血管緊張素Ⅰ放射免疫分析方法（固相抗體法）的建立

盧金輝劉榮建祖旺春劉瑞張雪峰（. 原子高科股份有限公司，北京 0243；2.中國原子能科學研究院，北京 0243）

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血管緊張素Ⅰ放射免疫分析方法（固相抗體法）的建立

盧金輝1，2劉榮建1，2祖旺春1劉瑞1張雪峰1，2
（1. 原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中國原子能科學研究院，北京 102413）

【摘要】目的：采用固相抗體包被方法，建立血管緊張素Ⅰ放射免疫分析方法。方法：通過對抗體包被步驟、抗體稀釋濃度、反應時間、反應體積等條件進行選擇，建立新的分析方法，并進行方法學鑒定。結果：本項工作所建立的分析方法測量范圍為100-7800pg/ml，靈敏度為42.2 pg/ml。批內、批間變異均小于10%，回收率為90.3%—102.2%。結論：本項工作所建立的固相抗體方法與原有分離試劑分析方法相比，具有操作步驟少、反應時間短等優(yōu)點，更加方便臨床檢測。

【關鍵詞】血管緊張素Ⅰ 固相抗體法 放射免疫分析

1 引言

采用固相抗體包被聚苯乙烯試管，并對抗體包被條件進行了研究，建立了血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法。結果表明在2—8℃下過夜包被，抗體滴度在1：9萬 時，制備的包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，結合達到最大；不同滴度下包被，包被溫度和時間對制備的包被管的影響不同；不同的反應時間以及125I—AI和標準品加樣量的不同也會對包被管的結合產生影響。血管緊張素Ⅰ包被管法放射免疫分析靈敏度為（42.2Pg/ml）；回收率為（90.3%—102.2%）；批內、批間變異系數(shù)分別為（5.1%—9.0%）和（8.3%—10.2%）。

2 實驗材料

血管緊張素Ⅰ多克隆抗體由原子高科醫(yī)學二部提供；聚苯乙烯六角試管（mm×mm）為（哪個）塑料廠產品；125I—AI及AI藥盒標準品由原子高科醫(yī)學二部提供；蛋白G填料親合層析柱由美國進口；牛血清白蛋白（BSA）為上海生物制品廠產品。對照藥盒由原子高科股份有限公司生產（國藥準字：）。其他試劑均為分析純。

3 實驗方法

3.1 兔IgG的純化

采用蛋白—G柱進行親合層析純化，純化后IgG濃度由紫外分光光度法測定。

用包被緩沖液（0.1M PH9.5碳酸緩沖液）將兔IgG配制10μg /ml。混合均勻后250μL /管包被，然后放2—8℃過夜，棄去包被管中第一層包被液，各管用500μL洗滌液（0.02 mol/μL，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第二層（兔二抗）用。

3.2 用驢抗兔二抗進行第二層包被

表1　 不同滴度的抗體包被實驗

表2　 包被溫度和包被時間對抗體包被的影響

表3　反應時間、反應溫度對免疫分析的影響（總T為：32801cpm/min）

表4　 加樣量對免疫分析的影響

表5　 回收實驗結果 單位pg/ml

表6　 批內與批間重復性

表7　健全性實驗結果 （此處可以不列表，直接說）

用0.05 mol/μL，pH7.4磷酸緩沖液（含1%BSA）將兔二抗配成合適的濃度后250μL/管包被，然后放2—8℃過夜，棄去包被管中第二層包被液，各管用500μL洗滌液（0.02 mol/μL，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第三層（兔一抗）用。

3.3 不同滴度兔抗（一抗）包被實驗

將兔抗用封閉液配制成1：2萬，1：4萬，1：6萬，1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬，1：16萬不同的滴度，分別加250μL于已經包有兔二抗的包被管中，每個滴度做雙復管，之后在每管中加入100μL125I—AI，然后放2—8℃靜置過夜；棄去管中溶液，各管用500L洗滌液清洗3次后測量各管放射性計數(shù)，計算其結合率，選擇合適的抗體滴度作為工作稀釋度。

3.4 溫度，時間對抗體包被的影響

用封閉液將兔抗（一抗）稀釋成不同滴度（1：2萬，1：4萬， 1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬），分別在不同溫度和時間下包被，實驗中抗體加入體積均為250μL，各管均加入100μL125I—AI，將不同條件下制備的包被管進行放射免疫結合分析，并對結果進行比較。

3.5 抗體包被管的制備

每管加250μL兔IgG溶液（10μg /ml），2—8℃靜置過夜，棄溶液，各管加500μL洗滌液清洗1次后加入250μL驢抗兔二抗溶液，2 —8℃靜置過夜，棄溶液，各管加500μL洗滌液清洗1次后加入250μ L兔一抗溶液（1：9萬），2—8℃過夜，棄溶液，各管加500μL洗滌液清洗1次，棄溶液，自然晾干，密閉，于2—8℃下保存。

3.6 體系反應時間，溫度的選擇

設計不同的反應條件為37℃1h，37℃3h，4℃15h，4℃24h。

3.7 加樣量的選擇

設計4組不同的加樣量為：第一組125I—AI加100μL，標準品加100μL；第二組：125I—AI加100μL，標準品加50μL；第三組125I—AI 加50μL，標準品加100μL；第四組125I—AI加50μL，標準品加50μ L。

3.8 放射免疫分析程序

標準品（或樣品、質控血清）100μL和標記物100μL加于包被管中，混勻，然后放2—8℃靜置過夜（15—24h），棄溶液，加500μL洗滌液清洗2—3次，測各管放射性計數(shù)。

3.9 方法學考核

靈敏度：以20個零標準管的計數(shù)平均值—2S對應的劑量值表示。準確度：任取一份血漿標本，測定基值后分別加入0pg/ml，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的標準品，再次測定，計算回收率。精密度：測定批內和批間變異系數(shù)（CV%）。健全性：將一份高濃度樣品稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64分別測定其含量。經回歸處理后成一條直線，y=1.000 x +0.4673，r=1.000。

4 結果與討論

4.1 不同滴度的兔抗（一抗）包被實驗

不同滴度抗體包被實驗結果列于表1，表1結果表明，當抗體滴度為1：16萬—1：8萬時，隨著抗體滴度的減小，包被管的結合率逐步升高；當抗體滴度為1：8萬—1：2萬時，包被管的結合率沒有出現(xiàn)明顯升高，基本保持同一水平。所以在不影響放免藥盒靈敏度的前提下，選擇1：9萬作為抗體的工作稀釋度，用于包被。（該處可以作圖，不列表）

4.2 包被時間，包被溫度對包被的影響

結果列于表2由表2可知，包被溫度和包被時間對包被管免疫結合的影響依賴于包被時加入抗體的濃度。當加入抗體的滴度為1：2萬和1：4萬時，升高包被溫度使包被管的免疫結合增加，而延長包被時間對包被管的免疫結合無顯著影響；當加入抗體滴度為1：14萬和1：16萬時，升高包被溫度包被管的免疫結合顯著減少，原因可能是抗體在低濃度時較不穩(wěn)定，包被過程中較高的溫度使抗體的活性損失；當加入抗體滴度為1：8萬和1：9萬時，包被溫度對包被管的免疫結合影響減少，且包被時間從3h延長到24h，包被管的免疫結合有所增加。此結果提示，在較高溫度下，采用較大抗體濃度，只需要較短的包被時間，即可獲得具有較高免疫結合的抗體包被管。但考慮到實際生產中低成本和包被工藝簡便性的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇抗體滴度為1：9萬，2—8℃過夜（15—24h）作為包被條件。

4.3 體系反應時間、反應溫度的選擇

結果列于表3，由表3可知，當反應溫度在37℃時，延長反應時間從1 h到3 h，免疫分析的最大結合S0%從46.4%增加到59.2%，但是標準曲線的最高濃度點的抑制不好，分別為37℃1 h為16.1%；37℃3 h為14.6%，這可能是反應不充分造成的。而反應溫度在2—8℃時，延長反應時間從15—24h，免疫反應的幾個指標都比較好，同時也克服了37℃反應曲線抑制不好的問題，所以在考慮實際操作簡便，節(jié)省時間的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇反應條件為2—8℃過夜。

4.4 加樣量對免疫分析的影響

結果列于表4由表4可知，當加入標記物的量都是50μL時，加入100μL標準品的包被管的免疫分析主要指標最大結合S0%，曲線的抑制都好于加入50μL標準品的包被管免疫分析主要指標，加50μ L標準品的包被管的曲線抑制不好，標準曲線最低濃度點的B/B0% 為94.1%，最高濃度點的B/B0%為14.6%。但是考慮到加50μL標記物的各管計數(shù)都比較低，還有計數(shù)器的效率等問題，所以標記物的加樣量就不采用50μL加樣。當加入標記物的量都是100μL時，加入100μL標準品的包被管的免疫分析主要指標最大結合S0%，曲線的抑制都很好，并且各管的放射性計數(shù)也比較高，各種因素對測量的影響也相對較小。當加入50μL標準品時，標準曲線出現(xiàn)倒勾現(xiàn)象，曲線的最低濃度點B/B0%為101%，出現(xiàn)這種情況就是因為標準曲線的各包被管中加入 的非標記抗原的量不夠造成的。所以通過對數(shù)據(jù)的比較，選擇比較合適的加樣量為標記物加100μL，標準品加100μL。

4.5 血管緊張素Ⅰ放射免疫分析（固相法）標準曲線

血管緊張素Ⅰ放射免疫分析（固相法）標準曲線示于圖1。

4.6 方法學鑒定

（1）靈敏度。以20個零標準管計數(shù)的平均值-2S對應的劑量值表示，靈敏度為（42.2Pg /ml）pg/ml。

（2）準確度。已知量的一份血漿樣品中分別加入4種不同劑量的標準品進行測定，結果列于表5。由表5可知本法回收率為90.3%—102.2%，說明本法準確性較好。

（3）精密度。采用本方法對3份含有不同濃度的人血漿樣品重復測定，計算批內、批間變異系數(shù)，結果列于表6。由表6可知，批內變異系數(shù)為（5.1%—9.0%）；批間變異系數(shù)為（8.3%—9.5%）。

（4）健全性（同質性）。將一份較高濃度的血漿樣品倍比稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，測定結果列于表7。由表中數(shù)據(jù)計算其相關方程為：y=1.000 x +0.4673，r=1.000

實驗結果表明研制的血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法（固相抗體法）的健全性良好。

5 結語

（1）采用固相抗體包被聚苯乙烯試管的包被條件為：選擇抗體滴度為1：9萬，2—8℃過夜（15—24h）。在此條件下所得包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，可達到最大結合。

（2）用該包被管進行血管緊張素Ⅰ放射免疫分析時，其靈敏度為（42.2Pg /ml）；回收率為（90.3%—102.2%）；批內、批間變異系數(shù)分別為（5.1%—90%）和（8.3%—10.2%）。

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