白三葉返園對蘋果園土壤微生物群落的影響

魏倩倩，楊文權，韓明玉，慕小倩，寇建村

(1.西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100； 2.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；3.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

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白三葉返園對蘋果園土壤微生物群落的影響

魏倩倩1，楊文權1，韓明玉2，慕小倩1，寇建村3

(1.西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100； 2.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100；3.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

摘要：為了解蘋果(Malus pumila)園中覆蓋和埋置白三葉(Trifolium repens)對土壤微生物群落的影響，采用尼龍袋法將新鮮的白三葉覆蓋和埋置到蘋果園中，分別在白三葉降解1、3、6個月時，利用Biolog微平板法檢測土壤微生物群落的功能多樣性。結果表明，覆蓋和埋置白三葉均可使蘋果園土壤微生物代謝活性顯著提高(P<0.05)，微生物的多樣性除6個月外顯著增加、豐富度顯著增加，均勻度顯著降低(P<0.05)，群落結構發(fā)生變化，且覆草處理大于埋草，同時，白三葉降解時間的長短也影響土壤微生物群落。土壤微生物群落主成分分析結果顯示，不同返園方式間主要對羧酸類碳源的利用有差異，而導致不同降解時間土壤微生物群落代謝差異的主要是糖類。說明在蘋果園覆蓋和埋置白三葉可改變土壤微生物群落，而覆蓋白三葉對微生物群落結構的改善情況顯著優(yōu)于埋置白三葉。

關鍵詞：蘋果園；覆蓋；埋草；微生物群落多樣性；Biolog技術

Kou Jian-cunE-mail: jiancun@163.com

黃土高原是我國蘋果(Maluspumila)的主產區(qū)，但是長期以化肥為主的施肥模式導致土壤肥力退化、養(yǎng)分失調以及有機質含量低等一系列問題，嚴重制約了我國蘋果產業(yè)的發(fā)展[1-2]。近年來，果園生草模式逐漸發(fā)展成為黃土高原蘋果園的一種新的土壤管理模式，可以有效改善蘋果園土壤養(yǎng)分狀況[3-4]。同時，將果園所生牧草適時刈割后返園，可將其光合作用固定的物質以及從土壤中吸收的養(yǎng)分再返還土壤，使物質能量得以循環(huán)利用[1]。但是，目前對牧草的返園方式以及牧草降解對土壤影響方面的研究還鮮有報道[5]。

土壤微生物群落的組成和代謝狀態(tài)是土壤質量變化最敏感、最有潛力的生物學指標[6]。相關研究表明，植物殘體降解對土壤微生物群落結構有重要影響[7-9]，植物殘體分解與土壤微生物群落結構功能變化是相互影響、相互制約的過程[7]。Biolog微平板法是測定土壤微生物功能多樣性常用的、簡單快速的方法，該方法是通過測定微生物對單一碳源的代謝利用情況，來描述土壤微生物群落結構的差異和功能多樣性[10-12]。為掌握果園牧草不同的返園方式對土壤微生物群落多樣性的影響，本研究以黃土高原蘋果園最適宜的草種白三葉(Trifoliumrepens)為材料[2,13]，刈割后以覆蓋和埋置的方法返園，通過Biolog微平板法，研究白三葉不同的返園方式對土壤中微生物群落功能多樣性的影響，以期為果園牧草的合理利用提供科學的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗地位于陜西省乾縣梁山鄉(xiāng)雙矮蘋果園，地處關中平原中段北側，渭北高原南緣，108°20′ E， 34°62′ N，海拔830 m，屬溫帶大陸性季風氣候。年均氣溫13.1 ℃，年降水量573～590 mm，無霜期244 d。春季氣溫變化大，雨水不均。夏季炎熱，降水量大且分布不均。秋季氣溫溫和多雨。冬季寒冷干燥。2006年春季建園，雙矮栽培，種植的蘋果樹種為禮泉短富，行距2.5 m，株距1 m，果園管理水平成熟。土壤基礎差，養(yǎng)分含量低，熟土層薄[14]。

1.2試驗設計

2014年7月26日刈割蘋果園中種植的白三葉，裝入尼龍袋中，每袋裝鮮草200 g。7月27日，在蘋果樹行的中間位置，每隔一定距離，挖深40 cm、寬30 cm的溝，將溝內取出的土壤混勻，備用。試驗設覆草和埋草兩個處理。覆草處理：將混勻的土裝入高40 cm，長、寬均為30 cm的軟塑料花盆內，放入溝內，使其與地面保持平整，將裝有白三葉的尼龍袋壓平覆蓋在容器土壤表面；埋草處理：先在容器內裝入15～20 cm深的土，再把尼龍袋放入容器中，然后，用土把容器裝滿，容器表面與周圍地面保持平整。對照：不放白三葉的土壤裝滿容器。每處理重復5次。

分別于2014年8月27日、10月27日，2015年1月27日進行土壤樣品采集。土壤樣品采集時，混勻容器內的土壤，除去可見植物殘體及土壤動物，用四分法留取土樣后一部分裝入鋁盒中進行土壤含水量測定，再取一部分用無菌自封袋封裝，放入裝有冰袋的保溫箱，運回實驗室，進行簡單的過篩處理后混勻、密封，置于4 ℃冰箱中保存，用于土壤微生物群落功能多樣性的測定。

1.3測定指標與方法

土壤微生物功能多樣性利用Biolog生態(tài)測試板(EcoPlatesTM，美國 Matrix Technologies Corporation)進行測定，方法參考Garland等[10]的方法。平均顏色變化率(Average Well Color Development，AWCD)的計算公式為AWCD=∑(Ci-R)/3，式中，Ci為每個孔在590 nm下的吸光值，R為A1孔在590 nm下的吸光值。如果Ci-R<0，則在計算中記為0。一個ECO微孔板上的碳源有3個重復，則AWCD值為3次重復的平均值。本研究取培養(yǎng)72 h的AWCD值進行微生物功能多樣性分析，其中包括Shannon-Winner指數(shù)(H)，H=-∑Pi(lnPi)，式中，Pi表示第i孔的吸光值與對照孔的吸光值之差與整個微孔板相對吸光值的比值，Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)；豐富度指數(shù)(S)為被利用的碳源的數(shù)目，AWCD≥0.2時代表該孔中的碳源被利用；均勻度指數(shù)(E)的計算公式為E=H/lnS。

1.4數(shù)據(jù)分析

在很久很久以前，有這么一天，長白山上有八個獵人正在打獵，突然大地顫抖，響聲如雷，霧氣騰騰，天暗地旋，長白山變成一片汪洋大海。又過了不多時候，水呢，都退了。八個獵人往山底下一看，所有的村莊房屋，都淹沒了，大地也變了樣。沒辦法，八個獵人只好留在山上。

使用Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進行初步處理，使用Statgraphics軟件對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊次性檢驗，通過檢驗后對數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，當ANOVA的F檢驗的P值小于0.05時認為均值間的差異顯著，然后利用OriginPro 8.5作圖。主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)在R軟件中利用prcomp()命令完成。

2結果與分析

2.1不同處理不同降解時間土壤微生物培養(yǎng)過程中的平均顏色變化率

平均顏色變化率(AWCD值)反映了土壤微生物在培養(yǎng)過程中的代謝活性大小。AWCD值越高說明微生物群落數(shù)量越龐大，代謝活動越強[15]。因此，考察不同處理不同時間的土壤微生物在培養(yǎng)過程中的AWCD值變化，可以明確不同處理不同時間對土壤微生物群落代謝活動的影響。在培養(yǎng)的240 h內，AWCD值總體呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，前120 h快速增長，120 h后增長速度逐漸放緩，存在明顯的對數(shù)期和平臺期(圖1)。覆草處理1個月時的AWCD值一直高于埋草處理1個月時的，覆草和埋草均高于對照。3和6個月的規(guī)律與此相同。比較同一處理3個不同降解時間的AWCD值可以發(fā)現(xiàn)，6個月要明顯低于1和3個月。由此可以得出，覆草處理和埋草處理均可以提高土壤微生物群落數(shù)量和代謝活性，并且覆草處理高于埋草處理，并且在1和3個月時這種趨勢明顯，6個月時減弱。

圖1　土壤微生物群落AWCD隨著培養(yǎng)時間的變化

2.2不同處理不同降解時間土壤微生物群落代謝多樣性比較

物種多樣性是物種豐富度和物種均勻度的綜合指標，可以反映微生物群落結構和功能狀態(tài)，是表征生態(tài)系統(tǒng)是否健康穩(wěn)定的重要標志[16]。Shannon-Winner指數(shù)即多樣性指數(shù)，其值越高說明微生物群落功能多樣性越高[17]。豐富度就是群落中物種數(shù)目的多少。均勻度反映的是群落中全部物種的個體數(shù)目的分配情況。取培養(yǎng)72 h的土壤微生物群落AWCD值作多樣性分析，分析了Shannon-Winner多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)(表1)，結果表明，處理及處理時間對Shannon-Winner多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)和72 h AWCD值均有影響。處理1個月時，覆草的72 h AWCD值、土壤微生物群落的Shannon-Winner多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)顯著高于埋草和對照(P<0.05)，并且72 h AWCD值和豐富度指數(shù)埋草顯著高于對照，3個月和6個月時的規(guī)律與此基本相同。而均勻度表現(xiàn)為覆草和埋草顯著小于對照，覆草小于埋草。這說明了覆草和埋草可以提高土壤微生物群落的多樣性和豐富度，降低均勻度，但是埋草效果不如覆草。

分析同一處理不同降解時間各個指數(shù)的大小情況可以發(fā)現(xiàn)，對照在3個時間點的72 h AWCD值、Shannon-Winner指數(shù)和豐富度指數(shù)均沒有顯著差異(P>0.05)，3個月的均勻度指數(shù)顯著低于1和6個月。覆草后3個時間點的Shannon-Winner指數(shù)和均勻度指數(shù)沒有差異(P>0.05)，而豐富度指數(shù)6個月的顯著(P<0.05)低于1和3個月的。埋草Shannon-Winner指數(shù)1和3個月沒有顯著差異(P>0.05)，但是均顯著(P<0.05)高于6個月的，豐富度指數(shù)在3個時間點間的差異顯著(P<0.05)，3個月>1個月>6個月，均勻度指數(shù)在3個月時最低，6個月時最高。

表1　土壤微生物群落多樣性指數(shù)和72 h AWCD

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters within a column are significant difference among different treatments at the 0.05 level.

2.3不同處理不同降解時間土壤微生物群落對六大類碳源代謝情況的分析

不同的土壤微生物群落對不同類型的碳源利用有差異。ECO板上共有31種碳源，分為糖類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類、胺類共六大類。在各個時間，覆草對各類碳源的代謝水平都要高于埋草，且基本都差異顯著(P<0.05)，并且所利用的主要碳源類型有所不同(圖2)。1個月時，覆草和埋草均以糖類為主要碳源利用類型，其次是氨基酸類和羧酸類；此時，對照利用的主要碳源為糖類和多聚物。3個月時，對照利用最多的是多聚物和胺類，而覆草主要碳源利用類型變成了胺類和酚酸類，埋草則主要利用了胺類和氨基酸類。6個月時覆草、埋草和對照都主要利用的是多聚物，但是覆草還主要利用了氨基酸類，埋草對各類碳源均有所利用，差異不明顯。

上述結果分別分析了不同處理不同降解時間土壤微生物群落在利用碳源總體和不同碳源類型兩個水平上的差異，而主成分分析(PCA)可以反映微生物利用碳源的更詳細情況。各個樣本分布在了PCA圖上不同的位置，表明各樣本利用碳源的能力有所不同，而這種差異與各樣本在利用聚集在PC1軸和PC2軸上的碳源有關。取培養(yǎng)72 h的土壤微生物群落AWCD值作主成分分析(圖3)，31個成分因子中前6個的累積方差貢獻率達到82.61%，從中提取前兩個主成分PC1、PC2，它們的累積方差貢獻率達到60%，可以解釋60%的單一碳源變量的數(shù)據(jù)變異。3個降解時間的對照都聚集在了一起，1個月的覆草和埋草位于第3象限，3個月的埋草和覆草位于第2象限，6個月的埋草和覆草位于第1象限。PC1軸可以將3個時間點的對照、覆草和埋草分開，解釋了49%的總變異，代表了由不同處理引起的變異。PC2軸可以將覆草的3個不同時間點分開，將埋草的1與3、6個月分開，而無法將對照的3個時間點區(qū)分開。通過比較不同處理點之間的距離可知(圖3)，1和3個月不同處理之間對31種底物利用的差異大于6個月的，6個月時不同處理對底物的利用趨于一致，同時覆草3個時間點對31種底物的利用差異大于埋草。根據(jù)PCA因子載荷得分表可知(表2)，對PC1貢獻大的10種碳源中4種碳源屬于羧酸類，糖類和氨基酸類各占兩種。對PC2貢獻大的碳源也有10種，其中5種屬于糖類，兩種屬于胺類。

3討論

白三葉作為外源有機物質施入土壤后，可以被土壤微生物利用，增強土壤微生物的活動，反過來，這些微生物又可以加速白三葉的分解，促進營養(yǎng)元素的釋放以及營養(yǎng)元素在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的循環(huán)[18-19]。白三葉刈割后新鮮的植物殘體在降解過程中，土壤微生物不僅是降解的主要執(zhí)行者，而且還受降解過程的影響，因此，隨著分解過程的進行，土壤微生物的種類和數(shù)量以至于功能多樣性都在不斷變化中，水分、溫度、光照等生態(tài)因素也會影響果園土壤微生物群落[20-21]。降解前期主要是糖類、蛋白質、有機酸、苯酚等可溶性有機組分以及K、Ca、Mg、Mn等無機組分的快速損失，后期逐漸開始分解較難分解的大分子物質，如纖維素、木質素等[22-23]。本研究對比了覆蓋和埋置兩種白三葉的返園方式，結果顯示，覆草和埋草均可以提高土壤微生物代謝活性，Nair和Ngouajio[24]的研究也表明，土壤中施入有機物質可以加速土壤微生物的代謝。但是覆草提高的程度要高于埋草，可能是由于覆草的白三葉直接暴露在自然環(huán)境中，陽光、雨水等自然因素能夠加速其分解，同時充足的氧氣能夠促進降解相關的好氧微生物的快速繁殖。與埋草相比，覆草提高了土壤微生物的多樣性和豐富度，降低了土壤微生物均勻度，表明覆草處理更利于某些參與白三葉降解的菌株成為優(yōu)勢菌株。

圖2　土壤微生物六大類碳源代謝分析

注：圖中的不同小寫字母表示同一時期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters at the same stage mean significant differenonce at 0.05 level.

圖3　土壤微生物群落碳源利用主成分分析

注：1-T1，1個月的對照；1-T2，1個月的覆草；1-T3，1個月的埋草；3-T1，3個月的對照；3-T2，3個月的覆草；3-T3，3個月的埋草；6-T1，6個月的對照；6-T2，6個月的覆草；6-T3，6個月的埋草。

Note: 1-T1， Blank control of one month; 1-T2， Covering grass of one month; 1-T3， Burying grass of one month. 3-T1， Blank control of three months; 3-T2， Covering grass of three months; 3-T3， Burying grass of three months; 6-T1， Blank control of six months; 6-T2， Covering grass of six months; 6-T3， Burying grass of six months.

除此之外，降解時間對微生物群落結構的影響也非常明顯。隨著降解時間的增加，1和3個月的微生物代謝活性沒有顯著的差異，但是均大于6個月，該結果與郭劍芬等[23]認為的植物殘體前期分解速率較快、后期分解速率較慢的觀點吻合，也可能與6個月取樣時已經進入冬季，氣候寒冷使微生物活動減弱。有研究表明，隨著氣溫降低，植物殘體的分解速率呈指數(shù)降低趨勢[25]。同時，溫度可以影響部分微生物的活性，進而使植物殘體中的特定組分降解速度發(fā)生改變[26]。盡管覆草和埋草主要利用的碳源隨著降解時間的推移發(fā)生改變，但是對照處理主要利用的碳源并沒有改變，說明溫度對碳源利用的影響在本研究中影響較少。PCA分析發(fā)現(xiàn)，6個月時覆草、埋草和對照之間的差異相比1和3個月進一步縮小，同時6個月的覆草和埋草處理與3次對照在碳源利用上更為接近，表明低溫雖然降低了微生物代謝活性，但是造成6個月時處理間的差異逐漸減少的主要誘因是白三葉分解后期可利用的底物逐漸減少，覆草和埋草所處的微環(huán)境接近對照。覆草處理后，微生物多樣性指標在3個時間點沒有顯著變化，而埋草處理后隨著時間變化出現(xiàn)較大波動，表明與埋草處理相比，覆草處理微生物群落結構更加趨于穩(wěn)定，在較長時間內能夠保持優(yōu)勢菌株的優(yōu)勢度。

表2　與PC1和PC2相關性高的主要碳源

此外，通過進一步研究微生物對六大類碳源代謝的情況發(fā)現(xiàn)，覆草和埋草可以改變土壤微生物主要碳源利用類型，并且不同降解時間利用的主要碳源不同。對照在3個時間主要都以利用多聚物為主，而覆草利用的主要碳源在逐漸變化，從1個月時的糖類到3個月時的胺類，再到6個月時的多聚物，埋草處理的主要碳源利用類型和覆草處理類似。這說明白三葉的降解可以在一定程度上改變土壤微生物結構類群，在前期由于白三葉中糖類、胺類等營養(yǎng)物質的快速損失，而增加了能夠利用糖類、胺類微生物的類群，在6個月時可能是由于三葉草中的能快速被利用的營養(yǎng)物質消耗殆盡有關，覆草和埋草的土壤微生物利用各個碳源相比對照已經沒有了明顯偏好。PCA分析表明，對PC1和PC2起主要分異作用的主要碳源分別是羧酸類和糖類，不同處理間主要對羧酸類碳源的利用有差異，而導致不同三葉草降解時間土壤微生物群落代謝差異的主要是糖類。羧酸類物質是造成覆草、埋草和對照之間微生物群落差異的主要因素，與之對應的是3個不同時期3個處理之間對羧酸的利用都差異顯著，同時覆草處理對羧酸的利用都大于埋草處理，表明覆草所處的環(huán)境更有利于降解過程中羧酸類物質的釋放。降解過程中，一部分可溶性糖在降解的早期迅速釋放，使利用其的微生物群落優(yōu)勢度迅速提升，但是更多的糖類是植物結構類物質(例如纖維素等)，這些糖類物質降解較慢，而且主要在降解后期開始降解[22-23]。因此，糖類在降解所經歷的時間較其它物質更長，所以在不同降解時間的微生物群落結構功能中起主要分異。

總之，覆草提高了微生物群落代謝活性以及多樣性和豐富度，使土壤微生態(tài)系統(tǒng)更加穩(wěn)定，使土壤養(yǎng)分向有利于蘋果樹生長的水平靠近。而且白三葉刈割后直接覆蓋比埋草更省時省力利于操作。白三葉不同的返園方式對果樹生長以及對蘋果品質性狀的影響有待后續(xù)進一步研究。

4結論

1)覆草和埋草都可以明顯提高土壤微生物群落的代謝活性以及微生物群落的多樣性和豐富度，降低均勻度，但是覆草處理的這些趨勢要明顯高于埋草。

2)覆草和埋草可以改變土壤微生物主要碳源利用類型，并且不同時間利用的主要碳源不同，表明草隨著時間的降解可以不斷改變土壤微生物群落結構。

3)不同處理間主要對羧酸類碳源的利用有差異，而導致不同時間土壤微生物群落代謝差異的主要是糖類。

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(責任編輯武艷培)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0418

*收稿日期：2015-07-23接受日期：2015-10-10

基金項目：國家自然科學基金(31302027)；國家蘋果產業(yè)技術體系項目(CARS-28)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費(2452015071、QN2013025)

通信作者：慕小倩(1964-)，女，陜西吳堡人，教授，碩士，主要從事植物多樣性研究。E-mail:mxq@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號：S154.3

文獻標識碼：A

文章編號：1001-0629(2016)3-0385-08* 1

Corresponding author:Mu Xiao-qianE-mail: mxq@nwsuaf.edu.cn

Influences of white clover returning to apple orchard on soil microbial community

Wei Qian-qian1, Yang Wen-quan1, Han Ming-yu2, Mu Xiao-qian1, Kou Jian-cun3

(1.College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2.College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;3.College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Abstract:In order to understand the effects of burying and covering white clover (Trifolium repens) in apple (Malus pumila) orchard on the soil microbial community, the soil microbial community functional diversity was analyzed by Biolog microplate method after 1, 3 and 6 months treatments which fresh white clover was buried or covered in apple orchard by litter nylon bag, respectively. The results indicated that both covering and burying white clover could significantly elevate (P<0.05) the soil microbial metabolism activities, the microbial Shannon-Winner diversity index(except 6 months) and richness index while significantly reduced (P<0.05)uniformity index and changed soil microbial community structure. The effects of covering white clover were greater than that of burying. And the time of white clover degradation also had effects on soil microbial community. Principal component analysis of soil microbial community showed that the major differences between covering and burying were the utilization of carboxylic acids, whereas the major differences of microbial metabolism activities between degradation periods were sugars. These results indicated that both covering and burying white clover can change the soil microbial community in apple orchards, and the effects of covering were greater than that of burying.

Key words:apple orchard; covering grass; burying grass; microbial community diversity; Biolog technique

魏倩倩,楊文權,韓明玉,慕小倩,寇建村.白三葉返園對蘋果園土壤微生物群落的影響.草業(yè)科學,2016,33(3)：385-392.

Wei Q Q,Yang W Q,Han M Y,Mu X Q,Kou J C.Influence of white clover returning to apple orchard on soil microbial community.Pratacultural Science，2016,33(3)：385-392.

第一作者：魏倩倩(1992-)，女，陜西寶雞人，在讀碩士生，主要進行土壤微生物多樣性研究。E-mail:weiqianqian1641@126.com

寇建村(1976-)，女，青海湟中人，副教授，博士，主要從事果草復合系統(tǒng)、草地植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail:jiancun02@163.com