超高效液相色譜－四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法對(duì)酒中氨基甲酸乙酯確認(rèn)分析的研究

王成龍，黃秋婷，戚　平（廣州市食品檢驗(yàn)所（廣州市酒類檢測(cè)中心），廣東廣州 510410）

超高效液相色譜－四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法對(duì)酒中氨基甲酸乙酯確認(rèn)分析的研究

王成龍，黃秋婷，戚平
（廣州市食品檢驗(yàn)所（廣州市酒類檢測(cè)中心），廣東廣州 510410）

摘要：建立了Q Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)測(cè)定氨基甲酸乙酯（EC）的方法。各類酒樣根據(jù)其基質(zhì)差別，稀釋相對(duì)應(yīng)倍數(shù)，過(guò)0.22 μm濾膜后，直接用高分辨質(zhì)譜Q Exactive采集數(shù)據(jù)。以Poroshell 120 EC-C18色譜柱為分析柱，乙腈和0.1%（v/v）乙酸水為流動(dòng)相，柱溫25℃，采用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）模式，提取目標(biāo)化合物及其二級(jí)子離子的精確質(zhì)量數(shù)定性定量。結(jié)果表明，方法在1～20 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)大于0.995），儀器檢出限（LOD）可達(dá)到0.05 μg/L，滿足各類酒樣中氨基甲酸乙酯的檢測(cè)要求。通過(guò)加標(biāo)驗(yàn)證，回收率范圍為92.3%～107.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～2.5%。實(shí)際樣品驗(yàn)證，除啤酒外，其他類型酒樣均檢出了一定量的EC。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、高效，可作為快檢和確證檢測(cè)技術(shù)廣泛使用。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜； 靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜； 氨基甲酸乙酯； 方法確證

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是食品在發(fā)酵和貯存過(guò)程中產(chǎn)生的化學(xué)污染物［1］，主要存在于酒精飲品（如黃酒、葡萄酒、烈酒等）、面包、醬油、奶酪等發(fā)酵制品中。早在1943年，Nettleship等［2］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了EC具有致癌作用。有研究表明，乙醇對(duì)氨基甲酸乙酯的致癌性有促進(jìn)作用［3-4］。

我國(guó)是酒文化深厚的飲酒大國(guó)，日常烹飪對(duì)黃酒、料酒的需求量較大，此外還會(huì)大量消費(fèi)酒精飲品佐餐。因此，研究快速準(zhǔn)確分析酒中EC含量的檢測(cè)方法監(jiān)控我國(guó)酒精飲品中EC的含量，顯得尤為重要。

目前，我國(guó)對(duì)于飲料酒中氨基甲酸乙酯的測(cè)定，主要采用氣相色譜法［5］以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［6-7］，這兩種方法均需采用固相萃?。?-8］、液液萃?。?］等樣品凈化技術(shù)，使得前處理過(guò)程復(fù)雜繁瑣，有機(jī)溶劑用量較大，污染環(huán)境。近年來(lái)，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［10-12］檢測(cè)EC，但鑒于EC的相對(duì)分子質(zhì)量較小，電離后只能選出1個(gè)特征子離子作為定性和定量離子［11-12］，易受干擾，不滿足歐盟關(guān)于食品或水中化合物方法鑒定點(diǎn)的要求［13］。且串聯(lián)質(zhì)譜分辨率較低，仍需通過(guò)昂貴的內(nèi)標(biāo)化合物EC-D5來(lái)克服基質(zhì)干擾問(wèn)題［12］。

本實(shí)驗(yàn)采用Q Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）模式：通過(guò)四級(jí)桿濾過(guò)EC化合物，碎裂后對(duì)高分辨的二級(jí)子離子專屬定量。該方法用提取到一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)定性定量，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且滿足方法確證中關(guān)于鑒定點(diǎn)的要求［13］。樣品經(jīng)過(guò)稀釋直接進(jìn)樣分析，高效簡(jiǎn)便。實(shí)驗(yàn)探索出不同類型酒進(jìn)樣的最佳稀釋比例，在克服基質(zhì)離子抑制效應(yīng)的同時(shí)，達(dá)到較高的方法檢出能力。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

酒樣：市售。

儀器設(shè)備：高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive（美國(guó)ThermoFisher公司）；Ulti-Mate 3000超高效液相色譜儀（美國(guó)ThermoFisher公司）；2600TH超聲波清洗器（上海安譜儀器公司）；Synergy超純水機(jī)系統(tǒng)（法國(guó)millipore公司）；0.22 μm水相濾膜（上海安譜儀器公司）。

試劑：氨基甲酸乙酯（EC）（純度99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)（EC-D5）（純度98%，加拿大Toronto research chemicals公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)ThermoFisher公司）；冰乙酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.1 mg）EC和EC-D5 于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100 mL，分別配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。根據(jù)使用狀況用去離子水逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3樣品前處理方法

將酒樣搖勻（氣泡酒、啤酒需先劇烈振蕩脫氣），用分析天平稱取1 g（精確至0.1 mg）酒樣至適當(dāng)規(guī)格的容量瓶（規(guī)格由稀釋體積決定），加入去離子水，超聲混勻，定容至刻度，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾后，上機(jī)測(cè)定。

不同基質(zhì)類酒需經(jīng)水稀釋以排除基質(zhì)效應(yīng)干擾。以1 g酒樣為基準(zhǔn)，排除基質(zhì)效應(yīng)干擾所需的最低稀釋體積：白蘭地、威士忌、白酒5 mL，配制酒、紅酒、啤酒10 mL，黃酒25 mL。

1.4儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（3.0×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%乙酸水（v/v），B為乙腈，等度洗脫（95%A+5%B，體積比）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：10 μL；分析時(shí)間：7 min。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源溫度：350℃；傳輸金屬毛細(xì)管溫度：320℃；噴霧電壓：3000 V（正離子模式）；掃描范圍：m/z 50～750；一級(jí)質(zhì)譜全掃描分辨率（R）：7000；C-trap最大容量（AGC target）：1×106；C-trap最大注入時(shí)間：50 ms；平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)二級(jí)子離子全掃描（PRM）分辨率（R）：17500；階躍式碰撞能（stepped NCE）：35%±15%；二級(jí)C-trap最大容量：2×105；二級(jí)C-trap注入時(shí)間：100 ms；化合物分子量較少，選取一個(gè)特征子離子作為定性和定量離子，其精確質(zhì)量數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1　EC和EC-D5的分子式、精確質(zhì)量數(shù)及保留時(shí)間

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

酒類樣品基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單，利用高分辨質(zhì)譜的高選擇性和高靈敏性特點(diǎn)可直接進(jìn)樣分析，但樣品基質(zhì)會(huì)對(duì)電噴霧離子化產(chǎn)生抑制效應(yīng)，造成定量結(jié)果偏離。高倍稀釋樣品雖然可減輕基質(zhì)效應(yīng)，但同時(shí)降低方法的檢出能力。而應(yīng)用EC-D5內(nèi)標(biāo)校正又會(huì)使方法經(jīng)濟(jì)成本過(guò)高。綜上考慮，選取各類基質(zhì)酒樣能排除基質(zhì)干擾的最小稀釋倍數(shù)后，以去離子水定容，以此兼顧結(jié)果的準(zhǔn)確性及方法檢出限。

以逐級(jí)稀釋的各類酒樣基質(zhì)為定容溶劑，與同比例下，去離子水稀釋的該目標(biāo)化合物峰面積相比較，得出面積百分比比值。由于酒樣有EC本底值，故以EC的內(nèi)標(biāo)化合物來(lái)進(jìn)行峰面積比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件優(yōu)化

圖1　典型酒樣的稀釋比例對(duì)目標(biāo)物峰面積的影響

圖2　EC和EC-D5于PRM模式下色譜圖

2.2.1.1流動(dòng)相的選取考慮

氨基甲酸乙酯為一種有機(jī)堿，在正離子模式下，流動(dòng)相呈酸性時(shí)，可提高其離子化效率和靈敏度，同時(shí)改善出峰峰形［14］。本實(shí)驗(yàn)分別考察（10 mM）乙酸銨緩沖液、0.1%（v/v）乙酸水、0.1%（v/v）甲酸水作流動(dòng)相下EC的出峰。結(jié)果表明，乙酸銨緩沖液用作流動(dòng)相時(shí)出峰拖尾嚴(yán)重，而當(dāng)流動(dòng)相為0.1%乙酸水，EC的峰面積又比甲酸水時(shí)提高了50%。鑒于EC化合物極性強(qiáng)，最終采用0.1%乙酸水-乙腈（95+5）混合溶劑作為流動(dòng)相。

2.2.1.2色譜分析柱的選擇

在0.1%乙酸水-乙腈流動(dòng)相體系下考察了SHIMPACK XR-ODS（3.0×75 mm，2.2 μm）、KINETEX C18（2.1× 100 mm，2.6 μm）以及Poroshell 120 EC-C18（3.0×100 mm，2.7 μm）對(duì)EC的分離效果，發(fā)現(xiàn)只有Poroshell 120對(duì)EC有一定程度的保留，故本實(shí)驗(yàn)選擇該色譜柱用于分析。

2.2.1.3柱溫條件的控制

EC化合物的保留時(shí)間受柱溫影響嚴(yán)重。隨著柱溫的提升，保留時(shí)間大幅減小。40℃的柱溫條件下，1.7 min出峰，當(dāng)降低到30℃時(shí)，保留時(shí)間為3.0 min。為避免目標(biāo)物過(guò)早出峰被樣品中的強(qiáng)極性雜質(zhì)干擾，實(shí)驗(yàn)柱溫嚴(yán)格設(shè)定為25℃，使EC穩(wěn)定于4.35 min出峰。

EC及EC-D5標(biāo)準(zhǔn)化合物平行反應(yīng)檢測(cè)（PRM）模式下色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化

EC的準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+（m/z 90.05496），目標(biāo)物相對(duì)分子質(zhì)量較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，得到1個(gè)較明顯的特征碎片離子（m/z 62.02379），其作為定性及定量離子。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)質(zhì)量差，可以初步斷定該碎片離子由α-裂解，發(fā)生麥?zhǔn)现嘏欧磻?yīng)，丟失C2H4基團(tuán)產(chǎn)生的，與Park等報(bào)道結(jié)果一致［15］。如采用普通低分辨質(zhì)譜鑒定該方法時(shí)，一個(gè)母離子加一個(gè)子離子總鑒定數(shù)只有2.5，不符合歐盟委員會(huì)決議［13］關(guān)于食品或水中化合物方法確證鑒定點(diǎn)數(shù)≥3的基本要求，相比之下高分辨質(zhì)譜鑒定點(diǎn)數(shù)則達(dá)到了4.5。

采取PRM平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式實(shí)現(xiàn)高通量的結(jié)果分析。與普通全掃描模式相比，PRM在定量分析上有更好的重現(xiàn)性。此外，對(duì)于EC這類小分子化合物，碰撞能設(shè)為階躍式，即在35%能量基礎(chǔ)上加減15%，即有3個(gè)碰撞能量對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行碰撞，最終加和獲得二級(jí)譜圖，其更利于方法的定性確認(rèn)。

2.3方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1線性范圍、檢出限和定量限

將目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用去離子水稀釋，分別配制成EC含量為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.4節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算峰面積，用最小二乘法進(jìn)行回歸分析，得到在1～20 μg/L線性范圍內(nèi)EC的線性回歸方程為y=-45008.9+ 112311x（y：EC峰面積，x：EC濃度）（r2=0.9993）；以信噪比為3確定檢出限（LOD值）為0.05μg/L，以信噪比為10確定定量限（LOQ值）為0.17 μg/L。

2.3.2精密度和回收率

不同基質(zhì)類酒分別選取一個(gè)典型酒樣添加EC，低濃度水平加標(biāo)選擇10 μg/kg，高濃度水平選擇200 μg/kg，以上2個(gè)濃度水平按1.3節(jié)和1.4節(jié)所述實(shí)驗(yàn)步驟和條件進(jìn)行處理測(cè)定，重復(fù)6次，計(jì)算方法回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)從市場(chǎng)上購(gòu)買的6種不同基質(zhì)類型的酒樣進(jìn)行了檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，除啤酒外，其他酒樣均檢出了一定量的EC。結(jié)果見(jiàn)表3。

3　結(jié)論

建立了Q Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)測(cè)定EC的方法，具有前處理步驟簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。Q Exactive平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式同時(shí)篩取母離子以及碎裂后子離子的精確質(zhì)量數(shù)，與國(guó)標(biāo)［16］相比，低檢出限、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)大幅提升了方法的檢出能力，同時(shí)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定小分子化合物易出現(xiàn)假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。

對(duì)于精確質(zhì)量數(shù)，母離子的鑒定點(diǎn)是2，二級(jí)質(zhì)譜分析，其總鑒定點(diǎn)可達(dá)4.5，可以對(duì)化合物進(jìn)行確證分析［13］。本文中的EC測(cè)定方法可作為快檢和確證檢測(cè)技術(shù)廣泛使用。

表2　典型酒樣中EC的測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及加標(biāo)回收率（n=6）

表3　市售酒中EC的檢測(cè)結(jié)果（n=6）

參考文獻(xiàn)：

［1］Ough C S.Ethyl carbamate in fermented beverages and foods. I.Naturally occurring ethyl carbamate［J］.JAgric Food Chem，1976，24（2）：323-328.

［2］NettleshipA，Henshaw P S，Meyer H L.Induction of pulmonary tumors in mice with ethyl carbamate（urethane）［J］.J Natl Cancer Inst，1943，4（3）：309-319.

［3］Sakano K，Oikawa S，Hiraku Y，et al.Metabolism of carcinogenic urethane to nitric oxide is involved in oxidative DNAdamage［J］.Free Radical Biology and Medicine，2002，33 （5）：703-714.

［4］Miller Y E，Dwyer-Nield L D，Keith R L，et al.Induction of a high incidence of lung tumors in C57BL/6 mice with multiple ethyl carbamate injection［J］.Cancer Letters，2003，198（2）：139-144.

［5］牛棟平，陶寧萍，李學(xué)惠.固相萃取-氣相色譜法測(cè)定葡萄酒中的氨基甲酸乙酯［J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，17（5）：616-619.

［6］Lim H S，Lee K G.Development and validation of analytical methods for ethyl carbamate in various fermented foods［J］. Food Chemistry，2011，126：1373-1379.

［7］徐小民，何華麗，阮瑜迪，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃酒和醬油中氨基甲酸乙酯［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2013，4（3）：705-709.

［8］Ubeda C，Balsera C，TroncosoAM，et al.Validation of an analytical method for the determination of ethyl carbamate in vinegars［J］.Talanta，2012，89：178-182.

［9］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.出口酒類中氨基甲酸乙酯殘留量檢測(cè)方法氣相色譜-質(zhì)譜法：SN 0285—2012［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

［10］朱懷遠(yuǎn)，莊亞?wèn)|，劉獻(xiàn)軍，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中的氨基甲酸乙酯［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32（8）：963-967.

［11］Alberts P，Stander MA，De VilliersA.Development of a novel solid-phase extraction，LC-MS/MS method for the analysis of ethyl carbamate in alcoholic beverages: application to SouthAfrican wine and spirits［J］.FoodAddit Contam:PartA，2011，28（7）：826-839.

［12］王麗娟，柯潤(rùn)輝，王冰，等.超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法直接測(cè)定黃酒和葡萄酒中氨基甲酸乙酯［J］.色譜，2012，30：903-907.

［13］European Communities.Commission Decision 2002/657/EC of 12August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results［J］.Official Journal of the European Communities L 221.

［14］孫萍，梁瓊麟，羅國(guó)安.基質(zhì)影響電噴霧離子化效率的研究［J］.分析試驗(yàn)室，2005，24（5）：71-76.

［15］Park S K，Kim C T，Lee J W，et al.Analysis of ethyl carbamate in Korean soy sauce using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection or tandem mass spectrometry and gas chromatography with mass spectrometry ［J］.Food Control，2007，18：975-982.

［16］國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定：GB 5009.223—2014［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015.

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1428.012.html。

中圖分類號(hào)：TS261.7；TS262.3；O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）07-0112-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016059

基金項(xiàng)目：廣州市民生科技重大專項(xiàng)“酒中致癌物氨基甲酸乙酯快速檢測(cè)及試劑盒研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用”項(xiàng)目（201300000079）。

收稿日期：2016-02-26

作者簡(jiǎn)介：王成龍（1991-），男，助理工程師，工科學(xué)士，主要研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)，E-mail：403627757@qq.com。

通訊作者：戚平（1981-），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)，E-mail：gzsp2000@163.com。

Determination and Identification of Ethyl Carbamate in Alcoholic Drinks by UPLC-Quadrupole/Electrostatic Field Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometry

WANG Chenglong，HUANG Qiuting and QI Ping
（Guangzhou Food Inspection Institute，GuangzhouAlcoholic Drinks Inspection Center，Guangzhou，Guangdong 510410，China）

Abstract：A new method for the direct determination of ethyl carbamate in alcoholic drinks by UPLC-Quadrupole/Orbitrap high-resolution MS had been developed.Various alcoholic drinks were diluted properly according to their matrices with distilled water.After the filtration through 0.22 μm microporous membrane，ethyl carbamate was analyzed by high-resolusion mass spectrometry in positive mode.Chromatographic analysis was carried out using a poroshell EC-C18 column with acetonitrile and 0.1%（v/v）acetic acid aqueous solution as the mobile phase.In addition，the column temperature was set at 25℃.Ethyl carbamate was determined in the mode of parallel reaction monitoring（RPM）.Accurate mass-to-charge ratio extraction of the target compound ion and its fragmentation ion were utilized to further improve the accuracy of qualitative and quantitative analysis.The calibration curve showed good linearity in the range of 1～20 μg/L with the correlation coefficient over 0.995. The limit of detection（LOD）reached up to 0.05 μg/L.The recoveries of ethyl carbamate was in the range of 92.3%～107.7%.The relative standard deviations（RSD）was 0.6%～2.5%.The application indicated that almost all the alcoholic samples contained EC more or less except beer.The proposed method was easy，fast，sensitive and suitable for the determination and confirmation of ethyl carbamate in different kinds of alcoholic drinks.

Key words:ultra performance liquid chromatography（UPLC）；electrostatic field orbit trap mass spectrometry；ethyl carbamate；identification method