蘆竹愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系的建立

陽宴清，王 詠，2，朱美蘭，2，盧運(yùn)海

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002； 2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

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蘆竹愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系的建立

陽宴清1，王 詠1，2，朱美蘭1，2，盧運(yùn)海1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002； 2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

摘要：本研究首先對蘆竹(Arundo donax)的側(cè)枝莖尖及帶腋芽幼莖段進(jìn)行了根誘導(dǎo)并產(chǎn)生無菌苗，然后對蘆竹的幼葉段、無菌苗葉段、根段、無菌苗莖段、帶腋芽幼莖段5種外植體進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)，建立從愈傷組織到再生植株的培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，MS+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT既可以促進(jìn)側(cè)枝莖尖及帶腋芽幼莖段根系的發(fā)育，也能促進(jìn)二者芽的生長，從而產(chǎn)生無菌苗。在MS+1.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT培養(yǎng)基上，幼葉段和無菌苗葉段都沒能產(chǎn)生愈傷，少數(shù)根段產(chǎn)生了愈傷但量很少，多數(shù)的無菌苗莖段都能產(chǎn)生愈傷但量相對較少；而帶腋芽幼莖段則可以在腋芽基座部位誘導(dǎo)出大量的愈傷組織，經(jīng)過繼代增殖可形成質(zhì)地松軟的乳白色愈傷，放置于MS+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上可同時(shí)分化出大量的根和芽來，顯示了蘆竹的愈傷組織具有很強(qiáng)的分化和再生能力，也表明在蘆竹上可以通過愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及植株再生這一技術(shù)體系來大大提高其繁殖系數(shù)。本研究可以為優(yōu)良蘆竹品種的快繁以及在蘆竹上開展現(xiàn)代生物技術(shù)的研究和應(yīng)用提供初步的技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:蘆竹；帶腋芽幼莖段；愈傷組織誘導(dǎo)；植株再生；快繁

蘆竹(Arundodonax)屬于禾本科蘆竹屬多年生草本植物[1]，原分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，在南非、厄立特里亞、墨西哥、意大利、埃及、日本等國家以及在我國的江蘇、浙江、湖南、福建、臺灣等地都有分布，多生長于河流、湖泊岸邊及道路兩旁。其外形既像蘆葦又像竹子，叢生，一年內(nèi)多次發(fā)筍，具有粗而多節(jié)的根狀莖，株高可達(dá)2～6 m，喜歡潮熱，但也耐低溫、干旱，在我國北方-28 ℃條件下也能夠安全越冬，具有較強(qiáng)的耐堿、抗旱性，比較適合在鹽堿地種植[2-3]。蘆竹含有豐富的生物活性物質(zhì)，其根莖為民間常用的中草藥之一[4-9]；蘆竹具有優(yōu)良的纖維，產(chǎn)量可達(dá)3～5 t·667 m-2，是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的造紙?jiān)牧现参颷10-14]；蘆竹也可以作菌草用于香菇、木耳、靈芝等多種食用菌栽培的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)料[1，15]；蘆竹長勢雄偉壯觀，姿態(tài)別致，除做河岸、湖邊等處觀賞植物之外，還可以固坡護(hù)堤、防沙固沙，是荒漠化地區(qū)恢復(fù)植被的優(yōu)良草種[1]；越來越多的研究表明，蘆竹對被重金屬污染的土壤、濕地及廢水等具有凈化、修復(fù)的功效，可以作為植物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用中的重要植物資源之一[16-33]；蘆竹生物量大，根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，使其成為當(dāng)今重要的能源植物之一[34-38]。

蘆竹的常規(guī)繁殖方式為分蘗繁殖、扦插繁殖等[39]，但常規(guī)繁殖方式遠(yuǎn)不能滿足大規(guī)模的園林建設(shè)、生態(tài)建設(shè)以及大面積生產(chǎn)栽培對蘆竹種苗的大量需求。目前為止，有關(guān)蘆竹快繁技術(shù)研究的報(bào)道很少?；ㄈ~蘆竹(A.donaxvar.versicolor)的幼芽在MS+4～6 mg·L-16-BA+1～4 mg·L-1IAA培養(yǎng)基上進(jìn)行微繁殖，1個(gè)芽經(jīng)過6個(gè)月的培養(yǎng)平均增殖到731個(gè)芽，即平均每個(gè)芽在每個(gè)月的繁殖速度為3.0倍[40]；蘆竹腋芽在MS+2～5 mg·L-16-BA+0.5～1 mg·L-1IBA培養(yǎng)基上進(jìn)行微繁殖，1個(gè)腋芽半年后增殖到562個(gè)嫩芽[41-42]；劉文竹和趙惠恩[43]在冉隆賢等[41-42]的技術(shù)基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步優(yōu)化所用激素濃度配方，使用MS+7.5 mg·L-16-BA+1 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基經(jīng)過4周的培養(yǎng)，將蘆竹腋芽的增殖系數(shù)(增殖的芽數(shù)/外植體數(shù)量)提高到13.6[43]；將蘆竹的側(cè)枝腋芽浸泡在含有誘導(dǎo)激素(IAA+KT)的液態(tài)MS培養(yǎng)基中進(jìn)行靜止培養(yǎng)，該技術(shù)可以將1個(gè)植株經(jīng)過4個(gè)月的繁殖增殖到900個(gè)植株[44]。

本研究以蘆竹為試驗(yàn)材料，探討蘆竹的側(cè)枝莖尖和帶腋芽幼莖的根誘導(dǎo)培養(yǎng)、不同蘆竹外植體產(chǎn)生愈傷組織的能力，以及愈傷組織誘導(dǎo)分化成植株的過程，旨在為蘆竹的愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生體系的建立提供試驗(yàn)依據(jù)，為提高蘆竹優(yōu)良品種的繁殖速度和系數(shù)以及在蘆竹上開展生物技術(shù)研究和應(yīng)用提供初步的技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究用到的8個(gè)蘆竹品種為綠洲1號、2號、3號、4號、5號、6號、7號和8號，由福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心提供。每個(gè)品種有3～5個(gè)叢生株群，種植在福建農(nóng)林大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)地。2014年秋季在一年生植株上采集不同的供試材料。

本研究共用幼葉段、無菌苗葉段、根段、無菌苗莖段、帶腋芽幼莖段和側(cè)枝莖尖6種外植體材料。1)幼葉段外植體：選蘆竹側(cè)枝頂尖部位尚未展開的幼嫩葉片，切成1～1.5 cm長的葉段；2)無菌苗葉段外植體：先將帶腋芽幼莖段在MS-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出無菌苗，然后將獲得的無菌苗嫩葉片切成1～1.5 cm長的葉段；3)根段外植體：將成熟蘆竹主莖切成含腋芽莖段，室溫下浸泡在水中1周，在腋芽處產(chǎn)生白色根須，用剪刀剪下，切成2～3 cm長的根段；4)無菌苗莖段外植體：將預(yù)先獲得的無菌苗幼莖切成1.5～2 cm長的莖段；5)帶腋芽幼莖段外植體：在成熟蘆竹植株上選取直徑在3～5 mm的側(cè)枝，將葉片和葉鞘剝?nèi)?，用剪刀剪?.5～2 cm長的含有腋芽的莖段；6)側(cè)枝莖尖外植體：選直徑在3～5 mm的側(cè)枝，剪取其頂尖部位，剝?nèi)ネ鈬~片和葉鞘，留2～3 cm長含有1～2個(gè)節(jié)的莖尖。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體材料消毒處理將剪切好的外植體材料(不包括無菌苗葉段和莖段外植體)先用無菌水浸泡1～2 h，再沖洗兩次。然后放入超凈工作臺，70%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉處理15 min，無菌水沖洗3次，置于無菌濾紙上吸干水分，接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2培養(yǎng)基MS-1：MS基本培養(yǎng)基+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT；MS-2：MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT；MS-3：MS基本培養(yǎng)基+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。MS基本培養(yǎng)基含蔗糖30 g·L-1、瓊脂8 g·L-1, pH 5.8，加入適量激素比例后，分裝到直徑6 cm、高9 cm的專用玻璃瓶內(nèi)(25 mL·瓶-1)，121 ℃高壓滅菌 20 min，室溫下凝固，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3側(cè)枝莖尖和帶腋芽幼莖段的根誘導(dǎo)及無菌苗的產(chǎn)生將消毒后的側(cè)枝莖尖外植體和帶腋芽幼莖段外植體以芽尖向上方向垂直插入MS-1培養(yǎng)基中，兩種外植體各接種40瓶，每個(gè)蘆竹品種接種5瓶，每瓶接種1個(gè)側(cè)枝莖尖外植體或4個(gè)帶腋芽幼莖段外植體，進(jìn)行根誘導(dǎo)培養(yǎng)，30～40 d后進(jìn)行繼培或移栽到土壤中。

1.2.4愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖將上述幼葉段、無菌苗葉段、根段、無菌苗莖段和帶腋芽幼莖段5種不同蘆竹外植體分別接種到MS-2培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，每種外植體接種40瓶，每個(gè)品種接種5瓶，每瓶內(nèi)接種4個(gè)外植體。帶腋芽幼莖段外植體，1/2為垂直腋芽尖向上方向插入培養(yǎng)基中，另外1/2為水平且部分嵌入培養(yǎng)基中放置。培養(yǎng)30～40 d后，將誘導(dǎo)出的愈傷組織切塊轉(zhuǎn)接到新的MS-2培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼培30～40 d后新獲得的愈傷組織可以進(jìn)一步被切塊轉(zhuǎn)接到新的MS-2培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。

1.2.5愈傷組織的分化及植株再生將經(jīng)過至少1次繼代培養(yǎng)增殖出的愈傷組織切塊轉(zhuǎn)接到MS-3培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)出根和芽。

1.2.6培養(yǎng)條件本研究使用由江南儀器廠生產(chǎn)的光照培養(yǎng)箱(RXZ-280D)，除了愈傷組織繼培和增殖條件為暗培養(yǎng)外，其余試驗(yàn)皆在光照強(qiáng)度為6 000 lx，光照時(shí)間為12 h·d-1的條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.2.7組培苗的馴化和移栽由側(cè)枝莖尖和帶腋芽幼莖段根誘導(dǎo)以及愈傷組織誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的組培苗，在確定移栽前，先擰松瓶蓋1 d，再打開瓶蓋2 d進(jìn)行煉苗，然后取出幼苗用自來水洗掉根部的殘余培養(yǎng)基，最后移栽到土壤中，放置在適當(dāng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)根據(jù)觀察數(shù)據(jù)計(jì)算出生根率、出愈率和植株再生率。對因污染而無法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的培養(yǎng)瓶，進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)和替換。

生根率=(產(chǎn)生根的外植體個(gè)數(shù)/根誘導(dǎo)接種的外植體總數(shù))×100%；

出愈率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/愈傷誘導(dǎo)接種的外植體總數(shù))×100%；

植株再生率=(再生出植株的愈傷塊數(shù)/植株誘導(dǎo)接種的總愈傷塊數(shù))×100%。

2結(jié)果與分析

2.1側(cè)枝莖尖和帶腋芽幼莖段根誘導(dǎo)

蘆竹的側(cè)枝莖尖和帶腋芽幼莖段兩種外植體在MS-1(MS+0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT)培養(yǎng)基上都可以被誘導(dǎo)出根系來，誘導(dǎo)率高達(dá)100%(表1)。蘆竹的側(cè)枝莖尖基部在MS-1培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后被誘導(dǎo)出根的同時(shí)也可以產(chǎn)生新的幼芽(圖1A)；帶腋芽幼莖段在根系被誘導(dǎo)的同時(shí)，其腋芽可以正常發(fā)育(圖1B)；由此產(chǎn)生的幼苗經(jīng)煉苗馴化后，可以直接移栽到土壤中，成活率達(dá)100%(圖1C，D)。

2.2不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖

在MS-2培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后，蘆竹的幼葉段未能被誘導(dǎo)出任何愈傷組織，且在培養(yǎng)基上呈逐漸萎縮、死亡現(xiàn)象(圖2A)；無菌苗的葉段同樣也沒產(chǎn)生任何愈傷組織，但葉片狀態(tài)保存相對完好(圖2B)；只有少數(shù)根段在經(jīng)過30 d誘導(dǎo)培養(yǎng)后，在根端部位被誘導(dǎo)出少量的愈傷組織，而其余絕大多數(shù)試驗(yàn)根段沒有產(chǎn)生任何愈傷組織，但保持存活狀態(tài)(圖2C)。無菌苗的莖段全部呈逐漸萎縮、死亡現(xiàn)象，但有2/3的無菌苗莖段的一端產(chǎn)生少量白色的愈傷組織，而其余的1/3未能產(chǎn)生愈傷組織(圖2D)。

表1　8個(gè)蘆竹品種的兩種外植體在MS+0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT培養(yǎng)基上的根誘導(dǎo)Table 1　The rooting rates of 2 types of explants from 8 giant reed cultivares on the MS medium with 0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT

圖1　兩種不同蘆竹(蘆竹3號)外植體在MS+0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT培養(yǎng)基上的根誘導(dǎo)情況Fig.1　Rooting of 2 different types of giant reed (Luzhu No.3)explants on the MS medium with 0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT

注：A,側(cè)枝莖尖(40 d);B,帶腋芽幼莖段(40 d);C,產(chǎn)生的無菌苗移栽到土壤中的第1天;D,無菌苗在土壤中生長第15天。

Note: A, lateral shoot tips(40 d); B, young stem segments with axillary buds (40 d); C, transplanting of aseptic seedlings in soil (1 d); D, transplanting of aseptic seedlings in soil (15 d).

帶腋芽幼莖段外植體在MS-2培養(yǎng)基上，除去少數(shù)莖段的腋芽在培養(yǎng)過程中未能發(fā)育外，其余帶腋芽莖段都被成功誘導(dǎo)出了愈傷組織。垂直插在MS-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，腋芽在生長的同時(shí)伴隨著根的生長，當(dāng)根尖接觸到培養(yǎng)基時(shí)被去分化從而形成愈傷組織(圖2E)；平放在MS-2培養(yǎng)基中的莖段的愈傷組織被誘導(dǎo)10 d后，由于直接和培養(yǎng)基接觸，腋芽基部被去分化、膨大從而發(fā)育成愈傷組織(圖2F)；垂直插在MS-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，腋芽向上能正常發(fā)育成幼苗，但在其基座部位不產(chǎn)生任何根須而是形成不斷膨大的乳白色愈傷組織(圖2G)；繼續(xù)培養(yǎng)40 d后，在腋芽基座部位形成大量的、部分嵌入到培養(yǎng)基中的愈傷組織(圖2H)。帶腋芽幼莖段外植體，最初產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地相對緊實(shí)，顏色呈黃褐色并帶有少量的綠色。將其切成小塊，在25 ℃暗光下進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)30 d后即可獲得乳白色質(zhì)地松軟的愈傷組織(圖2I)。

愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明：在本試驗(yàn)條件下，蘆竹帶腋芽幼莖段最適合做外植體來生產(chǎn)愈傷組織，出愈率高達(dá)100%；無菌苗莖段外植體的出愈率為55%～65%；根段外植體的出愈率只有0～10%；幼葉段外植體和無菌苗葉段外植體的出愈率全部是0。

2.3愈傷組織的分化及植株再生

將8個(gè)蘆竹品種的帶腋芽幼莖段外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織經(jīng)過繼代增殖1～2次后切塊放入MS-3(MS+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA)培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，植株再生率高達(dá)100%(表3)。繼代增殖的愈傷組織質(zhì)地疏松易碎(圖2I)，在接種到分化培養(yǎng)基上的7～8 d開始出現(xiàn)綠色的斑點(diǎn)，14 d時(shí)多數(shù)綠色的斑點(diǎn)分化成嫩芽(圖3A)，30 d后分化出大量的嫩芽(圖3B)，同時(shí)也分化出了大量的多數(shù)為綠色的根系(圖3C)，由此產(chǎn)生的組培苗經(jīng)煉苗馴化后，可以直接移栽到土壤中，成活率達(dá)100%(圖3D)。

圖2　不同類型的蘆竹(綠洲3號)外植體在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)Fig.2　Callus induction of different types of giant reed (Lvzhou No.3) explants on the MS medium with 1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT

注：A,幼葉段(30 d);B,無菌苗葉段(30 d);C,根段(30 d);D,無菌苗莖段(30 d);E,豎放的帶腋芽幼莖段(10 d);F,平放的帶腋芽幼莖段(10 d);G,豎放的帶腋芽幼莖段(20 d);H,平放的帶腋芽幼莖段(40 d);I,由帶腋芽幼莖段產(chǎn)生的愈傷組織的繼代培養(yǎng)(30 d)。

Note: A,young leaf segments (30 d); B, young leaf segments of aseptic seedlings (30d); C, root segments (30 d); D, stem segments of aseptic seedlings (30 d); E, vertically placed stem segments with axillary buds (10 d); F, horizontally placed stem segments with axillary buds (10 d); G, vertically placed stem segments with axillary buds (20 d); H, horizontally placed stem segments with axillary buds (10 d) transplanting of aseptic seedlings in soil (40 d); I, re-culture of calli induced from stem segments with axillary buds (30 d).

3討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)過程中可以通過使用不同類型、濃度和不同配比的植物生長調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)外植體的分化方向及器官發(fā)生。一般來講，生長素和細(xì)胞分裂素的比例影響著植物器官分化，比例高時(shí)，有利于根的分化；比例低時(shí)，有利于芽的分化；比例適中時(shí)，則促進(jìn)愈傷組織的形成。本研究選用了含有0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT的配比濃度的培養(yǎng)基來培養(yǎng)蘆竹側(cè)枝莖尖以及帶腋芽幼莖段，該配比濃度既可以促進(jìn)根系的發(fā)育，也能促進(jìn)芽的生長；產(chǎn)生的無菌苗可以做外植體材料用于新的組織培養(yǎng)，也可以移栽到土壤中進(jìn)行大田繁殖(圖1)。本研究在蘆竹上首次將側(cè)枝莖尖誘導(dǎo)出根系培育成幼苗。未來研究可以在本研究的基礎(chǔ)上，同時(shí)參照葉保君和李春玲[40]、冉隆賢等[41-42]、劉文竹和趙惠恩[43]在蘆竹上的研究結(jié)果，通過試用不同的調(diào)節(jié)劑及其濃度、比例，來尋找可以提高帶腋芽莖段的幼芽分化數(shù)的最佳培養(yǎng)基配方，提高蘆竹通過帶腋芽莖段進(jìn)行快繁的增殖系數(shù)。

外植體的選擇是愈傷組織誘導(dǎo)和建立再生體系的第一環(huán)節(jié)。本研究首次在蘆竹上試用了根段、幼葉段、無菌苗葉段、無菌苗莖段和帶腋芽幼莖段5種不同蘆竹外植體，在含有1.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，幼葉段和無菌苗葉段都不能產(chǎn)生愈傷組織，根段在少數(shù)情況下可以產(chǎn)生少量的愈傷組織，無菌苗莖段在多數(shù)情況下都可以產(chǎn)生愈傷組織，但量相對較少，帶腋芽幼莖段做外植體可以誘導(dǎo)出大量的愈傷組織且可以通過繼代培養(yǎng)進(jìn)行增殖從而產(chǎn)生大量的質(zhì)地松軟的乳白色愈傷組織。因此，蘆竹帶腋芽幼莖段最適合做外植體來生產(chǎn)愈傷組織。此外，成熟蘆竹在去頂后可誘發(fā)生長出大量細(xì)的側(cè)枝，這為蘆竹愈傷組織的生產(chǎn)提供外植體材料的保障。

表2　5種蘆竹外植體在MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)Table 2　The callus induction rates of 5 types of explants from 8 giant reed varieties on the MS medium with 1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 KT

表3　來自8個(gè)不同蘆竹品種的愈傷組織在MS+0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上的分化及植株再生Table 3　The plant regeneration rates of calli derived from the stem segments with axillary buds of 8 giant reed cultivars on the MS medium with 0.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-16-BA

圖3　蘆竹(綠洲3號)愈傷組織在MS+0.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 6-BA培養(yǎng)基上的分化及植株再生Fig.3　Plant regeneration of calli derived from the giant reed(Lvzhou No.3)stem segments with axillary buds on the MS medium with 0.5 mg·L-1 KT+1.0 mg·L-1 6-BA

注：A,愈傷組織經(jīng)過14 d誘導(dǎo)培養(yǎng);B,愈傷組織經(jīng)過30 d誘導(dǎo)培養(yǎng);C,愈傷組織經(jīng)過30 d誘導(dǎo)培養(yǎng)的根系發(fā)育情況;D,誘導(dǎo)出的再生苗撮移栽到土壤中經(jīng)10 d生長。

Note: A,callus differentiation after 14d’s induction; B, simultaneous shoot and root induction (30 d); C, rooting after 30 d’s induction; D, transplanting of regenerated plant clusters in soil (10 d).

將愈傷組織分化成植株幼苗是建立再生體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是最難的環(huán)節(jié)。一般來講，單子葉植物比雙子葉植物要難以成功。本研究采用含有0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基，直接將蘆竹的愈傷組織分化出根和芽來，產(chǎn)生大量的幼苗，顯示了單子葉植物蘆竹的愈傷組織具有很強(qiáng)的分化和再生能力。分化出的幼苗撮可以很容易地在土壤中成活。因此，通過蘆竹的愈傷組織誘導(dǎo)、分化及植株再生體系可以大大提高蘆竹的繁殖系數(shù)。

本研究采用了3種培養(yǎng)基配方(MS-1、MS-2和MS-3)，分別進(jìn)行了生根、愈傷誘導(dǎo)及植株再生試驗(yàn)，并獲得了初步的結(jié)果。以后研究可以在此基礎(chǔ)上，參照其它植物上的成功實(shí)驗(yàn)方案[45-48]，通過試用不同類型的激素及不同濃度的激素，觀察其對不同外植體誘導(dǎo)生長的影響，針對不同培養(yǎng)目的和不同外植體，找出最佳培養(yǎng)基配方，進(jìn)一步完善蘆竹的組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)。

隨著國家對生態(tài)建設(shè)和環(huán)境保護(hù)的加強(qiáng)、菌草產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，蘆竹的應(yīng)用價(jià)值將被進(jìn)一步的認(rèn)識和挖掘，對蘆竹的需求也將大大增多。蘆竹在我國黃河兩岸的生態(tài)建設(shè)、西北地區(qū)的沙漠治理、東部沿海鹽堿地的綠化和治理等方面都可以發(fā)揮其重要作用。本研究結(jié)果為優(yōu)良蘆竹品種的快繁以及在蘆竹上開展現(xiàn)代生物技術(shù)的研究和應(yīng)用提供了初步的技術(shù)基礎(chǔ)并展現(xiàn)出了廣闊的前景。

致謝：本研究中用到的植物材料是由福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心的劉斌、林輝和吳金壽等老師提供，在此一并表示感謝。

參考文獻(xiàn)References：

[1]林占熺.菌草學(xué).第三版.北京：國家行政學(xué)院出版社，2013.

Lin Z X.JUNCAO Science.Third edition.Beijing:China National School of Administration Press,2013.(in Chinese)

[2]鄭存虎,宋宏偉,秦韌.野生植物蘆竹在黃河三角洲鹽堿地的人工栽培技術(shù).當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè),2003(1):68-71.

Zheng C H,Song H W,Qin R.The artificial cultivation techniques of wild plant giant reed in the saline and alkaline land of the Huanghe delta in China.Contemporary Eco-Agriculture,2003(1):68-71.(in Chinese)

[3]趙麗萍,許卉.蘆竹在濱海鹽堿地的開發(fā)應(yīng)用及栽培技術(shù).北方園藝,2007(7):164-165.

Zhao L P,Xu H.The development,application and cultivation techniques of giant reed in the coastal saline and alkaline land.Northern Horticulture,2007(7):164-165.(in Chinese)

[4]Bhattacharya S K,Sanyal A K.Neuromuscular blocking activity of bufotenidine isolated fromArundodonaxL.Naturwissenschaften,1972,59(12):650-651.

[5]Wassel G M.Isolation and identification of alkaloids fromArundodonax.Planta Medica，1982,45(3):164.

[6]Miles D H,Tunsuwan K,Chittawong V,Hedin P A,Kokpol U,Ni C Z,Clardy J.Agrochemical activity and isolation of N-(4'-bromophenyl)-2,2-diphenylacetanilide from the Thai plantArundodonax.Journal of Natural Products,1993,56(9):1590-1593.

[7]Kaur A,Singh J,Kamboj S S,Sexana A K,Pandita R M,Shamnugavel M.Isolation of an N-acetyl-D-glucosamine specific lectin from the rhizomes ofArundodonaxwith antiproliferative activity.Phytochemistry,2005,66(16):1933-1940.

[8]Jia A L,Ding X Q,Chen D L,Chao Z Z,Liu Z Y,Chao R B.A new indole alkaloid fromArundodonaxL.Journal of Asian Natural Products Research,2008,10(1-2):105-109.

[9]劉清茹，彭文達(dá)，謝冰，李順祥.蘆竹的化學(xué)成分與生物活性研究進(jìn)展.中藥材，2014,37(10):1892-1895.

Liu Q R,Peng W D,Xie B,Li S X.The research progress in the studies of chemical composition and bioactivity of giant reed.Journal of Chinese Medical Materials,2014,37(10):1892-1895.(in Chinese)

[10]吳武漢.蘆竹——一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的造紙?jiān)牧?天津農(nóng)林科技,1992(3):28-29.

Wu W H.Giantreed,a raw material of high yield and good quality for papermaking.Science and Technology of Tianjin Agriculture and Forestry,1992(3):28-29.(in Chinese)

[11]高斌,李衛(wèi)國,徐淦臣.蘆竹制漿初探.紙和造紙,2001(4):40.

Gao B,Li W G,Xu G C.The preliminary study of pulp-making with giant reed.Paper and Papermaking,2001(4):40.(in Chinese)

[12]張自敏,李群.蘆竹造紙的發(fā)展.天津造紙,2004(3):16-17.

Zhang Z M,Li Q.The progress in the papermaking with giant reed.Tianjin Papermaking,2004(3):16-17.(in Chinese)

[13]Shatalov A A,Pereira H.ArundodonaxL. reed:New perspectives for pulping and bleaching.Part 4.Peroxide bleaching of organosolvpulps.Bioresoure Technology,2005,96(8):865-872.

[14]Shatalov A A,Pereira H.ArundodonaxL.reed:New perspectives for pulping and bleaching.Part 5.Ozone-based TCF bleaching of organosolv pulps.Bioresoure Technology,2008,99(3):472-478.

[15]梅嘉洺,黃小霞,王詠,朱美蘭,林輝,陽宴清,盧運(yùn)海.46份菌草種質(zhì)資源PEPC基因的PCR-RFLP多樣性分析.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，35(11)：45-50.

Mei J M,Huang X X,Wang Y,Zhu M L,Lin H,Yang Y Q,Lu Y H.Polymorphism analysis of PEPC gene family among 46 JUNCAO germplasms by PCR-RFLP.Chinese Journal of Tropical Agriculture,2015,35(11):45-50.(in Chinese)

[16]Fiore V,Scalici T,Valenza A.Characterization of a new natural fiber fromArundodonaxL. as potential reinforcement of polymer composites.Carbohydrate Polymers,2014,106:77-83.

[17]Mavrogianopoulos G,Vogli V,Kyritsis S.Use of wastewater as a nutrient solution in a closed gravel hydroponic culture of giant reed (Arundodonax).Bioresoure Technology,2002,82(2):103-107.

[18]Manios T,Kypriotakis Z,Manios V,Dialyna G.Plant species in a two-year-old free water surface constructed wetland treating domestic wastewater in the island of Crete.Journal of Environmental Science and Health-Part A:Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering,2002,37(7):1327-1335.

[19]韓志萍,胡正海.蘆竹對不同重金屬耐性的研究.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2005,16(1):161-165.

Han Z P,Hu Z H.Tolerance ofArundodonaxto heavy metals.Chinese Journal of Applied Ecology,2005,16(1):161-165.(in Chinese)

[20]韓志萍,胡曉斌,胡正海.蘆竹修復(fù)鎘汞污染濕地的研究.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2005,16(5):945-950.

Han Z P,Hu X B,Hu Z H.Phytoremediation of mercury and cadmium polluted wetland byArundodonax.Chinese Journal of Applied Ecology,2005,16(5):945-950.(in Chinese)

[21]韓志萍.利用蘆竹修復(fù)重金屬污染濕地的研究.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2005,6(8):30-33.

Han Z P.A research on restoring wetland polluted by some heavy metals using giantreed.Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control,2005,6(8):30-33.(in Chinese)

[22]Papazoglou E G,Karantounias G A,Vemmos S N,Bouranis D L.Photosynthesis and growth responses of giant reed (ArundodonaxL.) to the heavy metals Cd and Ni.Environment International,2005,31(2):243-249.

[23]韓志萍，王趁義.不同生態(tài)型蘆竹對Cd、Hg、Pb、Cu的富集與分布.生態(tài)環(huán)境，2007，16(4):1092-1097.

Han Z P,Wang C Y.Accumulation and distribution of cadmium,lead,mercury,and copper inArundodonaxof different ecotype.Ecology and Environment,2007,16(4):1092-1097.(in Chinese)

[24]謝龍，汪德爟.花葉蘆竹潛流人工濕地處理生活污水的研究.中國給水排水，2009，25(5):89-91.

Xie L,Wang D G.Treatment of domestic sewage by subsurface-flow constructed wetland withArundodonaxvar.versicolor.China Water and Wastewater,2009,25(5):89-91.(in Chinese)

[25]Mirza N,Mahmood Q,Pervez A,Ahmad R,Farooq R,Shah M M,Azim M R.Phytoremediation potential ofArundodonaxin arsenic-contaminated synthetic wastewater.Bioresoure Technology,2010,101(15):5815-5819.

[26]Idris S M,Jones P L,Salzman S A,Croatto G,Allinson G.Evaluation of the giant reed (Arundodonax) in horizontal subsurface flow wetlands for the treatment of recirculating aquaculture system effluent.Environmental Science and Pollution Research,2012,19(4):1159-1170.

[27]Calheiros C S,Quitério P V,Silva G,Crispim LF,Brix H,Moura S C,Castro P M.Use of constructed wetland systems withArundoandSarcocorniafor polishing high salinity tannery waste water.Journal of Environmental Management,2012,95(1):66-71.

[28]Bonanno G.Arundodonaxas a potential biomonitor of trace element contamination in water and sediment.Ecotoxicology and Environmental Safety,2012,80:20-27.

[29]Sabeen M,Mahmood Q,Irshad M,Fareed I,Khan A,Ullah F,Hussain J,Hayat Y,Tabassum S.Cadmium phytoremediation byArundodonaxL. from contaminated soil and water.BioMed Research International,2013:324830.doi:10.1155/2013/324830.

[30]Elhawat N,Alshaal T,Domokos-Szabolcsy é,El-Ramady H,Márton L,Czakó M,Kátai J,Balogh P,Sztrik A,Molnár M,Popp J,Fári M G.Phytoaccumulation potentials of two biotechnologically propagated ecotypes ofArundodonaxin copper-contaminated synthetic wastewater.Environmental Science and Pollution Research International,2014,21(12):7773-7780.

[31]Nsanganwimana F,Marchand L,Douay F,Mench M.ArundodonaxL.,a candidate for phytomanaging water and soils contaminated by trace elements and producing plant-based feedstock.A review.International Journal of Phytoremediation,2014,16(7-12):982-1017.

[32]Barbagallo S,Barbera A C,Cirelli G L,Milani M,Toscano A.Reuse of constructed wetland effluents for irrigation of energy crops.Water Science and Technology,2014,70(9):1465-1472.

[33]Elhawat N,Alshaal T,Domokos-Szabolcsy é,El-Ramady H,Antal G,Márton L,Czakó M,Balogh P,Fári M.Copperuptake efficiency and its distribution within bioenergy grass giant reed.Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2015,95(4):452-458.

[34]余醉,李建龍,李高揚(yáng).蘆竹作為清潔生物質(zhì)能源牧草開發(fā)的潛力分析.草業(yè)科學(xué),2009,26(6):62-69.

Yu Z,Li J L,Li G Y.Analysis on the potential capacity of exploiting giant reed as an energy forage.Pratacultural Science,2009,26(6):62-69.(in Chinese)

[35]Ragaglini G,Dragoni F,Simone M,Bonari E.Suitability of giant reed (ArundodonaxL.) for anaerobic digestion:Effect of harvest time and frequency on the biomethane yield potential.Bioresoure Technology,2014,152:107-15.

[36]Corno L,Pilu R,Adani F.ArundodonaxL.:A non-food crop for bioenergy and bio-compound production.Biotechnology Advances,2014,32(8):1535-1549.

[37]Saikia R,Chutia R S,Kataki R,Pant K K.Perennial grass (ArundodonaxL.) as a feedstock for thermo-chemical conversion to energy and materials.Bioresoure Technology,2015,188:265-272.

[38]Luca C,Pilu R,Tambone F,Scaglia B,Adani F.New energy crop giant cane (ArundodonaxL.) can substitute traditional energy crops increasing biogas yield and reducing costs.Bioresoure Technology,2015,191:197-204.

[39]陳慧瑜,呂軍.北疆蘆竹的扦插快繁技術(shù).北方園藝,2013(15):171.

Chen H Y,Lyu J.The techniques of cottage and rapid propagation of giant reed in North Xinjiang.Northern Horticulture,2013(15):171.(in Chinese)

[40]葉保君，李春玲.花葉蘆竹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，9(1):48-52.

Ye B J,Li C L.Studies on the techniques and methods for tissue culture ofArundodonaxvar.versicolor.Journal of Beijing Agricultural College,1994，9(1):48-52.(in Chinese)

[41]冉隆賢，林雪堅(jiān)，文仕知，謝鈺容.蘆竹組織培養(yǎng)技術(shù)研究.中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，1998,18(1):49-52.

Ran L X,Lin X J,Wen S Z,Xie Y R.Studies of the tissue culture ofArundodonax.Journal of Central South Forestry Universiy,1998,18(1):49-52.(in Chinese)

[42]冉隆賢,文仕知,謝鈺容.蘆竹快速繁殖技術(shù)研究.經(jīng)濟(jì)林研究,1998,16(2):13-15.

Ran L X,Wen S Z,Xie Y R.Studies of the techniques for rapid propagation ofArundodonax.Economic Forest Researches,1998,16(2):13-15.(in Chinese)

[43]劉文竹,趙惠恩.蘆竹高效快繁體系的建立.中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,31(16):146-150.

Liu W Z,Zhao H E.Application of tissue culture for rapid propagation ofArundodonax.Chinese Agricultural Science Bulletin,2015,31(16):146-150.(in Chinese)

[44]Herrera-Alamillo M A,Robert M L.Liquid in vitro culture for the propagation ofArundodonax.Methods in Molecular Biology,2012,877:153-160.

[45]張凌云,師尚禮,尹成學(xué),崔國忠.俄羅斯雜花苜蓿再生體系的建立.草業(yè)科學(xué),2013,30(12):1995-2000.

Zhang L Y,Shi S L,Yin C X,Cui G Z.Establishment regeneration system of Russian variegated alfalfa.Pratacultural Science,2013,30(12):1995-2000.(in Chinese)

[46]俞玲，馬暉玲.甘肅隴西野生草地早熟禾植株的再生體系.草業(yè)科學(xué),2014,31(6):1063-1069.

Yu L,Ma H L.Plant regeneration system of wild Kentucky bluegrass in Longxi,Gansu Province.Pratacultural Science,2014,31(6):1063-1069.(in Chinese)

[47]劉晨旭，馬欣，董鳳麗，周蘊(yùn)薇.地被菊‘紫妍’和‘紐9722’的再生體系建立.草業(yè)科學(xué),2015,32(2):188-195.

Liu C X,Ma X,Dong F L,Zhou Y W.Establishment of regeneration system ofChrysanthemummorifolium‘ziyan’ and ‘niu 9722’.Pratacultural Science,2015,32(2):188-195.(in Chinese)

[48]臧文靜,陳瑩,李青,茍孝琴,武炳超,楊盛婷,張銳,張新全,黃琳凱.雜交狼尾草不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)．草業(yè)科學(xué),2015,32(9):1451-1456.

Zang W J,Chen Y,Li Q,Gou X Q,Wu B C,Yang S T,Zhang R,Zhang X Q,Huang L K.Tissue culture differentiation and callus induction of different explant fromPennisetumamericanum×P.purureum.Pratacultural Science,2015,32(9):1451-1456.(in Chinese)

(責(zé)任編輯武艷培)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0720

*收稿日期：2015-12-17接受日期：2016-02-24

基金項(xiàng)目：國家菌草工程技術(shù)研究中心攻關(guān)課題項(xiàng)目(JCGG14010)

通信作者：盧運(yùn)海(1966-)，男，河北永年人，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锓肿舆z傳及生物技術(shù)。E-mail:yunhai.lu@fafu.edu.cn或yunhai.lu@hotmail.fr

中圖分類號：Q945.39

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-0629(2016)7-1332-10*

Corresponding author:Lu Yun-haiE-mail: yunhai.lu@fafu.edu.cn; yunhai.lu@hotmail.fr

A study on callus induction and plant regeneration in giant reed (Arundodonax)

Yang Yan-qing1, Wang Yong1,2, Zhu Mei-lan1,2, Lu Yun-hai1

(1.College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；2.China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology, Fuzhou 350002, China)

Abstract:In this study, the aseptic seedlings of giant reed (Arundo donax) were firstly obtained from lateral shoot tips and young stem segments with axillary buds by root and bud induction on the MS medium with 0.2 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT. Then, five types of explants, including root segments, leaf segments, leaf segments of aseptic seedlings, stem segments of aseptic seedlings, stem segments with axillary buds, were examined for their callus inducing capacity on the MS medium with 1.0 mg mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1KT. The results indicated that, no callus was induced from leaf segments as well as leaf segments of aseptic seedlings, only a small quantity of calli were induced from root segments but in rare cases, a low quantity of calli were induced from stem segments of aseptic seedlings in majority cases, and a large quantity of calli were induced in the base of axillary buds of stem segments. After 1～2 rounds of re-culture on the same medium, the calli (with an improved quality as well as an increased quantity) were transferred on the MS medium with 0.5 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA, on which both shoots and roots were simultaneously induced with a large quantity, indicating a high capacity of callus differentiation and high propagation coefficient by plant regeneration in giant reed. This study provides a technical support for the application of biotechnology in giant reed breeding and propagation.

Key words:giant reed; stem segments with buds; callus induction; plant regeneration; rapid propagation

陽宴清,王詠,朱美蘭,盧運(yùn)海.蘆竹愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系的建立.草業(yè)科學(xué),2016,33(7)：1332-1341.

Yang Y Q,Wang Y,Zhu M L,Lu Y H.A study on callus induction and plant regeneration in giant reed (Arundodonax).Pratacultural Science，2016,33(7)：1332-1341.

植物生產(chǎn)層

第一作者：陽宴清(1985-)，女，四川西充人，科研助理，學(xué)士，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。E-mail:604156945@qq.com