消痰通腑方對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酶A2、環(huán)氧合酶2表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

胡學(xué)謙 朱童 王丹 魏品康

摘要：目的 觀察消痰通腑方對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷移的影響，探討其分子作用機(jī)制。方法 采用不同濃度消痰通腑方作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，CCK8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，RT-qPCR檢測(cè)磷脂酶A2（PLA2）和環(huán)氧合酶2（COX-2）mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)PLA2和COX2蛋白表達(dá)，RNA干擾技術(shù)沉默SW480細(xì)胞株中PLA2基因表達(dá)。結(jié)果 消痰通腑方低、高劑量組較對(duì)照組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P<0.05），克隆形成率及遷移能力明顯下降（P<0.05，P<0.01），PLA2、COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P<0.05），并呈濃度依賴性；與質(zhì)粒對(duì)照組和對(duì)照組比較，PLA2 shRNA干擾組細(xì)胞PLA2和COX2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 消痰通腑方可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和遷移，其機(jī)制可能與PLA2及COX-2的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：消痰通腑方；磷脂酶A2；環(huán)氧合酶2；結(jié)腸癌SW480細(xì)胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）08-0050-04

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性和女性中分別位居第3位和第2位，且有逐年上升趨勢(shì)[1]。

結(jié)腸癌屬中醫(yī)學(xué)“腸蕈”范疇，多因飲食失節(jié)、脾胃受損、濕熱壅聚成痰而搏結(jié)腸腑所致。消痰通腑方為魏品康教授從痰論治消化道腫瘤核心治則“消痰散結(jié)八法”之一。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一類可催化脂肪酸水解并產(chǎn)生以花生四烯酸（arachidonic acid，AA）為主的游離脂肪酸酶，具有產(chǎn)生炎性介質(zhì)、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能，在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要生物效應(yīng)[2]。環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是PLA2催化AA生成生物活性分子的限速酶，包括COX-1和COX-2。研究表明，COX-2在結(jié)腸中過度表達(dá)，其與細(xì)胞增殖、分化等有關(guān)[3]。本研究采用消痰通腑方干預(yù)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的影響，探討其分子作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及制備

消痰通腑方由制半夏、制南星、大黃、陳皮、雞內(nèi)金、炙甘草組成，所有飲片由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供。消痰通腑方由第二軍醫(yī)大學(xué)試劑中心制備，按比例（制半夏15 g，制南星15 g，大黃6 g，陳皮15 g，雞內(nèi)金15 g，炙甘草6 g）稱取10倍量的飲片，加8倍體積的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次1 h，將煎液合并后離心、濃縮、干燥至干品即得消痰通腑方醇提物，其得率為1 g原藥材/0.26 g。等比例換算至藥物濃度分別為2.24、8.96 g/mL。實(shí)驗(yàn)前稱取適量醇提物干粉，經(jīng)渦旋、超聲、水浴等方法使其充分溶解于DMEM培養(yǎng)基后，0.22 μm濾器過濾并配置成所需濃度的溶液，4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液，qPCR、cDNA反轉(zhuǎn)錄、總RNA提取試劑盒，transwell小室，CCK8溶液，PLA2抗體，COX-2抗體，PLA2 shRNA質(zhì)粒，shRNA對(duì)照質(zhì)粒，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑，均購(gòu)自Santa cruz公司。

超凈工作臺(tái)（廣州深華生物技術(shù)有限公司），CO2培養(yǎng)箱、BIOMATE型紫外可見分光光度計(jì)（Thermo），LXJ-ⅡA型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），GE4852 型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），DYCZ-24DN電泳儀（北京六一儀器廠），Tocan500全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（南京裴爾森生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)

結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS和1%青-鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基，每隔1～2 d換液，待細(xì)胞融合約80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代及種板。消痰通腑方原藥材濃度為8.96 g/mL，經(jīng)0.22 μm無(wú)菌過濾器過濾，用培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。實(shí)驗(yàn)根據(jù)藥物濃度分為對(duì)照組（0 g/mL）、低劑量組（2.24 g/mL）、高劑量組（8.96 g/mL）。

2.2 CCK-8法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期上述3組細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×103。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別于24、48、72、96、120 h后加10 μL CCK-8溶液。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定細(xì)胞吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率[（實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值）÷對(duì)照組A值×100%]。

2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)SW480細(xì)胞懸液梯度倍比稀釋后，接種于6孔板中，每孔50個(gè)細(xì)胞。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，各組分別加入各濃度消痰通腑方溶液，重新置于培養(yǎng)箱中，經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，棄去上清液，PBS清洗2次，甲醇溶液固定15 min后加Gimesa染液染色。計(jì)算克隆細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

2.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)

收集3組細(xì)胞，800 r/min離心5 min，PBS清洗2次，用培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L。分別取100 μL細(xì)胞液置于Transwell小室上層，同時(shí)在下層加500 μL DMEM培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，擦凈小室濾膜上層的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗并用結(jié)晶紫染色。每組同時(shí)做3個(gè)重復(fù)小室，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2 mRNA表達(dá)

從Gene Bank網(wǎng)站獲取PLA2、COX-2基因序列，并使用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物（見表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，每份樣品均取2 μg，按試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以Tubulin為內(nèi)參，PLA2、COX-2表達(dá)的相對(duì)定量值用于統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2蛋白表達(dá)

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解并收集細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸變性。樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，特異性一抗4 ℃搖床過夜，洗膜后，二抗孵2 h，EC顯影。

2.7 shRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞分為PLA2 shRNA干擾組、質(zhì)粒對(duì)照組、對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以2 μg PLA2 shRNA質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，用5 μg/μL嘌呤霉素篩選細(xì)胞株，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對(duì)照組為不加任何處理的SW480細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 消痰通腑方對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響

高劑量組較對(duì)照組增殖能力明顯減弱（P<0.05），低劑量組也能抑制細(xì)胞增殖但效果不如高劑量組，結(jié)果見圖1。高劑量組克隆形成率為（48.38±3.67）%、低劑量組為（121.13±2.64）%，較對(duì)照組（205.65±3.72）%明顯降低（P<0.05，P<0.01），結(jié)果見圖2。

4.2 消痰通腑方對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲能力的影響

消痰通腑方作用48 h，低、高劑量組較對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖3。

4.3 消痰通腑方對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

消痰通腑方作用72 h，PLA2、COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高劑量組較低劑量組差異更顯著（P<0.05）。結(jié)果圖4、圖5。

4.4 PLA2 shRNA干擾后消痰通腑方對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酶A2和環(huán)氧合酶2蛋白表達(dá)的影響

PLA2 shRNA干擾48 h，與質(zhì)粒對(duì)照組和對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染PLA2 shRNA質(zhì)粒的SW480細(xì)胞PLA2蛋白表達(dá)明顯受到抑制，PLA2 shRNA干擾成功。同時(shí)，COX-2的表達(dá)與PLA2的表達(dá)具有一致性。結(jié)果見圖6。

5 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)腸癌多因飲食失節(jié)，嗜食肥甘厚膩，困遏脾土，而致脾胃受損，脾運(yùn)化失常，濕濁內(nèi)生，氣機(jī)阻滯，精微不能正常布散而發(fā)病。濕聚為痰，熱煉津?yàn)樘担蕽駸巅站蹌t久能生痰，搏結(jié)腸腑，致腸腑濕熱重滯，氣機(jī)運(yùn)化不暢，大腸傳導(dǎo)失司，痰熱濕濁不能及時(shí)排除體外而在體內(nèi)停聚，日久形成積塊而成痰結(jié)[4]。

消痰通腑方為魏品康教授從痰論治消化道腫瘤的經(jīng)驗(yàn)用方。研究表明，該方可抑制炎癥因子引發(fā)的炎癥反應(yīng)[5-6]。方中制半夏、制南星為消痰散結(jié)之君藥，大黃、炒枳實(shí)殼清熱通腑為臣藥，雞內(nèi)金、陳皮理氣消積，顧護(hù)脾胃為佐使，炙甘草調(diào)和藥性，共奏消痰散結(jié)祛除痰結(jié)、清熱通腑推陳出新。PLA2是磷脂代謝的關(guān)鍵酶之一，可分解磷脂產(chǎn)生AA從而進(jìn)一步產(chǎn)生COX-2、前列腺素E2（PGE2）等炎性介質(zhì)，從而引發(fā)炎癥。研究表明，PLA2的活化與多種腫瘤相關(guān)[7-9]。慢性炎癥促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，其中PLA2-COX-2-PGE2信號(hào)通路是其重要途徑之一。研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)展常伴隨著COX-2基因過度表達(dá)，其過度表達(dá)可通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活，進(jìn)而在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高劑量組能降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力（P<0.05），抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移（P<0.01）。低劑量組雖不如高劑量組效果好，但與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而且消痰通腑方能降低結(jié)腸癌SW480細(xì)胞PLA2及COX-2的表達(dá)，PLA2 shRNA干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)PLA2與COX-2的表達(dá)存在一致性，提示消痰通腑方可能通過降低PLA2的表達(dá)從而下調(diào)AA通路下游靶基因COX-2來(lái)調(diào)控結(jié)腸癌的增殖與遷移。

綜上所述，本研究表明消痰通腑方可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖和遷移。其機(jī)制可能與抑制PLA2及AA通路中COX-2的表達(dá)有關(guān)，為消痰通腑方用于結(jié)腸癌的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其體內(nèi)的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] MAGAJI B A， MOY F M， ROSLANI A C， et al. Descriptive epidemiology of colorectal cancer in university Malaya medical centre， 2001 to 2010[J]. Asian Pac Cancer Prev，2014，15（15）：6059-6064.

[2] HU J J， TIAN G， ZHANG N. Cytosolic phospholipase A2 and its role in cancer[J]. Clin Oncol Cancer Res，2011，8（11）：71-76.

[3] ASTING A G， CAREN H， ANDERSSON M， et a1. COX-2 gene expression in colon cancer tissue related to regulating factors and promoter methylation status[J]. BMC Cancer，2011，11（7）：238-241.

[4] 趙穎，李勇進(jìn)，魏品康.消痰通腑方對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型小鼠胰島素生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（11）：25-28.

[5] 葉敏，孫大志，修麗娟，等.消痰通腑顆粒對(duì)危重患者炎性因子的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2013，22（2）：184-186.

[6] YANG B， SHI J， XIU L J， et al. Xiaotan Tongfu granules contribute to the prevention of stress ulcers[J]. World J Gastroenterol， 2013，19（33）：5473-5484.

[7] SETHI G， SHANMUGAM M K， Ramachandran L， et al. Muhifaceted link between cancer and inflammation[J]. Biosci Rep，2011，32（1）：1-15.

[8] CAIAZZA F， MC N S， YOUNG L， et al. Cytosolic Phospholipase A2 overexpression in breast cancer is associated with EGFR expression and correlates with an adverse prognosis in luminal tumors[J]. Br J Cancer，2011，104（2）：338-344.

[9] 張勇，蔣堃，王春陽(yáng)，等.PLA2G2A在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與患者術(shù)后生存期的關(guān)系[J].中華胰腺病雜志，2013，13（5）：337-339.

[10] SOBOLEWSKI C， CERELLA C， DICATO M， et a1. The role of cyclooxygenose-2 in cell proliferation and cell eath in human malignancies[J]. Int J Cell Biol，2010，5（4）：215158.