正交法優(yōu)化醬香型大曲類黑素提取工藝

徐　延，蔣英麗，程　偉，李維捷，孟資寬，高　鴻，羅愛(ài)民（.四川大學(xué)食品工程系，四川成都60064； .四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺6800）

正交法優(yōu)化醬香型大曲類黑素提取工藝

徐延1，蔣英麗2，程偉2，李維捷1，孟資寬1，高鴻1，羅愛(ài)民1
（1.四川大學(xué)食品工程系，四川成都610064； 2.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺618200）

摘要：為了優(yōu)化提取醬香型大曲類黑素的工藝條件，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，以醬香型大曲為提取原料，以乙醇溶液為提取溶劑，以類黑素濃度為考察指標(biāo)，研究了提取濃度、提取溫度、液固比和提取時(shí)間等單因素對(duì)提取效果的影響。結(jié)果表明，提取濃度、提取溫度、液固比和提取時(shí)間對(duì)類黑素終濃度的影響均達(dá)到顯著水平，其影響程度為液固比＞提取濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度。確定醬香型大曲類黑素最佳提取條件為：提取溫度70℃，提取濃度

40%，提取時(shí)間3 h，液固比17.5∶1?？勺鳛樯钊胙芯酷u香型大曲的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大曲； 類黑素； 正交實(shí)驗(yàn)； 提取工藝

醬香型白酒是中國(guó)白酒的五大香型之一［1］，具有醬香突出、酒體醇厚、幽雅細(xì)膩、回味悠長(zhǎng)的風(fēng)格特點(diǎn)［2-4］，它獨(dú)特的香型與其獨(dú)特的釀造工藝有著密不可分的關(guān)系，其典型代表是貴州茅臺(tái)酒和四川郎酒。醬香型白酒的特殊工藝之一是高溫制曲［5］，因?yàn)獒劸粕a(chǎn)中用曲量大，幾乎與制酒原料高粱比為1∶1，曲的質(zhì)量在一定程度上決定了酒質(zhì)的優(yōu)劣，故有“曲乃酒之骨”“好曲出好酒”的說(shuō)法［6］。影響醬香型大曲質(zhì)量的因素有很多，但主要在于制曲溫度的高低［7］。在高溫培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)生美拉德（Maillard）反應(yīng)，由于制曲溫度的不同，形成了3種不同顏色和風(fēng)格的高溫大曲：黑塊曲、白塊曲和黃塊曲。黑塊曲醬香突出并帶有焦香，但糖化力低；白塊曲糖化力較高但醬香味不足；黃塊曲則各項(xiàng)指標(biāo)較為適宜［8-9］。在生產(chǎn)中，黑塊曲若用量少，則可使酒有愉快的焦香；若用量大，則成品酒糊苦味重，以致造成“焦蓋醬”的后果，影響酒的風(fēng)格和質(zhì)量。因此各種風(fēng)格的酒曲的配比對(duì)生產(chǎn)高質(zhì)量的酒尤為關(guān)鍵。而實(shí)際應(yīng)用中，制曲工人僅憑顏色來(lái)對(duì)曲塊進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)配比，而曲的顏色是漸進(jìn)變化的，單純的將曲分為黑、白、黃3類進(jìn)行配比的方法較為粗獷。因此，為了實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)用曲的精確配比，找到一種表征曲塊質(zhì)量的指標(biāo)尤為重要，而類黑素是美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物，呈黑褐色，類黑素含量越高，顏色越深［10］。因此，可用曲塊中類黑素含量來(lái)表征曲塊顏色的深淺，進(jìn)而來(lái)判斷曲藥的質(zhì)量。本研究利用單因素及正交實(shí)驗(yàn)，確定了醬香型大曲類黑素的最優(yōu)提取工藝，為進(jìn)一步對(duì)大曲質(zhì)量分級(jí)奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醬香型大曲：采用四川省古藺郎酒廠熟練工人挑選的顏色一致，斷面顏色均一，發(fā)酵良好的生產(chǎn)用成品曲。成品曲打碎后再粉碎過(guò)60目篩，取篩下部分烘干至恒重裝入密封袋備用。無(wú)水乙醇（分析純，成都科龍化工試劑廠），實(shí)驗(yàn)用水為四川大學(xué)試劑科提供。

1.2儀器與設(shè)備

FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JA1203上皿電子天平，上海精科天平；TDL-4013低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SpectraMax 190酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1提取工藝流程

大曲粉→稱重→在一定溫度一定液固比下浸提→離心取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→定容→吸光度測(cè)定

1.3.2類黑素含量測(cè)定

將1.3.1中類黑素提取物用蒸餾水定容于50 mL的容量瓶中，以對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作空白液，在470 nm處測(cè)定其吸光度，用下面的公式計(jì)算類黑素濃度［11-12］。

C=A/eb

式中：C——類黑素的含量（mmol/L）；

A——樣液的吸光度（470 nm）；

e——類黑素的摩爾消光系數(shù)0.64 L/mmol·cm；

b——比色皿厚度（cm）。

1.4單因素實(shí)驗(yàn)

按1.3.1節(jié)的提取工藝流程，在其他條件相同的情況下，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究不同乙醇溶液濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%），不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃），不同提取時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h），不同液固比（7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1）（mL/g）對(duì)類黑素濃度的影響，用以確定正交實(shí)驗(yàn)的因素水平。

1.5正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取時(shí)間、液固比、提取溫度作為影響因素，進(jìn)行4因素3水平L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定類黑素的最佳提取工藝，因素水平編碼表見(jiàn)表1。

1.6數(shù)據(jù)處理

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)表示，利用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1提取溫度對(duì)類黑素濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別加入等體積的濃度為60%的乙醇水溶液50 mL，分別在30℃、40℃、50℃、60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，3 h后，離心取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進(jìn)行定容，于470 nm處測(cè)吸光度，考察不同提取溫度對(duì)類黑素濃度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　不同提取溫度對(duì)類黑素濃度的影響

由圖1可以看出，隨著提取溫度的上升，類黑素濃度逐漸上升。用SPSS軟件進(jìn)行單因素分析，用Duncan法進(jìn)行兩兩比較，取α=0.05時(shí)，sig＜0.01，組間差異極顯著，提取溫度對(duì)類黑素濃度的影響極顯著。20℃、30℃、40℃、50℃、60℃間差異顯著，各成一類子集。最終選擇60℃作為提取溫度的中間水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2乙醇濃度對(duì)類黑素終濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別加入等體積的濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液50 mL，在60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，3 h后，離心取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進(jìn)行定容，測(cè)定在470 nm處吸光度，考察不同乙醇濃度溶液對(duì)類黑素濃度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，類黑素濃度先上升后下降，當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。用SPSS軟件進(jìn)行單因素分析，用Duncan法進(jìn)行兩兩比較，取α=0.05時(shí)，sig＜0.01，組間差異極顯著，乙醇濃度對(duì)類黑素濃度的影響極顯著。50%、60%差異顯著，各成一類子集；30%、40%間差異不顯著，歸為同類子集；70%、80%間差異不顯著，歸為同類子集。最終選擇30%作為乙醇溶液濃度因素的中間水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.3提取時(shí)間對(duì)類黑素濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別加入等體積的濃度為60%的乙醇水溶液50 mL，在60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，分別在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后離心，取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進(jìn)行定容，測(cè)定在470 nm處吸光度，考察不同提取溫度對(duì)類黑素濃度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2　不同乙醇濃度對(duì)類黑素濃度的影響

圖3　不同提取時(shí)間對(duì)類黑素濃度的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，類黑素濃度逐漸升高至基本保持不變，提取時(shí)間為3 h時(shí)達(dá)到最高。3 h后基本保持不變，說(shuō)明在提取3 h后，類黑素基本溶出完全。用SPSS軟件進(jìn)行單因素分析，用Duncan法進(jìn)行兩兩比較，取α=0.05時(shí)，sig＜0.01，組間差異極顯著，提取時(shí)間對(duì)類黑素濃度的影響極顯著。1 h和2 h和3 h和4 h、5 h間差異顯著，各成一類子集，其中4 h、5 h間差異不顯著，歸屬同類子集。最終選擇3 h作為提取時(shí)間因素的中間水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.4液固比對(duì)類黑素濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別按液固比為7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1（mL/g）加入相應(yīng)體積的濃度為60%的乙醇水溶液，在60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，3 h后，離心取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進(jìn)行定容，測(cè)定在470 nm處吸光度，考察不同液固比對(duì)類黑素濃度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　不同液固比對(duì)類黑素濃度的影響

由圖4可知，隨著單位質(zhì)量提取溶液體積增加，類黑素濃度先升高再下降，在液固比為15∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最高。用SPSS進(jìn)行單因素分析，用Duncan法進(jìn)行兩兩比較，取α=0.05時(shí)，sig＜0.01，組間差異極顯著，表明液固比對(duì)類黑素濃度的影響極顯著。7.5∶1和10∶1和12.5∶1、15∶1和17.5∶1和20∶1（mL/g）間差異顯著，各成一類子集。最終選擇15∶1（mL/g）作為液固比因素中間水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化

按1.6節(jié)方案進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

由表2可知，在影響類黑素濃度的提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比這4個(gè)因素中，影響大小的次序?yàn)橐汗瘫龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞提取溫度。從表2中可選擇的最優(yōu)組合為A3B3C2D3，與用SPSS軟件分析得出的結(jié)果一致，即優(yōu)選的組合條件為：提取溫度70℃，乙醇濃度40%，提取時(shí)間3 h、液固比17.5∶1（mL/g）。用優(yōu)化后的條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終類黑素濃度達(dá)到3.01 mmol/L，高于正交實(shí)驗(yàn)的任一實(shí)驗(yàn)組，表明優(yōu)化后的組合條件是可用于后續(xù)的大批量提取的。

3　結(jié)論

本研究通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)，確定了醬香型大曲中類黑素提取的最優(yōu)工藝條件。得到的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度70℃，乙醇濃度40%，提取時(shí)間3 h以及液固比17.5∶1（mL/g）。在此條件下從醬香型大曲中提取得到的類黑素濃度最高。目前關(guān)于大曲質(zhì)量分級(jí)的研究較為少見(jiàn)，本研究找到一種能夠表征大曲質(zhì)量的指標(biāo)，為后續(xù)的醬香型大曲的質(zhì)量分級(jí)奠定了基礎(chǔ)，關(guān)于醬香型大曲質(zhì)量分級(jí)的深入研究有待進(jìn)行。

美拉德反應(yīng)屬于非酶促褐變反應(yīng)［13］，世界上比較公認(rèn)的美拉德反應(yīng)機(jī)理是由Hodge提出的［14］，美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，現(xiàn)今研究得較多也較清楚的是糖基化最終產(chǎn)物和類黑素［15］。類黑素是指碳水化合物（一般指糖類）與帶有自由氨基的含氮化合物（如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等）之間發(fā)生美拉德反應(yīng)后期形成的一種棕褐色物質(zhì)，它是由多種結(jié)構(gòu)和不同分子量的多種物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，而且褐變的原料以及反應(yīng)條件均是類黑素組成的影響因素［16］。目前，人們對(duì)食品顏色的形成機(jī)理還不完全了解，而對(duì)類黑素的結(jié)構(gòu)更是知之甚少。因此，不同原料里類黑素的結(jié)構(gòu)不盡相同，找到醬香型大曲類黑素的最佳提取工藝尤為關(guān)鍵，從醬香型大曲中提取出的類黑素可做進(jìn)一步的深入研究，包括類黑素的理化性質(zhì)、成分組成等。

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優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1423.011.html。

中圖分類號(hào)：TS262.3；TQ925.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）07-0051-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016045

基金項(xiàng)目：白酒質(zhì)量安全可追溯系統(tǒng)的發(fā)展現(xiàn)狀對(duì)策研究（2015ZR0181）。

收稿日期：2016-02-18

作者簡(jiǎn)介：徐延，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：xy7217@126.com。

通訊作者：羅愛(ài)民。

Optimization of the Extraction Technology of Melanoidins from Jiangxiang Daqu by Orthogonal Test

XU Yan1，JIANG Yingli2，CHENG Wei2，LI Weijie1，MENG Zikuan1，GAO Hong1and LUOAimin1
（1.Department of Food Engineering，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610064；2.Langjiu Group Co.Ltd.，Gulin，Sichuan 618200，China）

Abstract:To optimize the extraction technology of melanoidins from Jiangxiang Daqu，L9（34）orthogonal design was adopted with Jiangxiang Daqu as the extracting material and ethanol solution as the extracting solvent.The effects of extraction temperature，ethanol solution concentration，extraction time and liquid-solid ratio on melanoidins concentration were investigated through single factor experiment.The results showed that，the effects of extraction temperature，ethanol solution concentration，extraction time and liquid-solid ratio on melanoidins concentration were significant，and their influencing degree ranked in decreasing sequence as liquid solid ratio＞ethanol solution concentration＞extraction time＞extraction temperature.The optimium extracting parameters of malanoidins from Jiangxiang Daqu were summed up as follows:extraction temperature was at 70℃，ethanol solution concentration was 40%，extraction time was 3 h，and liquid-solid ratio was 17.5∶1.

Key words:Daqu；melanoidins；orthogonal experiment；extraction technology