顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎對(duì)精子DNA完整性的影響

張　健，許　鵬，斯坎達(dá)爾，陳滌平，王玉杰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿中心,烏魯木齊　830054)

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·臨床研究·

顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎對(duì)精子DNA完整性的影響

張健，許鵬，斯坎達(dá)爾，陳滌平，王玉杰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿中心,烏魯木齊830054)

摘要：目的探討顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎對(duì)精索靜脈曲張(VC)患者精子DNA完整性的影響，為臨床男性不育癥的治療提供理論依據(jù)。方法40例健康對(duì)照組及62例VC組測(cè)定精子DNA碎片率(DFI)，VC組62例患者行顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎術(shù)，術(shù)后3個(gè)月及6個(gè)月復(fù)查精子DFI，與術(shù)前比較。結(jié)果術(shù)前VC組和對(duì)照組的DFI平均水平分別為(30.42±8.57) %和(12.26±5.57) %，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；VC組患者術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月DFI平均水平分別為(22.65±5.57)%和(17.65±5.48) %。結(jié)論VC可導(dǎo)致患者精子DFI偏高，行顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎后患者的精子DFI水平較術(shù)前明顯降低；VC的分度以及術(shù)前精液分析正常與否和VC患者的精子DFI無(wú)明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞:精索靜脈曲張(VC)；精子DNA碎片率(DFI)；顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎術(shù)；男性不育

精索靜脈曲張(varicocele，VC)是指由于各種原因引起精索蔓狀靜脈叢血液回流不暢，局部靜脈異常擴(kuò)張、迂曲的病理改變，是一種常見(jiàn)的男科疾病。有統(tǒng)計(jì)指出，成年男性VC患者中，約35%伴有不育[1]，而由于VC所導(dǎo)致的不育占男性不育的25%～40%。因此，VC與男性不育密切相關(guān)。精子DNA碎片率(DNAfragmentationindex，DFI)是近幾年研究較熱的評(píng)價(jià)精液質(zhì)量和預(yù)測(cè)生育能力的新指標(biāo)，從DNA層面反應(yīng)精子功能。研究表明，部分精液分析正常的不育患者精子DNA碎片率明顯高于正常男性，對(duì)于VC不育患者也有精液分析正常而精子DFI已明顯升高。這說(shuō)明精子DFI檢測(cè)能更好地反應(yīng)精子的生殖功能。本研究旨在通過(guò)比較VC不育男性行顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎后DFI變化，分析精子DNA碎片率與VC的關(guān)系，為臨床治療VC提供更多的理論依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)2014年7月至2014年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診，診斷為左側(cè)精索靜脈曲張且不育，行專科查體及精索+陰囊彩色多普勒超聲檢查，配偶在我院行婦科生殖檢查均未見(jiàn)異常的62例患者納入VC組(其中Ⅰ度曲張17例、Ⅱ度曲張31例、Ⅲ度曲張14例)；健康對(duì)照組取無(wú)生殖系統(tǒng)疾病史、配偶均在1年內(nèi)正常生育者40例。排除標(biāo)準(zhǔn)：雙側(cè)VC、重度少精癥(<5×106/mL)、無(wú)精子癥、腦垂體病變、染色體異常、外生殖器先天性病變、泌尿生殖道外傷及嚴(yán)重感染、雙側(cè)睪丸容積相差>4mL等以及系統(tǒng)性疾病、腫瘤治療、長(zhǎng)期吸煙、酗酒和服藥等影響生育的疾病和不良嗜好。

1.2手術(shù)方法VC組患者均充分知情同意并簽署手術(shù)知情同意書(shū)后，由我院相同的手術(shù)小組人員統(tǒng)一施行經(jīng)顯微鏡下左側(cè)精索靜脈結(jié)扎術(shù)，切口均采取外環(huán)下橫行切口。

1.3檢測(cè)指標(biāo)VC組及對(duì)照組行精液分析、精子巴氏染色形態(tài)分析及精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn) (spermchromatindispersiontest，SCD)檢測(cè)DFI。所有研究對(duì)象于術(shù)后3月及術(shù)后6月復(fù)查精液分析、精子巴氏染色形態(tài)分析及DFI檢測(cè)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法按照WHO推薦的精液檢查方法，所有研究對(duì)象均禁欲2～7d，在我院產(chǎn)前診斷中心取精室通過(guò)手淫法留取精液于干燥清潔取精杯中，置37 ℃恒溫水浴箱待完全液化后，進(jìn)行精液參數(shù)分析。分析指標(biāo)包括精液量、pH值、精子濃度、精子活力(a+b)等。精子形態(tài)檢測(cè)采用巴氏染色形態(tài)分析。DFI檢測(cè)采用SCD法(具體步驟詳見(jiàn)產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū))。

1.5實(shí)驗(yàn)儀器及試劑精液分析采用輔助精液分析系統(tǒng)WLJY-9000型精子自動(dòng)分析儀(北京偉力公司)、光學(xué)顯微鏡NIKON(日本)、離心機(jī)；精子DNA碎片率檢測(cè)采用精子DNA碎片染色試劑盒(瑞-吉染色法)，購(gòu)自安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司。

1.6統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，手術(shù)前后組間DFI值的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

術(shù)前VC組和對(duì)照組的DFI平均水平分別為(30.42±8.57) %和(12.26±5.57)%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.303，P<0.01)。術(shù)后3個(gè)月VC組精子濃度較術(shù)前有所增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，a+b級(jí)精子比例及精子正常形態(tài)比例較術(shù)前無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而精子DFI較術(shù)前明顯降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。術(shù)后6個(gè)月，VC組精子濃度、a+b級(jí)精子比例及精子DFI較術(shù)前均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而精子正常形態(tài)比例較術(shù)前雖有所增加，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

所有VC患者術(shù)后3個(gè)月及術(shù)后6個(gè)月精子DFI較術(shù)前均有明顯降低，VCⅠ度、Ⅱ度、Ⅲ度患者間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月，DFI降低程度與曲張分度的相關(guān)系數(shù)分別為0.069(P=0.593)和0.169(P=0.190)，即DIF降低與VC的分度無(wú)明顯相關(guān)性(表2)。

無(wú)論精液分析異常(以精子濃度<20×106/mL或a+b級(jí)精子比例<50%為標(biāo)準(zhǔn))或正常(以精子濃度>20×106/mL且a+b級(jí)精子比例>50%為標(biāo)準(zhǔn))的VC患者術(shù)后3月及6月精子DFI下降較術(shù)前相比，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后3個(gè)月，精液分析正常的VC患者DFI改變量為(6.37±3.54)%，精液分析異?；颊邽?9.09±5.24)%，術(shù)后3個(gè)月，精液分析異常患者DFI改變量大于精液分析正?；颊?t=-2.386，P=0.02)；術(shù)后6個(gè)月，精液分析正常和異常的VC患者DFI改變量分別為(11.70±4.74)%，(13.78±6.44)%，組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-1.442，P=0.155，表3)，說(shuō)明短期內(nèi)精液分析異常組DFI改變量大，但長(zhǎng)期趨勢(shì)與精液分析正常與否無(wú)關(guān)。

精液參數(shù)術(shù)前術(shù)后3月術(shù)后6月精子濃度(106/mL)37.97±27.3446.57±22.09*53.08±21.06*a+b級(jí)精子比例(%)57.86±20.0658.03±18.4870.80±13.48*正常精子形態(tài)比例(%)4.43±2.744.68±2.045.04±2.42精子DFI(%)30.42±8.5*22.65±5.57*17.65±5.48*

與術(shù)前相比，*P<0.05。

與術(shù)前相比，*P<0.05。

與術(shù)前相比，*P<0.05。

3討論

VC導(dǎo)致男性不育的機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但目前尚沒(méi)有一種學(xué)說(shuō)能夠完全闡明VC導(dǎo)致男性不育的確切機(jī)制，目前比較受到認(rèn)可的機(jī)制主要有氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)損傷，也有學(xué)者提出生殖細(xì)胞凋亡是主要原因[2-4]，還有睪丸局部溫度升高、局部代謝產(chǎn)物增加以及缺氧等，其中ROS學(xué)說(shuō)被認(rèn)為是最具說(shuō)服力的VC導(dǎo)致不育的可能原因。ROS是一類有高反應(yīng)活性的含氧基團(tuán)，生理狀態(tài)下，這些含氧基團(tuán)在精子獲能、頂體反應(yīng)等過(guò)程中有重要作用，機(jī)體存在多種一定水平的抗氧化物質(zhì)，這些抗氧化物質(zhì)使得ROS的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)維持機(jī)體的正常生精有重要意義。VC時(shí)由于睪丸組織供氧不足、無(wú)糖酵解增加，從而使得睪丸局部組織發(fā)生缺氧、代謝性酸中毒，三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)分解產(chǎn)生對(duì)組織細(xì)胞有損傷的ROS基，ROS增加后，氧化與抗氧化失衡。這些活性氧基團(tuán)損傷精子頭部的細(xì)胞膜，使得位于精子頭部的染色質(zhì)暴露于高濃度的ROS環(huán)境中，高濃度的ROS對(duì)精子有毒性作用，并可直接損傷精子核內(nèi)及線粒體內(nèi)的DNA,誘發(fā)DNA雙鏈斷裂和單鏈形成，從而使精子DNA碎片率升高。有國(guó)內(nèi)學(xué)者指出，ROS可能通過(guò)直接氧化精子DNA堿基,也可能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物與DNA的共價(jià)鍵結(jié)合,引起精子DNA雙鏈斷裂[5]。氧化應(yīng)激還可以影響到精子核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)精子DNA損傷等[6 ]。國(guó)外有實(shí)驗(yàn)研究得出:VC患者行精索靜脈結(jié)扎術(shù)后,精子DNA完整性能夠得到顯著提高,同時(shí)術(shù)后患者精漿抗氧化能力增強(qiáng),而使氧化應(yīng)激減弱[7-8 ]。

本研究結(jié)果顯示：VC患者行顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎后精子的濃度、a+b級(jí)精子比例較術(shù)前有顯著升高(P<0.05)，而精子DNA碎片率較術(shù)前有顯著降低(P<0.05)，這與AI等[9]的研究結(jié)果相一致。精液分析正常的VC不育患者精子DFI水平明顯高于健康正常對(duì)照組(P<0.05)，這表明VC對(duì)精液的損傷是一個(gè)漸變的過(guò)程，精子DNA損傷較精液分析的各項(xiàng)指標(biāo)變化能更早的表現(xiàn)出來(lái)。ZINI[10]等的研究指出：不育癥患者的精子DNA碎片率明顯高于正常人群，且精液分析的各項(xiàng)指標(biāo)正常并不表示精子無(wú)DNA碎片化[7]。這提示了精子DNA碎片率較精液分析的各項(xiàng)指標(biāo)更為敏感，它能在精子受損，精液參數(shù)表現(xiàn)正常時(shí)即明顯升高。許多原因不明的不育患者，精子DNA碎片率明顯高于正常人群也印證了這一點(diǎn)。本研究結(jié)果還顯示：不但術(shù)前精液分析異常的VC不育患者術(shù)后精子DFI較術(shù)前有明顯下降，術(shù)前精液分析正常的VC不育患者術(shù)后精子DFI較術(shù)前也有明顯降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。國(guó)外BUNGUM等[11]的研究顯示：當(dāng)精子DNA碎片率大于30%，男性生育的可能將大幅降低。而SERGERIE等[12]的研究指出：把精子DNA碎片化程度為20%作為分界值,區(qū)別不育和生育力正常的特異度是89.4%,敏感度是96.9%。精液分析正常的VC患者測(cè)定精子DNA碎片率明顯高于對(duì)照組，這很有可能就是部分精液分析正常的VC患者不育的原因。因此，對(duì)于VC患者而言，一旦確診，在行精液分析的同時(shí)及早行精子DNA碎片率檢測(cè)能更早的發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，及早行精子DNA碎片率檢測(cè)是非常有必要的。術(shù)后3個(gè)月，研究對(duì)象組的精子DFI較術(shù)前明顯下降，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而精子濃度、精子正常形態(tài)比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。到術(shù)后6個(gè)月，研究對(duì)象組的精子濃度較術(shù)前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而精子正常形態(tài)比例雖有所上升，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這進(jìn)一步說(shuō)明精子DNA碎片率較精液分析更為敏感。目前的生理學(xué)研究顯示：精子從發(fā)生到形成的周期約2個(gè)月，若生精功能受損，修復(fù)則需要若干個(gè)周期才能逐步恢復(fù)正常。我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)，個(gè)別重度少精癥(精子濃度<5×106/mL)的VC患者，對(duì)其測(cè)定精子DNA碎片率，其精子DFI與正常人群相差不大，有些甚至低于正常人群，其具體原因尚未可知。我們考慮：①精子濃度較低時(shí)，精液中的精子有更好的生存環(huán)境，比如能量供應(yīng)、某些生化指標(biāo)等；②重度少精癥患者有可能存在曲細(xì)精管局灶節(jié)段性生精的可能，即大部分曲細(xì)精管已不能產(chǎn)生精子，但仍有少許的曲細(xì)精管能產(chǎn)生精子，而且能產(chǎn)生正常的精子。當(dāng)然，這一假設(shè)有待今后更多研究的驗(yàn)證，故在本研究中，我們將重度少精癥患者予以剔除。Ⅰ度、Ⅱ度、Ⅲ度的VC患者術(shù)后精子DFI較術(shù)前均明顯降低，且Ⅰ度、Ⅱ度的VC患者術(shù)后精子DFI下降較Ⅲ度VC患者更加顯著，其具體原因還不明確，但DFI的下降與VC的分度似乎無(wú)明顯的相關(guān)性。

國(guó)外有相關(guān)報(bào)道聲稱：精子DNA損傷與自然受孕率以及輔助生殖受孕率降低有關(guān)[11、13]。盡管國(guó)內(nèi)外有許多研究報(bào)道了VC患者手術(shù)后精液分析某些參數(shù)及女方受孕率都有所提高，但手術(shù)對(duì)男性生育的真實(shí)影響仍然存在爭(zhēng)議。IAVIGNERA等[14]報(bào)道稱：VC患者行精索靜脈結(jié)扎術(shù)后，精子細(xì)胞凋亡標(biāo)記物較術(shù)前降低了，ZINI等[10]研究表明：VC患者行精索靜脈結(jié)扎術(shù)后，精子DNA完整性以及染色質(zhì)的穩(wěn)定性較術(shù)前均有明顯增加，在這一點(diǎn)上許多研究也得到了相同的結(jié)論[14-16]。

總之，VC可引起患者精子DNA碎片率明顯升高，這與患者精液分析是否正常以及VC的分度無(wú)明顯相關(guān)性。行顯微鏡下精索靜脈結(jié)扎后，患者精子DNA碎片率明顯下降。故對(duì)于精子DFI偏高的VC患者，不論其分度幾何以及精液分析正常與否，應(yīng)考慮行手術(shù)治療。

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(編輯王瑋)

收稿日期：2015-08-22修回日期：2016-01-04

基金項(xiàng)目：新醫(yī)大一附院2014年院內(nèi)自然科學(xué)基金

通訊作者：陳滌平，主任醫(yī)師，E-mail：cdp1958@sina.com

作者簡(jiǎn)介:張健(1989-),男(漢族)，碩士，泌尿男科專業(yè). E-mail：993558708@qq.com

中圖分類號(hào):R697.24

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.04.009

The effect of microsurgical varicocelectomy on sperm DNA fragmentation

ZHANG Jian, XU Peng, Sikandaer, CHEN Di-ping, WANG Yu-jie

(DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ABSTRACT:Objective To investigate the effect of microsurgical varicocelectomy on sperm DNA fragmentation in varicocele (VC) patients, in order to provide information for the treatment of male infertility.MethodsA total of 40 healthy controls and 62 VC patients who underwent microsurgical varicocelectomy were recruited in the study. The sperm DNA fragmentation Index (DFI) of healthy controls and VC patients before and after microsurgical varicocelectomy were compared. ResultsThe DFI of healthy controls was (12.26±5.57)%, while that of VC patients before operation was (30.42±8.57)%, which remarkably decreased 3 months (22.65±5.57)% and 6 months (17.65±5.48)% after surgery. Conclusion VC can lead to increased sperm DFI, while microsurgical varicocelectomy can decrease it. The grades of VC and semen parameters are not correlated with sperm DFI.

KEY WORDS:varicocele; sperm DNA fragmentation index; microsurgical varicocelectomy;male infertility

(No.2014ZRQN18)