雷帕霉素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

尹菲菲，劉衛(wèi)紅，李冬梅，梅繁勃

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雷帕霉素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

尹菲菲，劉衛(wèi)紅，李冬梅，梅繁勃

中國武警總醫(yī)院(北京 100039)

摘要：目的探討雷帕霉素(RPM)對(duì)心肌缺血再灌注(MI/R)損傷的保護(hù)作用。方法采用結(jié)扎左冠脈前降支30 min再灌注120 min的方法復(fù)制MI/R損傷大鼠模型，分為假手術(shù)組、模型組、RPM組(5 mg/kg)，于術(shù)前3 d開始灌胃給藥。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)取血清，測定肌酸激酶(CK)活性、乳酸脫氫酶(LDH)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；取心臟，氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色后測定心肌梗死面積。結(jié)果RPM可明顯縮小MI/R損傷大鼠的心肌梗死面積，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RPM可顯著降低血清CK和LDH活性，與模型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，RPM組血清SOD活性顯著升高，血清MDA含量則明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論RPM預(yù)處理可抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，有效改善MI/R心肌的氧自由基損傷。

關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注損傷；雷帕霉素；肌酸激酶；乳酸脫氫酶；超氧化物歧化酶；丙二醛

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion， MI/R)損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其損傷程度可決定缺血性心臟病的治療和預(yù)后[1]，目前對(duì)于MI/R損傷的防治尚無突破性研究進(jìn)展。雷帕霉素(rapamycin， RPM)是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，臨床上常用于自身免疫性疾病和器官移植后排斥反應(yīng)的治療[2]。近年研究證實(shí)，RPM對(duì)缺血再灌注動(dòng)物的肝、腎、腦等器官損傷具有一定的保護(hù)效應(yīng)[3-5]。本研究應(yīng)用MI/R損傷大鼠模型，探討RPM的心肌保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雌雄各半，體重200 g± 20 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003。

1.2藥品和試劑RPM購自Sigma公司，用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成所需濃度。氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride， NBT)、肌酸激酶(creatine kinase， CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase， LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde， MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1建立MI/R損傷模型采用冠脈結(jié)扎法建立MI/R損傷模型[6]。取大鼠，術(shù)前12 h禁食不禁水，戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定，四肢連接ECG-1350P型十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)。頸部分離氣管，插入氣管插管，連接DW-3000型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(呼吸頻率60次/min，潮氣量2 mL/100 g)。順肋間隙方向于胸骨左旁第3、4肋間開胸，分別在第3、4肋上環(huán)繞1根0號(hào)手術(shù)線，牽拉手術(shù)線使肋骨撐開，暴露心臟，沿左心耳下緣冠脈前降支起始部3 mm～4 mm處用4-0帶線縫合針穿過，進(jìn)針深度控制在0.1 cm左右，將一小段直徑1.5 mm的乳膠管置于結(jié)扎線下，收緊結(jié)扎線以造成心肌缺血，約30 min后(冠脈結(jié)扎成功的標(biāo)志：心電圖ST段明顯抬高或T波高聳)，松開結(jié)扎線再灌注120 min(再灌注成功的標(biāo)志：抬高的ST段下降50%以上或高聳的T波下降)。結(jié)扎前心電圖不正常者，未到觀察終點(diǎn)而死亡者及造模不成功者剔除。

1.3.2分組與給藥方法將成模大鼠隨機(jī)分為模型組和RPM組，每組10只。另取10只大鼠，開胸但不結(jié)扎冠脈，作為假手術(shù)組。各組于術(shù)前3 d開始灌胃給藥，每天1次，RPM組劑量按5 mg/kg，假手術(shù)組和模型組給予等體積0.5% CMC-Na。

1.3.3血清指標(biāo)的測定再灌注結(jié)束后，各組動(dòng)物由股動(dòng)脈采血，3 500 r/min離心10 min得血清，采用比色法測定CK活力和LDH活性，羥胺法測定SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4心肌梗死面積測定取血后處死大鼠，迅速摘取心臟，用PBS緩沖液沖洗干凈，濾紙拭干，去除心房、血管及脂肪組織，在冠脈結(jié)扎線下，從心尖起將心室平行切成厚度相等的5片，放入0.1% NBT溶液中，37 ℃染色15 min。梗死心肌呈灰白色，正常心肌則呈藍(lán)色，用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行圖像采集，導(dǎo)入電腦，通過圖像分析軟件ImagePro Plus 7.0測算梗死區(qū)面積和心室總面積，計(jì)算心肌梗死面積(%)[7]。

2結(jié)果

2.13組心肌梗死面積比較模型組大鼠心肌梗死面積31.65%，RPM可使心肌梗死面積縮小至26.00%，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　3組心肌梗死面積比較(±s)

2.23組血清CK活力和LDH活性比較心肌缺血30 min再灌注120 min后，模型組大鼠血清CK活力和LDH活性比假手術(shù)組明顯升高，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；RPM組可顯著降低血清CK活力和LDH活性，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2　3組血清CK活力和LDH活性比較(±s)

2.33組血清SOD活性和MDA含量比較心肌缺血30 min再灌注120 min后，模型組大鼠血清SOD活性比假手術(shù)組顯著降低，MDA含量則比假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)。RPM組血清SOD活性顯著升高，而MDA含量顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表3。

表3　3組血清SOD活性和MDA含量比較(±s)

3討論

藥物預(yù)處理可通過促使機(jī)體釋放生物活性物質(zhì)或直接激活保護(hù)機(jī)制而增強(qiáng)心臟對(duì)缺血、缺氧的耐受，實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血再灌注所致心肌損傷的保護(hù)作用[8]。本研究采用缺血前給藥的方式觀察RPM預(yù)處理對(duì)MI/R損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示RPM能顯著縮小心肌梗死面積，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。MI/R發(fā)生時(shí)心肌酶如CK、LDH等的釋放量增加，其釋放入血的多少被認(rèn)為與心肌壞死程度呈正相關(guān)[9]，因此，測定血清心肌酶活性可作為MI/R損傷程度的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究結(jié)果表明：RPM預(yù)處理可顯著抑制血清CK活力和LDH活性(P<0.05或P< 0.01)，進(jìn)一步說明RPM的心肌保護(hù)作用。

MI/R時(shí)經(jīng)由各種途徑生成大量的氧自由基，堆積的氧自由基使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致生物膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞、功能受損，使離子轉(zhuǎn)運(yùn)、生物能的產(chǎn)生和細(xì)胞器的功能發(fā)生一系列病理生理改變，從而加劇缺血心肌的組織損傷及功能障礙[10-11]。MDA作為氧自由基與生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量變化反映了機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反映心肌損傷的程度。SOD是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶-超氧自由基清除劑，其活性高低代表了組織清除自由基的能力，研究證實(shí)外源性SOD對(duì)動(dòng)物MI/R損傷有保護(hù)作用[12]。本研究觀察RPM對(duì)MI/R損傷大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響，結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組血清SOD活性降低、MDA含量升高，進(jìn)一步證實(shí)自由基與MI/R損傷密切相關(guān)；RPM能減少機(jī)體MDA的生成、保護(hù)SOD的活性，提示RPM預(yù)處理可抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增加氧自由基清除能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)MI/R心肌損傷的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jennings RB.Historical perspective on the pathology of myocardial ischemia/reperfusion injury [J].Circ Res，2013，113(4)：428-438.

[2] Li J，Kim SG，Blenis J.Rapamycin： one drug， many effects [J].Cell Metab， 2014，19(3)：373-379.

[3]廖蘇才，劉東．雷帕霉素對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的影響[J]．國際外科學(xué)雜志，2010，37(5)：326-328．

[4]王麗君，吳登艷，胡安春，等．雷帕霉素對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)效應(yīng)的研究[J]．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，37(2)：118-120．

[5]陳廣順，司中洲，李杰群，等．雷帕霉素對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014，35(1)：85-88．

[6]劉新義，李健和，向大雄，等．聚乙二醇化葛根素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]．中草藥，2013，44(3)：327-330．

[7]楊建業(yè)，張迎春，唐俊明，等．大鼠心肌缺血再灌注后心功能變化與心肌梗死面積的相關(guān)性分析[J]．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2008，28(1)：4-9．

[8]張寶紅．藥物預(yù)處理與缺血預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D]．太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2003．

[9]Quan W，Yin Y，Xi M，et al.Antioxidant properties of magnesium lithospermate B contribute to the cardioprotection against myocardial ischemia/reperfusion injury in vivo and in vitro [J].J Tradit Chin Med，2013，33(1)：85-91.

[10]Vajdovich P.Free radicals and antioxidants in inflammatory processes and ischemia-reperfusion injury [J].Vet Clin North Am Small Anim Pract，2008， 38(1)：31-123.

[11]Eto M，Kajihara N，Morita S，et al.A novel electron paramagnetic resonance spin-probe technique demonstrates the relation between the production of hydroxyl radicals and ischemia-reperfusion injury [J].Eur J Cardiothorac Surg， 2011，39(4)：465-470.

[12]Seshadri G，Sy JC，Brown M，et al.The delivery of superoxide dismutase encapsulated in polyketal microparticles to rat myocardium and protection from myocardial ischemia-reperfusion injury [J].Biomaterials，2010，31(6)：1372-1379.

(本文編輯薛妮)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(No.81102870)

通訊作者：梅繁勃，E-mail：meifanbo@126.com

中圖分類號(hào)：R542.2R256.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．12．009

文章編號(hào)：1672-1349(2016)12-1337-03

Corresponding Author：Mei Fanbo

(收稿日期：2015-10-30)

The Influence on Rapamycin Management Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury in Rats

Yin Feifei，Liu Weihong，Li Dongmei，Mei Fanbo

General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects of rapamycin (RPM) on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury in rats.MethodsRat model of MI/R injury was prepared by coronary artery ligation for 30 min followed by 120 min reperfusion.Then rats were divided into 3 groups at random (n=10)，namely sham，model，RPM group (5 mg/kg).RPM was administered by intragastric gavage once a day for 3 days pre-operation.The creatine phosphokinase (CK)，lactate dehydrogenase (LDH)and superoxide dismutase (SOD)activities，and the contents of malondialdehyde (MDA)in sera were examined， and the area of myocardial infarction was calculated after the reperfusion.ResultsRPM significantly reduced the area of myocardial infarction， compared to that of model group (P<0.05).The CK and LDH activities in RPM group were significantly lower than those of model group (P<0.05 or P<0.01).RPM evidently elevated the SOD activity (P<0.01)， and reduced the MDA contents in sera (P<0.01).Conclusion The effectiveness of RPM pretreatment in MI/R injury appears to be associated with the inhibition of lipid peroxidation.

Key words：rapamycin;myocardial ischemia/reperfusion injury；creatine phosphokinase；lactate dehydrogenase；superoxide dismutase；malondialdehyde