改進(jìn)硝基四氮唑藍(lán)比色法用于黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選

高曉慧，唐晶晶，劉浩然，劉英姿

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410208；2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙　410082；湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙　410006）

改進(jìn)硝基四氮唑藍(lán)比色法用于黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選

高曉慧1，唐晶晶2，劉浩然2，劉英姿3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410208；2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙410082；湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410006）

【摘要】目的：建立簡(jiǎn)單方便的測(cè)定黃嘌呤氧化酶的方法。方法：在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，采用十二烷基硫酸鈉（SDS）為終止劑，改進(jìn)硝基四氮唑藍(lán)法測(cè)定了黃嘌呤氧化酶的方法。SDS濃度為10%。酶反應(yīng)時(shí)間為25min。結(jié)果：與原方法相比，改進(jìn)的方法具有不產(chǎn)生藍(lán)色沉淀、不必離心就可直接測(cè)定，準(zhǔn)確度、精密度好的優(yōu)點(diǎn)。適合于測(cè)定在紫外區(qū)有吸收的化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶的作用。結(jié)論：以SDS為終止劑的硝基四氮唑藍(lán)法簡(jiǎn)單易行，適合于黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選。

【關(guān)鍵詞】黃嘌呤氧化酶；硝基四氮唑藍(lán)；十二烷基硫酸鈉；抑制劑

黃嘌呤氧化酶是廣泛分布于人體心、肺、肝等組織細(xì)胞漿內(nèi)的一種酶。其主要功能為催化黃嘌呤和次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?。尿酸在人體內(nèi)的升高將引起高尿酸血癥、痛風(fēng)等癥狀。因此，抑制黃嘌呤氧化酶可以減少尿酸的生成，從而緩解上述疾病。目有已在臨床應(yīng)用的黃嘌呤氧化酶抑制劑有別嘌醇、非布司他［1，2］。文獻(xiàn)中報(bào)道的測(cè)定黃嘌呤氧化酶的方法，以紫外分光光度法和硝基四氮唑藍(lán)比色法較其它方法簡(jiǎn)單、方便［3，4］。紫外分光光度法是以黃嘌呤或次黃嘌呤氧化后產(chǎn)生的尿酸在295nm處有最大吸收來(lái)測(cè)定的。因很多化合物本身在295nm處有較大吸收，不適于篩選化合物對(duì)黃嘌呤氧化酶的作用。硝基四氮唑藍(lán)法的缺點(diǎn)則是其顯色產(chǎn)物甲臜不溶于水、干擾測(cè)定。為此，我們?cè)谇叭说幕A(chǔ)上改進(jìn)了硝基四氮唑藍(lán)比色法，其快速、簡(jiǎn)便，適合于黃嘌呤氧化酶抑制劑的初步篩選工作。

1　材料與方法

1.1主要試劑黃嘌呤，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，Lot：AJ0722MA14；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT），純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司，Lot：T23J6C1；黃嘌呤氧化酶，BR，50U/mg蛋白，上海源葉生物技術(shù)有限公司，Lot：A0818C2；十二烷基硫酸鈉（SDS）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、氨水、曲拉通X-100（TritonX-100）均為分析純。超純水，自制。

1.2主要儀器UV1902型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海奧析儀器有限公司；HHA型恒溫水浴鍋，浙江金壇儀器有限公司。高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀有限公司；Eppendorf移液槍；玻璃勻漿器。

2　方法與結(jié)果

2.1試劑配制PBS（100mmol/L，pH=7.4）：以磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉按適當(dāng)比例配制成pH7.4的緩沖液。黃嘌呤（15mmol/L）：適量氨水溶解黃嘌呤，再加PBS配制成溶液，臨用前配制。NBT（2.5mmol/L）：以PBS配制成緩沖液，4℃下避保存。SDS（10%）：精密稱取SDS適量，加水配制成10%的溶液。黃嘌呤氧化酶，以PBS稀釋，備用。

2.2XOD測(cè)定步驟根據(jù)多次摸索，考慮到1cm光徑的比色皿容積在2.5～3.0ml之間較為合適，選擇酶反應(yīng)體系總體積為2.9ml。測(cè)定步驟如下表所示。

表1　XOD測(cè)定操作表

渦旋混勻。37℃孵育25min于534nm處在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度。

記標(biāo)準(zhǔn)管吸光度為A標(biāo)，酶空白管吸光度為A酶空，底物空白管吸光度為A底空，化合物測(cè)量管吸光度為A化，化合物空白管吸光度為A化空。

化合物對(duì)XOD的抑制率（%）=（A標(biāo)-A化）/（A標(biāo)-A酶空-A底空-A化空）*100%

如果化合物對(duì)XOD有抑制作用，先通過(guò)初測(cè)獲知其抑制率在0%-80%的濃度區(qū)間，再配制此區(qū)間不同濃度的化合物進(jìn)行測(cè)定，可求出半抑制濃度（IC50），從而獲知化合物對(duì)XOD的抑制強(qiáng)度。

2.3結(jié)果

2.3.1三種不同終止劑對(duì)比色法測(cè)定XOD的影響我們將改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法與之前方法所測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。文獻(xiàn)中報(bào)道的終止反應(yīng)劑有鹽酸和三氯醋酸［5，6］。鹽酸主要是使反應(yīng)液處于酸性環(huán)境，迅速終止反應(yīng)。但缺點(diǎn)是反應(yīng)產(chǎn)物甲臜不溶于水，易產(chǎn)生沉淀。三氯醋酸既有終止反應(yīng)的作用，又有沉淀蛋白的作用。酶促反應(yīng)液最后要進(jìn)行離心才可測(cè)定。耗時(shí)較多。SDS是測(cè)定酶活性的通用型終止劑。其原理是使蛋白質(zhì)可逆變性。因酶本質(zhì)為蛋白質(zhì)，SDS使之變性，酶活性即消失，從而停止催化底物反應(yīng)。由于SDS本身是一種表面活性劑，親水親油平衡值較大，亦是常用的增溶劑。在此反應(yīng)中，SDS既終止了酶促反應(yīng)，又能增溶酶解產(chǎn)物甲臜。

2.3.2SDS所需濃度考察

為考察SDS作為終止劑的合適的濃度，我們以不同濃度的SDS加入反應(yīng)體系中。平行配置相同的樣本，分別考察加入后的吸光度、加入后繼續(xù)孵育5min、10min后的吸光度。

表2　不同終止劑硝基四氮唑藍(lán)比色法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

表3　不同濃度SDS終止XOD酶促反應(yīng)的比較

上述結(jié)果表明，SDS濃度低于2%將不能完全抑制XOD活性，5%SDS基本抑制XOD活性，10%SDS可完全抑制XOD活性。因此，采用10%的SDS作終止劑。

2.3.3顯色穩(wěn)定性分別測(cè)定三份樣品在SDS終止反應(yīng)后避光條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果如表4所示。

表4　NBT顯色穩(wěn)定性考察

3　討論

目前對(duì)于藥物或食品中XOD活性或抑制活性的測(cè)定方法有色譜法、電化學(xué)法、紫外分光光度法及NBT比色法等［7-10］。其中，紫外分光光度法根據(jù)黃嘌呤或次黃嘌呤氧化后的產(chǎn)物尿酸在295nm處有最大吸收來(lái)測(cè)定，有較多文獻(xiàn)采用此法。此法適合于測(cè)定臨床樣本，但在測(cè)定黃嘌呤氧化酶抑制劑時(shí)不太合適。許多被測(cè)試的化合物在295nm處有較強(qiáng)的吸收，對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾較大。NBT比色法的原理是黃嘌呤或次黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶氧化的過(guò)程中產(chǎn)生超氧陰離子，后者與NBT反應(yīng)生成有色化合物甲臜。文獻(xiàn)報(bào)道的NBT法常以三氯醋酸或鹽酸來(lái)終止反應(yīng)、離心，取上清再測(cè)定吸光度。我們研究發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物甲臜在水中及緩沖液中溶解度很小，量過(guò)大時(shí)會(huì)形成沉淀，在離心過(guò)程中被蛋白吸附，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。如果用鹽酸終止反應(yīng)，若生成過(guò)量的甲臜，將會(huì)在緩沖液中形成極微細(xì)的不溶顆粒，在分光光度計(jì)上測(cè)定時(shí)會(huì)形成散射，從而造成結(jié)果不準(zhǔn)確。曾有實(shí)驗(yàn)采用在緩沖液中加入TritonX-100等增溶劑的方法來(lái)測(cè)定［11］，但我們實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，Triton X-100可抑制XOD，造成假陽(yáng)性干擾，因此沒(méi)有采用。

通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)比較，我們采用SDS為終止劑。SDS終止酶促反應(yīng)的機(jī)理是使蛋白質(zhì)（酶）可逆變性，失去活性。同時(shí)，SDS又是一種優(yōu)良的表面活性劑，其親水親油平衡值較大，是良好的增溶劑。因此，SDS既可終止反應(yīng)，又對(duì)生成的甲臜有一定的增溶作用，使之不會(huì)形成沉淀，不必離心即可直接測(cè)定。其最大吸收在530nm左右，在530-560nm之間吸收峰較平坦，可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整檢測(cè)波長(zhǎng)以達(dá)到最大的靈敏度。NBT反應(yīng)后的產(chǎn)物甲臜在4h內(nèi)完全穩(wěn)定，經(jīng)歷12h后吸光度略有下降。本法測(cè)定黃嘌呤氧化酶的活性，操作簡(jiǎn)單、快速方便，可廣泛用于黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選。

參考文獻(xiàn)

［1］ 劉永貴, 趙麗嘉, 崔艷麗, 等. 抗高尿酸血癥藥物研究進(jìn)展. 現(xiàn)代藥物與臨床. 2015, 30（3）: 345-350.

［2］ 李閱?wèn)|, 姚成娥, 沈如杰, 等. 選擇性黃嘌呤氧化酶抑制劑非布司他的臨床研究進(jìn)展. 中國(guó)藥房, 2013, 24 （26）: 2472-2475.

［3］ 姜彤偉, 徐建, 王曉明, 等. 玉米須中抑制黃嘌呤氧化酶活性組分的篩選及其作用. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2011, 37（3）: 433-436.

［4］ Guan Q, Cheng ZJ, Ma XX, et al. Synthesis and bioevaluation of 2-phenyl-4-methyl-1, 3-selenazole-5-carboxylic acids as potent xanthine oxidase inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 85 （）: 508-516.

［5］ 羅六保, 謝志鵬. 紫外分光光度法測(cè)定中藥中黃嘌呤氧化酶抑制活性研究. 化學(xué)世界, 2009, 50（5）: 273- 275.

［6］ 尚雁君, 黃才國(guó), 蔣三好, 等. 迷迭香酸對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 27（2）: 189-191.

［7］ 孫永麗, 趙煥新, 白虹. HPLC 法體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑. 藥物分析雜志, 2014, 34（8）: 1391-1396.

［8］ 高洪福, 曲巖, 肖伍英, 等. 黃嘌呤氧化酶在SWNTs+ DDAB/EPG上的電化學(xué)性質(zhì)研究. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2012, 35（4）: 96.

［9］ Chen SL, Zhang TJ, Wang J, et al. Synthesis and evaluation of 1-hydroxy/methoxy-4-methyl-2-phenyl-1H-imidazole-5-carboxylic acid derivatives as non-purine xanthine oxidase inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry 2015, 103 （） : 343-353.

［10］ Hunyadi A , Martins A, Danko B , et al. Discovery of the first non-planar flavonoid that can strongly inhibit xanthine oxidase: protoapigenone 10-O-propargyl ether. Tetrahedron Letters, 2013, 54 （） : 6529-6532.

［11］ 王詩(shī)瑾, 張愔, 錢(qián)書(shū)紅, 等. 四唑鹽比色法測(cè)定血清黃嘌嶺氧化酶.河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1993, 28（3）: 277-279.

【中圖分類號(hào)】R446.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-016X（2016）03-0142-03

收稿日期：2016-01-10

通訊作者：劉英姿，Email:liuyingzi111@sina.com

Improved nitroblue tetrazolium colorimetric method applied to the screening of xanthine
oxidase inhibitors

Gao Xiao-hui1, Tang Jing-jing2, Liu Hao-ran2, Liu Ying-zi3*
（1. College of pharmacy, Hu’nan University of Chinese Medicine, Changsha 410208； 2. College of chemistry and chemical engineering, Hu’nan University, Changsha 410082； Medical College, Hu’nan Normal University, Changsha 410006）

［Abstract］Objective To establish a simple and convenient method for determination of xanthine oxidase（XOD）. Methods On the basis of previous research, an improved method applied with nitroblue tetrazolium was used for the determination of the xanthine oxidase with 10% sodium dodecyl sulfate （SDS） as terminating agent. The reaction time for the enzyme was 25min. Results The activity of XOD can be determined with improved method which can directly determined without centrifugation since no blue precipitation produced, it is more accuracy and precise compared with the original method. This method is suitable for the investigation on the effect of compounds with ultraviolet absorption on XOD. Conclusion The modified method with SDS as terminator is simple and suitable for the screening of xanthine oxidase inhibitors.

［Keywords］Xanthine oxidase； Nitroblue tetrazolium； Sodium dodecyl sulfate； Inhibitor