左氧氟沙星磁性明膠微球制備及其緩釋性能

徐夢秋，林 潔，胡靜雅，殷茜茜，張敏宇，杜禮曉，李敬芬，郭玉華

（1.湖州師范學(xué)院工學(xué)院，浙江湖州313000；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州313000）

左氧氟沙星磁性明膠微球制備及其緩釋性能

徐夢秋2，林 潔2，胡靜雅2，殷茜茜2，張敏宇2，杜禮曉2，李敬芬2，郭玉華1

（1.湖州師范學(xué)院工學(xué)院，浙江湖州313000；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州313000）

采用乳化-交聯(lián)法研究了左氧氟沙星磁性明膠微球的制備及其緩釋性能.選取左氧氟沙星與明膠的比例、水油比、明膠濃度、戊二醛用量四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化最佳合成工藝.采用動(dòng)態(tài)透析法測定載藥微球的體外釋放特性，同時(shí)對載藥微球的形態(tài)、粒徑、磁性及包覆情況進(jìn)行表征.結(jié)果表明，載藥微球最佳制備工藝為：明膠濃度15%，左氧氟沙星明膠比1∶2，水油比1∶5，戊二醛用量3.6 m L；包封率為8.89%，載藥量為51.36%；微球5 h體外累積釋藥百分率人工腸液中達(dá)到64%，人工胃液中達(dá)到72%，具有較好的緩釋性能，體外釋放符合一級動(dòng)力學(xué)方程；磁性明膠微球成球性良好，分布均勻，F(xiàn)e3O4及左氧氟沙星被明膠包覆.

左氧氟沙星；明膠；磁性微球；緩釋

左氧氟沙星為第三代氟喹諾酮類抗生素，其抗菌活性是氧氟沙星的2倍.主要作用機(jī)制為抑制細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的生理功能，導(dǎo)致m RNA和蛋白質(zhì)不能正常合成，從而產(chǎn)生殺菌的作用［12］.左氧氟沙星臨床適用于腸桿菌科細(xì)菌、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌所引起的各種感染以及敗血癥等疾?。?］.當(dāng)前細(xì)菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重，尋找有效方法阻止細(xì)菌耐藥趨勢的發(fā)展很有必要.適當(dāng)延長喹諾酮類藥物的給藥間隔時(shí)間，減少給藥次數(shù)，改進(jìn)傳統(tǒng)的給藥方案，可以減少細(xì)菌耐藥性.明膠因其穩(wěn)定性、成膜性、乳化性和滲透性等性質(zhì)，是理想的載藥基質(zhì)［4-5］.磁性微球可以在外加磁場的作用下，具有較強(qiáng)的靶向性，使得載藥微球富集在病癥部位，正常部位藥物濃度較低，減少藥物的毒副作用，并且制成緩釋制劑，可以延長藥物的作用時(shí)間［6-8］.Zissu等［9］研究復(fù)合磁性藥物藥理得知，復(fù)合磁性藥物在外加磁場輸送藥物的條件下，具有安全性和有效性.Sudha等［10］以卵清蛋白為載藥基質(zhì)，硝酸毛果蕓香堿為模型藥物，制得的微球體外累積釋藥規(guī)律符合Baker-Lonsdale（Spherical Matrix）模型方程.若將藥物制成磁性明膠微球，能夠很好地控制藥物釋放，使藥物靶向病灶部位并保持高濃度.本文研究了磁性左氧氟沙星明膠微球的制備及其緩釋性能，為左氧氟沙星新劑型的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 試藥與儀器

試藥：左氧氟沙星、明膠、Span-80、液體石蠟、異丙醇、25%戊二醛等試劑均為分析純.

儀器：WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)，Nicolet 5700 FT-IR紅外光譜儀，Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡，Mastersizer 2000激光粒度分析儀，XD-2/XD-3全自動(dòng)多晶X射線衍射儀.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 磁性粒子Fe3O4的制備［11］

稱取適量的FeCl3和FeCl2·4H2O（n Fe3+∶nFe2+=1∶1），置于燒杯中，用蒸餾水溶解，使Fe2+和Fe3+濃度均為1 mol/L，濾掉雜質(zhì).將濾液置于三頸燒瓶內(nèi)，控制反應(yīng)溫度為50℃、劇烈攪拌，加入少量乳化劑聚乙二醇（PEG4000）混勻，再滴加NH3·H2O（為理論用量的1.5倍）至Fe3O4完全生成，晶化1 h束，用強(qiáng)磁鐵進(jìn)行分離，蒸餾水洗滌至p H=7，70℃干燥、研磨即得Fe3O4磁性粒子.

2.2 左氧氟沙星磁性明膠微球的制備

采用乳化-交聯(lián)法制備左氧氟沙星磁性明膠微球.稱取0.450 g自制Fe3O4和適量明膠在50℃溶于10 m L蒸餾水，并加入適量的左氧氟沙星，控制溫度在50℃攪拌，使之充分混勻，作為水相.另取適量的液體石蠟加入4%的Span-80，于50℃水浴中攪拌，作為油相.將水相緩緩滴加到油相中，50℃水浴中以800 r/min攪拌30 min.改成冰水浴，待反應(yīng)液溫度下降到5℃以下，滴加適量戊二醛，繼續(xù)攪拌，固化1 h.加入5 m L異丙醇攪拌10 min，抽濾.用15 m L異丙醇清洗產(chǎn)物3次，干燥.

根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對微球有顯著影響的明膠濃度（A）、左氧氟沙星與明膠的比例（B）、水油比（C）和25%的戊二醛用量（D）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn).綜合考慮包封率和載藥量來考察制備明膠微球的最佳條件.正交實(shí)驗(yàn)條件安排見表1.固定攪拌速率為800 r/min、乳化時(shí)間15 min、Fe3O40.45 g、固化時(shí)間1 h、乳化溫度50℃、乳化劑用量為5%.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1_The_o_r_t_h_o_g_o_n_a_l_ e_x_p_e_r_i_m_e_n_t_a_l_ f_a_c_t_o_r_-level table

2.3 樣品表征

對最佳制備條件合成的左氧氟沙星磁性明膠微球進(jìn)行表征.紅外表征采用KBr壓片法對磁性微球進(jìn)行全波段掃描（4 000～400 cm-1）；采用X射線衍射儀（XRD）對磁性載藥微球進(jìn)行分析時(shí)，測定電壓為36 k V，電流為20 m A，Co靶，波長為1.540 65 nm，掃描范圍2θ=10°～80°.激光粒度分析儀測量磁性載藥微球粒徑時(shí)，用無水乙醇作分散介質(zhì).樣品微球粉末噴金后掃描電鏡觀察微球形貌.

2.4 左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取50 mg左氧氟沙星對照品，置于500 m L容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容.分別量取2 m L、4 m L、6 m L、8 m L、10 m L左氧氟沙星溶液加入到100 m L容量瓶中，用蒸餾水定容.在紫外波長為290 nm處分別測定左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度.以蒸餾水為空白樣，測定樣品的吸收度（A），得到左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線方程為：A=0.069 6C+0.019 3，R2=0.999 2.

2.5 藥物微球的包封率和載藥量的測定

稱取適量左氧氟磁性明膠微球樣品于100 m L量瓶中，加蒸餾水定容，50℃超聲30 min.用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液在290 nm處檢測吸光度.按照以下公式計(jì)算微球載藥量和色封率：載藥量=微球含藥量/微球質(zhì)量，包封率=微球含藥量/投藥量.

2.6 磁性明膠微球的體外釋放

采用動(dòng)態(tài)透析法測定.稱取最佳制備條件合成的磁性明膠藥物微球50 mg各3份，單獨(dú)置于透析袋內(nèi)，再分別加入p H=7.4磷酸鹽緩沖液、人工腸液、人工胃液含5.0 m L.透析袋外分別為磷酸鹽緩沖液、人工腸液、人工胃液各250 m L，置于37±0.5℃恒溫水浴中，磁力攪拌，每隔30 min取10 m L液體進(jìn)行藥物含量測定，每次取樣后立即補(bǔ)充10 m L對應(yīng)液體.

3 結(jié)果與討論

3.1 左氧氟沙星磁性明膠微球制備的工藝條件

左氧氟沙星磁性明膠微球的正交設(shè)計(jì)結(jié)果及其方差分析見表2和表3.表2顯示，各因素對磁性明膠微球合成的影響大小依次為B＞A＞D＞C，B因素左氧氟沙星明膠比值的影響最大，其次因素A明膠濃度，C因素水油比影響最小.表3顯示，因素B和A是影響載藥量和包封率的重要因素，對磁性明膠微球的制備工藝有較大影響.綜合各因素K值得出磁性明膠微球最佳制備工藝條件為A3B1C2D3，即明膠濃度15%，左氧氟沙星明膠比1∶2，水油比1∶5，戊二醛用量3.6 m L.按照最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，制得3批磁性明膠微球，其平均載藥量為51.36%，平均包封率為8.89%.

表2 磁性載藥微球正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2_The orthogonal experimental result_s_ o_f__ m__a_g_n_et_i_c__ d_r_u_g_ loaded microspheres

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3_The variance analysis of orth________________________ogonal experimental results

3.2 左氧氟沙星磁性明膠微球的體外釋放特征

最佳條件下制備的左氧氟沙星磁性明膠微球在磷酸鹽緩沖溶液、人工胃液和人工腸液中的累積釋放曲線如圖1所示.

Fig. 1 Thein vitro release of magnetic drug-loaded m icrospheres

相應(yīng)的釋放曲線擬合方程見表4.結(jié)果表明磁性明膠微球釋放行為符合一級動(dòng)力學(xué)方程.磁性載藥微球表面的藥物溶解及擴(kuò)散造成藥物的突釋，在人工胃液中的突釋大于在人工腸液和磷酸鹽緩沖溶液中的突釋，可能是因?yàn)槿斯の敢褐衟 H值低，引起了明膠微球結(jié)構(gòu)的降解，而后隨著明膠的溶脹，釋藥趨于平緩.微球5 h體外累積釋藥百分率人工腸液中大于64%，磷酸鹽緩沖溶液中大于55%，人工胃液中大于72%，表明微球具有較好的緩釋性能.7 h后藥物釋放達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài).根據(jù)《中國藥典》2010版二部中對緩控釋制劑的指導(dǎo)原則［2］，本實(shí)驗(yàn)制備的載藥微球具有較好的緩控釋作用.

表4 釋放曲線擬合方程Table 4 The release curve fitting equation

3.3 左氧氟沙星磁性明膠微球的紅外光譜分析

最佳條件下制備的左氧氟沙星磁性明膠微球、左氧氟沙星及空白明膠微球的紅外譜圖見圖2.結(jié)果顯示，3 300～3 400 cm-1為左氧氟沙星的-OH的伸縮振動(dòng)，870 cm-1為左氧氟沙星的苯環(huán)上單取代的特征吸收峰，2 862～2 972 cm-1為-CH3的伸縮振動(dòng)，1 680～1 690 cm-1為芳酮類羰基的伸縮振動(dòng).同時(shí)左氧氟沙星和明膠的部分振動(dòng)峰發(fā)生重合，大部分的振動(dòng)峰雖然存在，但可能由于與Fe3O4微粒發(fā)生吸附作用，對左氧氟沙星和明膠的振動(dòng)產(chǎn)生一定的束縛作用，使二者的振動(dòng)強(qiáng)度減弱，峰值減小，大多成為弱而寬的肩峰，由此推斷出左氧氟沙星已經(jīng)被包埋在明膠中，且左氧氟沙星化學(xué)結(jié)構(gòu)并未改變.

Fig. 2 The IR spectrum of m icrospheres

3.4 左氧氟沙星磁性明膠微球的外貌分析

圖3是最佳條件下制備的左氧氟沙星磁性明膠微球的粒徑分布圖.由粒徑分布圖可知，微球d（0.1）為3.086μm，d（0.5）為12.910μm，d（0.9）為24.911μm，微球粒徑跨度比較小，分布均勻.相應(yīng)微球的電鏡掃描結(jié)果如圖4，顯示微球分散均勻，表面無粘連，成球圓整，色澤均勻，流動(dòng)性好.

Fig. 3 The size distribution of magnetic drug-loaded m icrospheres

Fig. 4 Scanning electron m icroscope of m agnetic drug-loaded m icrospheres

3.5 左氧氟沙星磁性明膠微球XRD分析

圖5為左氧氟沙星磁性明膠微球的XRD圖，結(jié)果顯示，磁性明膠微球中的Fe3O4微粒的主要晶面衍射峰110、220、311、400、422、511、440都清晰可見，說明膠微球中包裹進(jìn)了Fe3O4微粒，并未改變Fe3O4微粒的晶體結(jié)構(gòu).

Fig. 5 X-ray diffraction of m agnetic drug-loaded m icrospheres

4 結(jié)論

本文采用乳化交聯(lián)法合成了左氧氟沙星磁性明膠微球，通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了磁性明膠微球制備的最佳工藝條件，即明膠濃度15%、左氧氟沙星明膠比1∶2、水油比1∶5、戊二醛用量3.6 m L，此時(shí)包封率為8.89%，載藥量為51.36%.XRD和紅外表征提示左氧氟沙星和Fe3O4被明膠包埋，掃描電鏡和粒度分析表明合成的微球成球性好，粒徑分布均勻.磁性藥物微球在人工胃液、人工腸液和磷酸鹽緩沖溶液中的釋放曲線符合一級動(dòng)力學(xué)方程，微球5 h體外累積釋藥百分率在人工腸液中大于64%，人工胃液中大于72%，表明載藥微球具有較好的緩釋性能.本文為左氧氟沙星新劑型開發(fā)及緩釋控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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A Study on Preparation and Sustained Release Properties of Levofloxacin Magnetic Gelatin Microspheres

XU Mengqiu2，LIN Jie2，HU Jingya2，YIN Qianqian2，ZHANG Minyu2，DU LiXiao2，LI Jingfen2，GUO Yuhua1
（1.School of Engineering，Huzhou University，Huzhou 313000，China；2.School of Life Science，Huzhou University，Huzhou 313000，China）

The preparation and sustained release properties of the levofloxacin magnetic gelatin microspheres have been studied by using the emulsion-crosslinking.The effects of the factors such as the ratio of levofloxacin to gelatin，water/oil ratio，concentration of gelatin and glutaraldehyde were discussed.The optimal synthesis process was optimized by orthogonal experiment，and the release characteristics of levofloxacin magnetic gelatin microspheres were determined by dynamic dialysis method.The morphology and particle size of microspheres and the details of Fe3O4and levofloxacin embedding in gelatin were investigated.The results show that the optimum preparation conditions of levofloxacin magnetic gelatin microspheres are as follows：gelatin concentration is 15%，the ratio of levofloxacin to gelatin is 1∶2，water/oil ratio is 1∶5，and the amount of glutaraldehyde is 3.6 m L.At the same time，the encapsulation efficiency and drug loading are 8.89%and 51.36%，respectively.The in vitro accumulatived release amount of microspheres are 64%in artificial intestinal juice and 72%in artificial gastric juice for 5 h，respectively，indicating that the drug microspheres has a good sustained release performance，and the release process follows the first-order kinetic equation.The magnetic gelatin microspheres has good sphericity and uniformity，and Fe3O4and levofloxacin are embedded in the gelatin.

levofloxacin；gelatin；magnetic microspheres；sustained release

R927.2

A

1009-1734（2016）04-0046-06

［責(zé)任編輯 邵圣文］

2016-02-10

浙江省大學(xué)生新苗人才計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014R425003）；浙江省自然科學(xué)基金（Y12H300003）；2015年湖州師范學(xué)院“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”項(xiàng)目.

郭玉華，副教授，研究方向：藥物緩釋材料研究.E-mail：hzsfxyguoyh@163.com