艾灸對脊髓橫斷術(shù)后大鼠胃黏膜組織相關(guān)因子及熱休克蛋白70表達(dá)的影響

陳英 于雋 楊舟 李飛 陳果 向麗婷 向娟 彭亮

摘要：目的 觀察艾灸對大鼠胃黏膜組織白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長因子（EGF）及熱休克蛋白70（HSP70）表達(dá)的影響，探討艾灸對胃黏膜的保護(hù)效應(yīng)與脊髓的關(guān)系。方法 實驗大鼠采用無水乙醇+阿司匹林灌胃制作胃黏膜損傷模型。將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組，每組12只。艾灸+脊髓橫斷組大鼠行脊髓橫斷手術(shù)，并予以艾灸干預(yù)。GUTH法計算胃黏膜組織損傷指數(shù)（UI），ELISA檢測血清IL-1β、TNF-α和EGF含量；Western blot檢測胃黏膜組織HSP70蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，艾灸模型組大鼠胃黏膜組織UI下降、EGF含量升高，血清IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.05，P<0.01）；與艾灸模型組比較，艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織UI升高、EGF含量降低，血清IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織HSP70蛋白表達(dá)均明顯增加（P<0.01）。結(jié)論 脊髓是艾灸對胃黏膜損傷修復(fù)與保護(hù)因子表達(dá)的重要調(diào)節(jié)途徑。

關(guān)鍵詞：脊髓橫斷術(shù)；艾灸；胃黏膜損傷；保護(hù)因子；熱休克蛋白70；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.021

中圖分類號：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0080-03

艾灸是一種溫?zé)岽碳ぴ?，具有保護(hù)機(jī)體胃黏膜的功效。前期研究表明，艾灸對于引起胃黏膜損傷的多種復(fù)雜因素有調(diào)節(jié)性[1-2]。本研究在脊髓橫斷的前提條件下，觀察艾灸對大鼠胃黏膜組織白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長因子（EGF）及熱休克蛋白70（HSP70）表達(dá)的影響，探討艾灸對胃黏膜的保護(hù)效應(yīng)與脊髓的關(guān)系。

1 實驗材料

1.1 動物

48只健康成年SD大鼠，鼠齡3～4月，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，許可證號SYXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心實驗室，溫度23～26 ℃，濕度40%～60%，自由飲食飲水。

1.2 艾條和藥物

溫灸純艾條，蘄春時珍本草科技有限公司，規(guī)格φ4 mm×100 mm。青霉素，華北制藥股份有限公司，批號20141001；阿司匹林泡騰片，阿斯利康制藥有限公司，批號20141202。

1.3 主要試劑與儀器

10%甲醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），ELISA檢測試劑盒、HSP70免疫組化檢測試劑盒（長沙維爾公司）。自制艾灸支架，隔熱薄膜。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及干預(yù)

實驗大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組，每組12只，雌雄分籠飼養(yǎng)7 d。采用無水乙醇和阿司匹林灌胃制作胃黏膜損傷模型，艾灸+脊髓橫斷組大鼠予以脊髓橫斷手術(shù)，其他組正常飼養(yǎng)。術(shù)后大鼠用繩子俯臥位捆綁在鼠板上，參照文獻(xiàn)[3]腧穴定位“足三里”，剪毛，后貼上有孔隔熱貼，再把艾條固定在專門制作的艾灸支架上，將點燃的艾條施灸大鼠雙側(cè)“足三里”，距離穴位約0.5 cm。每日2次（8：00，14：00），連續(xù)8 d。正常組和模型組大鼠予8 d假艾灸捆綁操作。

2.2 胃黏膜組織損傷指數(shù)測定

大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.6 mL/100 g）麻醉，將幽門及賁門部結(jié)扎處理，摘取全胃，冰0.9%氯化鈉溶液沖洗，GUTH法計算大鼠胃黏膜損傷指數(shù)（UI）。損傷≤1 mm（包括斑點糜爛）計1分；1 mm<損傷≤2 mm計2分；2 mm<損傷≤3 mm計3分；3 mm<損傷≤4 mm計4分；損傷≥4 mm計5分；損傷寬度>2 mm者計分加倍。

2.3 胃黏膜組織相關(guān)因子測定

ELISA檢測大鼠血清IL-1β、TNF-α和胃黏膜組織EGF含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作；Western blot檢測大鼠胃黏膜組織HSP70蛋白表達(dá)，應(yīng)用Imag J對WB條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參對照，將目的蛋白灰度值除以β-actin灰度值校正誤差，以相對灰度值表示。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。符合正態(tài)分布采用方差分析，方差齊用SNK法或LSD法，方差不齊用Dunnett's T3法或Tamhan's T2法；不符合正態(tài)分布的用K Independent Samples法比較多個獨(dú)立樣本。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 艾灸對模型大鼠胃黏膜組織損傷指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織UI明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，艾灸模型組大鼠胃黏膜組織UI明顯降低（P<0.01）；與艾灸模型組比較，艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織UI明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表1。

4.2 艾灸對模型大鼠胃黏膜組織表皮生長因子和血清白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織EGF和血清IL-1β、TNF-α含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，艾灸模型組大鼠胃黏膜組織EGF含量明顯升高（P<0.01），大鼠血清IL-1β、TNF-α含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與艾灸模型組比較，艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織EGF含量明顯降低（P<0.01），大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 艾灸對模型大鼠胃黏膜組織熱休克蛋白70蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織HSP70蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），艾灸+脊髓橫斷組HSP70蛋白表達(dá)較艾灸模型組降低（P<0.05）。結(jié)果見表3、圖1。

5 討論

艾灸具有行氣止痛、通經(jīng)活絡(luò)、溫經(jīng)散寒等功效。足三里是臟腑中胃的下合穴，又是經(jīng)絡(luò)中足陽明胃經(jīng)的合穴，故在針灸治療胃腸道疾病方面，足三里常常被用作首要穴位。有研究顯示，電針家兔足陽明胃經(jīng)上的穴位進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn)，該經(jīng)脈上的穴位均會對家兔胃黏膜產(chǎn)生不同的保護(hù)效應(yīng)，而在這些穴位中，“足三里”對胃黏膜的保護(hù)效應(yīng)最佳[4]。在機(jī)體胃黏膜受到損傷及修復(fù)過程中，機(jī)體進(jìn)行自我保護(hù)機(jī)制最重要的是內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，該機(jī)制的本質(zhì)是機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)引發(fā)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的出現(xiàn)，多種生長因子和細(xì)胞因子參與了胃黏膜上皮損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)。

EGF是一種內(nèi)源性因子，能抑制胃酸、胃蛋白酶分泌，防止?jié)兊男纬桑哂写傥葛つど掀ぜ?xì)胞遷移和增殖的作用[5-6]，故EGF在修復(fù)機(jī)體受損傷的胃黏膜方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在本實驗中，艾灸模型組和艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織EGF含量較模型組均有不同程度的上升，而艾灸+脊髓橫斷組大鼠胃黏膜組織EGF含量較艾灸模型組降低，表明艾灸上調(diào)胃黏膜組織EGF含量的作用受到脊髓橫斷術(shù)的影響。

IL-1β具有促進(jìn)機(jī)體的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，并能促進(jìn)機(jī)體中性粒細(xì)胞浸潤的作用。TNF-α也是一種炎性介質(zhì)，可引起機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明，艾灸作用于胃黏膜受到損傷的大鼠能降低大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的含量，通過減輕炎癥反應(yīng)達(dá)到保護(hù)大鼠胃黏膜的作用。而大鼠脊髓遭到橫斷后，艾灸作用于大鼠反而會上升大鼠血清IL-1β和TNF-α的含量。表明艾灸大鼠“足三里”通過細(xì)胞因子來保護(hù)胃黏膜的這一作用有脊髓的參與。

HSP70是胃黏膜保護(hù)中一類重要蛋白，具有細(xì)胞蛋白自穩(wěn)、協(xié)同免疫、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化等作用。研究發(fā)現(xiàn)，艾灸能夠保護(hù)應(yīng)激性胃黏膜受損傷大鼠的胃黏膜，這一保護(hù)過程可能與艾灸誘導(dǎo)大鼠胃黏膜組織HSP70表達(dá)有關(guān)[7]。HSP70在長時間乙醇和阿司匹林刺激胃黏膜后以及高熱后的表達(dá)明顯增加，能夠產(chǎn)生機(jī)體適應(yīng)性的細(xì)胞保護(hù)作用[8-9]。

本實驗將大鼠脊髓橫斷觀察艾灸大鼠“足三里”對胃黏膜受損大鼠的抑制作用及對大鼠胃黏膜修復(fù)的保護(hù)作用。結(jié)果表明，艾灸大鼠“足三里”對大鼠胃黏膜損傷具有明顯的保護(hù)作用，而脊髓橫斷術(shù)對其保護(hù)作用產(chǎn)生干擾。表明脊髓是艾灸對大鼠胃黏膜相關(guān)因子及HSP70表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要途徑，脊髓是艾灸“足三里”對胃黏膜保護(hù)效應(yīng)信號通路的一部分，起到重要的信號匯聚與整合的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 杜燕，易受鄉(xiāng)，林亞平，等.艾灸對急性胃黏膜損傷大鼠熱休克蛋白與相關(guān)炎性細(xì)胞因子的影響[J].上海針灸雜志，2010，29（5）：269-272.

[2] 易受鄉(xiāng)，彭艷，常小榮，等.艾灸對應(yīng)激性胃黏膜損傷大鼠胃黏膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其與熱休克蛋白表達(dá)關(guān)系的研究[J].針刺研究， 2006，31（5）：259-271.

[3] 李忠仁.實驗針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：255-257.

[4] 嚴(yán)潔，常小榮，鄧元江，等.電針足陽明經(jīng)穴對家兔胃黏膜損傷細(xì)胞保護(hù)作用的研究[J].針刺研究，2001，26（4）：264-269.

[5] 姒健敏.關(guān)注生長因子對胃黏膜的保護(hù)作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005， 85（39）：2744-2745.

[6] 賈赤宇，陳壁.EGF，TGF-β1，抗TGF-β1中和抗體對大鼠深Ⅱ°燙傷創(chuàng)面的影響[J].1999，20（5）：427-430.

[7] 李江山，嚴(yán)潔，何軍鋒，等.電針對心肌缺血模型大鼠孤束核c-fos表達(dá)及心電圖STⅡ的影響[J].針刺研究，2009，34（3）：171-173.

[8] ITOH Y H， ISHIGUCHI T， AYAKAWA Y. Expression of stress protein （HSP70） in adrenalectomized mice[J]. Nippon Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi，2002，62：161-167.

[9] ITOH Y H， NOGUCHI R. Pre-treatment with mild whole-body heating prevents gastric ulcer induced by restraint and water-immersion stress in rats[J]. Int J Hyperthermia，2000，16：183-191.