產(chǎn)的藥材，因生產(chǎn)較為集中，栽培技術(shù)、采收加工也都有一定的講究，以致較同種藥材在其他地區(qū)所產(chǎn)者品質(zhì)佳、療效好。道地，也就是地道，也即功效地道實(shí)在，確切可靠。古代本草有關(guān)道地藥材的論述從東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》開始，歷代本草對(duì)藥材產(chǎn)地和療效的關(guān)系均有記載，而明確道地產(chǎn)區(qū)的最早文獻(xiàn)是明代的《本草品匯精要》。該書記載植物藥916種，明確道地優(yōu)劣的有2種。

我國(guó)有黃精30余種，分布廣泛，《中國(guó)藥典》2010年版［11］僅對(duì)黃精中的黃精多糖進(jìn)行了限量規(guī)定，雖然多糖類有一定的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用［12］，但不能全面反映酒黃精的質(zhì)量。黃洪新等［13］對(duì)河南，河北，山西產(chǎn)地的生黃精進(jìn)行了 5-HMF含量測(cè)定，以河北產(chǎn)地的為高；曾林燕等［6］以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法對(duì)黃精，滇黃精和多花黃精的生品進(jìn)行5-HMF含量測(cè)定，認(rèn)為其不存在于生品中，但未注明生品的明確加工過程和技術(shù)參數(shù)（如干燥時(shí)間及干燥溫度）［6］；常亮等［14］對(duì)黃精，滇黃精和多花黃精的生品進(jìn)行5-HMF含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同黃精生品含有的5-HMF量不同，但都很微量。本研究認(rèn)為5-HMF不是生黃精的主要藥效成分，在生黃精的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中可忽略或較少考慮此成分的測(cè)定。黃精酒制過程加熱時(shí)間長(zhǎng)，溫度較高，含有大量的糖類成分，炮制過程中可能產(chǎn)生還原糖類成分與氨基酸類成分的美拉德反應(yīng)，不可避免會(huì)產(chǎn)生5-HMF等反應(yīng)產(chǎn)物，5-HMF作為酒黃精中主要活性成分之一，有必要對(duì)其含量進(jìn)行控制。

本研究結(jié)果表明各地酒黃精中5-HMF含量差別明顯，其含量從低到高依次為安徽宣城、湖南沅陵、湖南懷化、貴州遵義、貴州安順、貴州石阡、云南思茅、云南版納、云南云龍、云南文山，以云南產(chǎn)為高。測(cè)定不同產(chǎn)地酒黃精中5-HMF的含量可為研究黃精產(chǎn)地對(duì)酒黃精質(zhì)量的影響及酒黃精的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定奠定基礎(chǔ)。

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doi：10.3969/j.issn.1672-5433.2016.02.007

收稿日期：（2015-09-11）

作者簡(jiǎn)介：郭婕，女，碩士，主管藥師。主要從事食品藥品等健康相關(guān)產(chǎn)品的研究。通訊作者E-mail：gjsd2008@126.com

Determination of 5-Hydroxymethyl Furfural Content in Alcoholis Rhizoma Polygonat from Different Places of Production by HPLC

Guo jie1，Wang Yingzi2，Sun Xiumei3，Zhang Zhaowang3
（1 Shandong Center for Disease Control and Prevention，Shandong Jinan 250014，China；2 School of Chinese Pharmacy of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102；3 Shandong University of Chinese Medicine，Jinan 250014）

ABSTRACTObjective:To compare the content of 5-hydroxymethyl furfural（HMF）in Alcoholis Rhizoma Polygonat derived from different places of production.Methods:High performance liquid chromatography（HPLC）was adopted. The Phenomenex-C18column（150 mm×4.60 mm，5 μm）was used，serving methanol-0.05%phosphoric acid solution （5∶95）as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 284 nm，while the sample loading was 20 μL.The linear range of 5-HMF was 2.016～40.32 μg/mL（r=0.999 9）.Results:The content of 5-HMF in Alcoholis Rhizoma Polygonat from Banna Yunnan，Yunlong Yunan，Simao Yunan，Wenshan Yunan，Shiqian Guizhou，Anshun Guizhou，Zunyi Guizhou，Yuanling Hunan，Huaihua Hunan and Xuancheng Anhui were 2.127，2.244，2.076，2.312，1.975，1.951，1.930，1.845，1.878 and 1.649 mg/g，respectively.Conclusion:The contents of 5-HMF in Alcoholis Rhizoma Polygonat from different places of productionn are significantly different，in which one from Wenshan Yunnan is the highest.

KEY WORDSPlace of Production；Origin；Alcoholis Rhizoma Polygonat；5-Hydroxymethyl Furfural（HMF）；HPLC；Content Determination