納米雄黃對卵巢癌細胞增殖凋亡的調(diào)控作用及分子機制研究

馬淑云，馮志紅，唐陽芳，楊　洋，嚴(yán)佳佳

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，西安　710077）

納米雄黃對卵巢癌細胞增殖凋亡的調(diào)控作用及分子機制研究

馬淑云，馮志紅，唐陽芳，楊洋，嚴(yán)佳佳

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，西安710077）

【摘要】目的：探討納米雄黃對卵巢癌細胞Skov3增殖和凋亡的影響及其潛在分子機制。方法：采用機械研磨法制備納米雄黃；以Skov3細胞為靶細胞，分別采用MTT實驗及流式細胞術(shù)檢測細胞增殖能力和凋亡情況；同時，利用Westernblot檢測細胞內(nèi)Bcl-2及Bax蛋白的表達變化。結(jié)果：納米雄黃能夠顯著抑制細胞增殖能力；40mg/L 和80mg/L納米雄黃處理Skov3細胞48小時，細胞凋亡顯著增加；40mg/L納米雄黃處理Skov3細胞48小時，Skov3細胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax蛋白表達顯著增加。結(jié)論：納米雄黃能夠顯著抑制Skov3細胞增殖，促進其凋亡，可能通過抑制細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達，上調(diào)Bax蛋白表達發(fā)揮抑制卵巢癌的發(fā)生發(fā)展的作用。

【關(guān)鍵詞】卵巢癌；納米雄黃；增殖；凋亡；分子機制

卵巢癌最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率居婦科惡性腫瘤第3位［1］。早期卵巢癌治療效果較好，然而由于卵巢癌早期癥狀不明顯，患者就診時多處于晚期，目前仍缺乏有效的治療方法，導(dǎo)致卵巢癌死亡率高居婦科腫瘤第1位［1］。因此，進一步探索尋找新的更為有效的治療方法，對于改善卵巢癌患者預(yù)后具有重要意義。

中藥雄黃是我國的一種傳統(tǒng)中藥，其主要成分為三硫化二砷、四硫化四砷等［2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：雄黃可通過調(diào)控細胞增殖及凋亡發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用［3］。然而，傳統(tǒng)雄黃制劑在生物利用度低較低的缺點，影響其治療效果的進一步提高。隨著新型藥物制備工藝的提高，納米雄黃越來越多的用于抗腫瘤藥物的研究［4，5］。本研究旨在研究納米雄黃對于卵巢癌SKOV3細胞增殖凋亡能力的調(diào)控作用，并探討潛在分子機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑人卵巢癌細胞Skov3購自美國ATCC；胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司；β-actin、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記鼠及兔二抗單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；青霉素/鏈霉素購自美國Sigma公司；雄黃原藥粉購自陜西康惠制藥股份有限公司；Bcl-2及BAX多克隆抗體購自美國CellSigalingTechnology公司；星式球磨機購自南京大學(xué)儀器廠。

1.2細胞培養(yǎng)將卵巢癌Skov3細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素），置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)。待穩(wěn)定傳代2-3代后，取對數(shù)生長期細胞備用。

1.3納米雄黃制備利用星式球磨機對雄黃原藥研磨納米化，制備的雄黃納米顆粒呈圓形，大小均勻，平均直徑69.98±21.18nm，符合納米藥物制劑的要求。將其溶解于KCl飽和硝酸銀溶液，用NaOH調(diào)節(jié)PH值為7.0，并配置成2mg/ml的儲備液，過濾除菌，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4MTT法測定細胞增殖能力將100ul的Skov3細胞（5x104/mL）接種于96孔培養(yǎng)板中。分別加入終濃度為10、20、40和80mg/L的納米雄黃，培養(yǎng)24h、48h和72h后每孔加入5mg/mLMTT溶液10ul孵育4h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150ul，于室溫輕微溶解結(jié)晶15min。每個時間點設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)置陰性對照孔。利用自動酶標(biāo)儀測定每孔于490nm波長處的吸光度（A）值。根據(jù)吸光度值計算細胞增殖抑制率。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡利用納米雄黃處理Skov3細胞48h后，用0.01mol/LPBS洗滌細胞，1000r/min離心5min后棄去上清，用1×Bindingbuffer重懸細胞并調(diào)整細胞數(shù)為1×106/mL，每管加入500ul細胞懸液、5ul AnnexinV-FITC和10ulPI?；靹蚴覝乇芄夥跤?0min后，進行流式細胞儀檢測，每個樣本獨立重復(fù)3次。

1.6Westernblot利用RIPA蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，并利用BCA蛋白定量試劑盒（BCAkit）檢測蛋白樣品濃度。取30ug蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后，利用濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉2h后，加入TBST稀釋的p53多克隆抗體（1∶1000）、Bcl-2多克隆抗體（1∶1000）及β-actin單克隆抗體（mAb，1：1500）4℃孵育過夜后，加HRP標(biāo)記二抗（1：10000），室溫孵育2h。最后利用ECL化學(xué)發(fā)光劑暗室顯影。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析所有計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，使用SPPSS13.0和GraphPadPrism5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間比較進行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1納米雄黃抑制卵巢癌Skov3細胞的增殖活性MTT實驗結(jié)果顯示：10mg/L的納米雄黃處理細胞后，在各時間段對細胞增殖均無顯著影響（P＞0.05）；20mg/L的納米雄黃處理細胞24h后，細胞增殖未被顯著抑制（P＞0.05），而處理48h及72h后，細胞增殖活力受到顯著抑制（P＜0.05）；用40mg/L及80mg/L納米雄黃處理細胞24h后，即可見細胞增殖被顯著抑制（P＜0.05），而處理48h和72h后，細胞增殖的抑制作用更加顯著（P＜0.01），見表1。

表1　不同濃度納米雄黃對SKOV3細胞的增殖抑制率（%）

2.2納米雄黃促進卵巢癌Skov3細胞的凋亡如圖1所示：用40mg/L和80mg/L納米雄黃處理Skov3細胞48小時后，細胞凋亡率（%）分別為：21.83±3.25和25.33±3.46，而對照組細胞凋亡率為7.92±2.76，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　納米雄黃對Skov3細胞的凋亡的影響

2.3納米雄黃抑制卵巢癌Skov3細胞中Bcl-2蛋白的表達Bcl-2是細胞內(nèi)一種重要的凋亡相關(guān)因子，具有抑制細胞凋亡的生物學(xué)功能；而Bax蛋白是另一種凋亡相關(guān)蛋白，具有促進細胞凋亡發(fā)生的生物學(xué)功能［6］。Westernblot結(jié)果提示：利用40mg/L的納米雄黃處理Skov3細胞48小時后，細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達顯著降低，而Bax蛋白的表達顯著增加。如圖2。

圖2　納米雄黃對Skov3細胞中Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達的影響

3　討論

納米雄黃是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要藥物之一，可用于治療癰腫疔瘡、蛇蟲咬傷、蟲積腹疼、驚癇、瘧等功用［3］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：納米雄黃能夠發(fā)揮抑制肺癌、宮頸癌及肝癌等惡性腫瘤的生物學(xué)功能［7-9］。納米雄黃可抑制細胞DNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，增強機體的細胞免疫功能等多種生物學(xué)作用發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。然而，納米雄黃在卵巢癌是否能夠發(fā)揮抑癌作用以及具體分子信號機制，目前尚不明確。

細胞凋亡是由基因調(diào)控的細胞自主性的死亡，具有高度的保守性，可以通過死亡受體、凋亡抑制蛋白、線粒體和Caspase酶等多個水平實現(xiàn)。其中，Bcl-2家族蛋白和P53蛋白等在調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著非常重要的角色［6］。多種研究表明：腫瘤細胞增殖能力增強和凋亡減少是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征。因此，通過抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要策略。本研究從納米雄黃對卵巢癌細胞增殖及凋亡的調(diào)控作用為切入點，探討其在卵巢癌生物學(xué)功能及潛在分子機制。MTT實驗表明：納米雄黃對卵巢癌Skov3細胞的增殖能力具有顯著抑制作用，并且納米雄黃對Skov3細胞增殖的抑制作用隨藥物濃度的增加及藥物作用時間的延長而增加；進一步利用流式細胞儀檢測表明：納米雄黃對Skov3細胞的凋亡具有顯著促進作用。因此，上述實驗結(jié)果表明：納米雄黃能夠通過抑制卵巢癌細胞的增殖，促進其凋亡而發(fā)揮抑制卵巢癌的作用。

Bcl-2/Bax是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種重要凋亡相關(guān)因子。既往研究表明［6］：Bcl-2具有抑制細胞凋亡的功能，而Bax則具有促進細胞凋亡發(fā)生的功能。本研究通過westernblot實驗證實：納米雄黃能夠抑制Skov3細胞中Bcl-2蛋白的表達，上調(diào)Bax蛋白的表達。這一實驗結(jié)果提示：納米雄黃能夠通過抑制Bcl-2蛋白表達，上調(diào)Bax蛋白的表達，進而發(fā)揮促進腫瘤細胞凋亡的作用。

綜上，本研究表明：納米雄黃能夠抑制卵巢癌細胞中Bcl-2蛋白表達，上調(diào)Bax蛋白的表達，發(fā)揮促進卵巢癌細胞凋亡，抑制其增殖的生物學(xué)功能。納米雄黃對于卵巢癌具有潛在的治療價值，其治療效果需要未來更多動物實驗及前期臨床實驗的進一步證實。

參考文獻

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通迅作者：馬淑云，E-mail：mashuyun36@163.com

【中圖分類號】R737.3

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673-016X（2016）03-0014-03

收稿日期：2016-02-12

基金項目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃資助項目（2012JM4051）

The regulation of Realgar Nanoparticle on the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell and the underlying mechanisms

Ma Shu-yun, Feng Zhi-hong, Tang Yang-fang, Yang Yang, Yan Jia-jia
（Department of gynaecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710077, Shanxi, China）

［Abstract］Objective To elucidate the effects of Realgar Nanoparticle on the proliferation and apoptosis of SKOV3 human ovarian carcinoma cells and the underlying mechanisms. Methods Preparation of Realgar Nanoparticle was mechanical milled using a high-energy planetary ball mill. The MTT assay and flow cytometry were used to evaluate the proliferation and apoptosis of SKOV3 cells, respectively. Western blot was employed to determine the expression level of Bcl-2 and Bax in SKOV-3 cells. Results Realgar Nanoparticle could significantly inhibit the proliferation of SKOV3 cells, and treating SKOV3 cells with Realgar Nanoparticle （40mg/L and 80mg/L） resulted in significantly increased apoptosis. After being incubated with the Realgar Nanoparticle （40mg/L） for 48h, the expression level of Bcl-2 was significantly reduced and Bax expression level was significantly increased in the SKOV3 cells. Conclusion Realgar Nanoparticle can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of Skov3 cells, and the inhibitory effects of Realgar Nanoparticle on ovarian carcinoma are probably exerted by decreasing the expression of Bcl-2 protein and increasing the expression of Bax protein.

［Key words］Ovarian carcinoma； Realgar Nanoparticle； Proliferation； Apoptosis； Molecular mechanisms