獸用青霉素鉀(鈉)含量的非隨行標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜測定法

陳錫龍

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州 貴陽 550003)

獸用青霉素鉀(鈉)含量的非隨行標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜測定法

陳錫龍

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州 貴陽 550003)

為解決實踐中檢測青霉素鉀(鈉)樣本數(shù)量多，次數(shù)頻繁，需耗費大量的標(biāo)準(zhǔn)品造成資源浪費問題，建立獸用青霉素鉀(鈉)含量的非隨行標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜測定法。以C18為固定相，0.5 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值到3.5)：醇：水=10：30：60為流動相A，0.5 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值到3.5)：甲醇：水=10：50：40為流動相B，A：B=30：70，流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為225 nm。采用外標(biāo)法定量計算含量。青霉素的線性范圍為 20～1 000 μg/mL，回歸方程為 Area=5.790 4 × Amt－30.007(n=5)，相關(guān)系數(shù)大于0.999。在不更換色譜柱的情況下，使用該方法可以僅采集1次標(biāo)準(zhǔn)溶液的數(shù)據(jù)就能夠?qū)Σ煌瑫r間測量的青霉素樣品進行定量，從而可以節(jié)約大量的檢測成本。

青霉素鉀(鈉);含量;非隨行標(biāo)準(zhǔn);高效液相色譜;測定

目前，檢測機構(gòu)在使用高效液相色譜法測定化合物的含量時，幾乎都是使用隨行(或同行)標(biāo)準(zhǔn)來對其進行定性和定量。所謂定性和定量分析中的隨行(或同行)標(biāo)準(zhǔn)，以下簡稱隨行標(biāo)準(zhǔn)，就是在運行樣品的同時，也運行一組已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過比較未知樣品色譜峰和標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰之間的相對保留時間和峰面積的對應(yīng)關(guān)系，從而達到對未知樣品進行定性和定量的目的。隨行標(biāo)準(zhǔn)分析方法似乎只是行業(yè)內(nèi)一個約定俗成的慣例，其依據(jù)可能主要是進行定性定量時要求色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)樣品相同［1～3］。隨行標(biāo)準(zhǔn)無疑能夠滿足這一條件，且有利于提高定性和定量的準(zhǔn)確性及精度，但是它也有非常明顯的缺點，就是需要耗費比較多的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。因為許多標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在溶液狀態(tài)下極不穩(wěn)定，無法配成標(biāo)準(zhǔn)貯備液連續(xù)使用并保存較長的時間，檢測結(jié)束之后標(biāo)準(zhǔn)溶液必須廢棄。而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價格昂貴，不僅在經(jīng)濟上是一個負擔(dān)，對資源而言也是一種浪費，為此，提出了非隨行標(biāo)準(zhǔn)測定化合物含量的概念，其假設(shè)前提為:在分析條件一定的條件下，標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品中待測組分的響應(yīng)因子相同［4］。分析條件包括:同一臺高效液相色譜儀，同一根色譜柱，相同的流動相比例，相同的柱溫，相同的流速，相同的檢測波長，相同進樣體積，以及同一檢測器且其靈敏度和響應(yīng)正常等。提出非隨行標(biāo)準(zhǔn)檢測概念的目的，在于探討使用已采集的標(biāo)準(zhǔn)溶液的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)對不同時間檢測的待測組分進行定性和定量的可行性，有效降低檢測成本。非隨行標(biāo)準(zhǔn)檢測方法要求儀器必須具有良好的穩(wěn)定性，否則標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品的響應(yīng)因子不相等，就無法進行準(zhǔn)確定量［4］，同時也要求儀器具備極佳的重復(fù)性才能夠準(zhǔn)確定性。隨著高效液相色譜儀生產(chǎn)技術(shù)水平的提高，目前絕大多數(shù)商用高效液相色譜儀均具有良好的穩(wěn)定性，可以滿足非隨行標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)的要求。高效液相色譜儀由于使用了高壓輸流泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器，實現(xiàn)了對樣品的高速高效和高靈敏度的分離檢測;使用六通閥進樣裝置可以保證進樣的準(zhǔn)確性和良好的重現(xiàn)性;自動進樣器的使用可以連續(xù)調(diào)節(jié)進樣量，進樣重復(fù)性高［5］。

青霉素含量測定的方法文獻報道比較多，有酸堿滴定法、碘量法、汞量法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等。其中高效液相色譜法能較好地分離供試品中可能存在的降解產(chǎn)物、未除盡的原料及中間體等雜質(zhì)而準(zhǔn)確定量，具有快速、高效、選擇性強、重現(xiàn)性好等特點［6］。選擇青霉素作為研究對象，主要是青霉素的水溶液不穩(wěn)定［7］，且在檢測實踐中檢品特別是青霉素鉀(鈉)數(shù)量比較多，檢測較為頻繁，需要耗費的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量巨大，資源浪費問題突出，有建立非隨行標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)的必要性和緊迫性。用非隨行標(biāo)準(zhǔn)檢測方法對青霉素這類在溶液狀態(tài)下不穩(wěn)定的化合物具有可行性的話，那么該方法對于其他大多數(shù)較為穩(wěn)定的化合物更應(yīng)具有可行性，從而也具有較為廣闊的推廣應(yīng)用前景和價值。

1 材料和方法

1.1 儀器和試藥 Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，BP211D型電子分析天平(德國塞多利斯公司)，青霉素對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號:K0251006，含量：92.2%)，試驗樣品青霉素鉀(上海公誼獸藥廠，批號:140608;北京賽孚制藥股份有限公司，批號:150101;江西省和光藥業(yè)有限公司，批號:20141019)，甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色 譜 條 件［8，9］: 色 譜 柱:Zorbax SB C18(5 μm 4.6 × 250 mm，PN:880975－902，SN:USCL047272，LN:B12254)，柱溫為 30 ℃，流動相，0.5 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值到3.5)：甲醇：水=10：30：60為流動相A，0.5 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值到3.5)：甲醇：水=10：50：40為流動相B，A：B=30：70;流速為1.0 mL/min;檢測波長為225 nm;進樣體積為 10 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備:精密稱取青霉素對照品50 mg，置50 mL量瓶中，加水20 mL溶解，再加入0.01 mol/L KOH 0.5 mL 使溶液呈極微弱堿性，最后加水稀釋并定容至刻度，混勻，即得濃度約為1.0 mg/mL的青霉素對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備:精密稱取青霉素樣品100 mg，置100 mL量瓶中，加水50 mL溶解，再加入0.01 mol/L KOH 1.0 mL 使溶液呈極微弱堿性，最后加水稀釋并定容至刻度，混勻，即得濃度約為1.0 mg/mL的青霉素供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖 按上述色譜條件，精密量取青霉素對照品溶液和供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 青霉素色譜圖

2.2 線性范圍 精密量取1.0 mg/mL青霉素對照品溶液適量，分別置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得含青霉素濃度分別為 20、100、200、500、1 000 μg/mL的對照溶液系列。精密吸取各對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。青霉素濃度在20～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰有良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Area=5.790 4 × Amt－30.007，相關(guān)系數(shù)等于0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表1。

表1 青霉素對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

2.3 方法精密度 比較5批分別于不同日期測量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間及單位濃度峰面積(每批2個平行，每個平行進樣各2針)，結(jié)果表明非隨行標(biāo)準(zhǔn)檢測方法具有良好的精密度，特別是單位濃度峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.5%［10］，滿足高效液相色譜檢測方法對含量穩(wěn)定性的要求。結(jié)果見表2。

表2 方法精密度測量結(jié)果

2.4 室溫下青霉素溶液的水解情況 取青霉素對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解后分別于0、10、20、40 h測定含量，計算單位濃度峰面積，結(jié)果:10、20、40 h單位濃度峰面積分別下降了2.16%、5.83%、36.47%。說明青霉素水溶液在24 h內(nèi)相對穩(wěn)定，其輕微水解及嚴(yán)重水解的色譜圖見圖2。

圖2 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液水解后的色譜圖

2.5 微量酸堿對青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液降解情況的影響

分別取青霉素標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置100 mL容量瓶中，加一定量(約20 mL)的水溶解，再分別加濃度為0.01 mol/L的HCL或KOH溶液各1.00 mL，然后加水定容至刻度。立即上機測定，結(jié)果表明，加入少量酸堿的青霉素均會有分解。其中，加酸的青霉素含量下降約3.10%，且在相對保留時間約0.33處有一個很明顯的較大的異物峰;而加堿的青霉素含量下降約1.10%，在相對保留時間約0.53處會出現(xiàn)1個較小的雜質(zhì)峰。同時，加酸的青霉素會隨著時間的推移加速分解，而加堿的青霉素含量在較長時間內(nèi)則會保持在相對穩(wěn)定的水平。另取3份樣品，分別加堿處理后測定其單位濃度峰面積，約26 h再分別測定其單位濃度峰面積，結(jié)果，后者的單位濃度峰面積平均降低了1.89%。結(jié)果表明，青霉素在弱堿性溶液中24 h內(nèi)有比較好的穩(wěn)定性。加酸或加堿處理后的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖3。

圖3 加酸或加堿處理后的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.6 處理樣品時水溫對青霉素含量的影響 實驗表明，用不同溫度的少量水處理樣品后，其含量測定結(jié)果也顯示出一定的差別。實驗時分別加1 mL 15、25、35、45、55℃的水溶解某一青霉素樣品，然后立即加入室溫下的蒸餾水稀釋并定容后上機測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，35、45、55℃的水溶解的樣品其含量有比較明顯的偏高，分別為106.9%、113.1%、105.1%，但45℃的水溶解的樣品含量高得更多。

2.7 不同的流動相配制方法對青霉素保留時間的影響 第一種方法是先取100 mL pH=3.5的0.5 mol/L磷酸二氫鉀溶液置1 000 mL容量中，然后加入300 mL甲醇(流動相A)，或500 mL甲醇(流動相B)，充分混勻后再加水定容至刻度，簡稱加水定容法;第二種方法是先取100 mL pH=3.5的0.5 mol/mL磷酸二氫鉀溶液置1 000 mL容量中，然后加入600 mL水(流動相A)，或400 mL水(流動相B)，然后再加甲醇，充分混勻后加甲醇定容至刻度，簡稱加醇定容法;第三種方法是分別用量筒準(zhǔn)確量取磷酸二氫鉀溶液、甲醇和水，然后再將三者混勻，簡稱混容法。分別按A∶B=30∶70的比例注入流動相，待基線平穩(wěn)后分別運行青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果加水定容法青霉素色譜峰的保留時間約為14 min，加醇定容法為10 min，混容法則為12 min。原因主要是甲醇與水混合后，溶液的總體積會縮小，第一種配制法相當(dāng)于增加了水相的比例，所以保留時間增加，第二法則相當(dāng)于增加了有機相的比例，故保留時間減少。

2.8 青霉素溶液的降解規(guī)律 實驗時，配制1份含青霉素為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液并上機測定，每30 min進樣1針，連續(xù)進樣30次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一針進樣的峰面積最大，以后各針的峰面積基本呈現(xiàn)遞減的趨勢，但并非是勻速的遞減，而是先快后慢?；旧鲜菢悠啡芙夂蟮那?～5 h內(nèi)會下降快一些，以后則相對穩(wěn)定。結(jié)合上述2.4的結(jié)果，可以認為室溫條件下，青霉素溶液的分解在24 h之內(nèi)是一個比較緩慢且呈現(xiàn)出先快后慢并逐漸趨于相對平穩(wěn)的過程。青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積隨測量時間變化情況見表3。

表3 青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積隨測量時間變化

2.9 方法的應(yīng)用 取3批注射用青霉素鉀樣品，按上述含量測定方法處理后測定其含量，結(jié)果分別為99.4%、98.8%和100.2%。

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的優(yōu)化?！吨腥A人民共和國獸藥典》中流動相 A∶B=70∶30，流速為 1.0 mL/min。以該色譜條件運行樣品時，發(fā)現(xiàn)青霉素的出峰時間比較晚，運行一種樣品大約需要40 min，把A∶B的比例調(diào)整為30∶70后，出峰時間為12 min左右，建議使用250 mm的C18柱檢測時把流動相調(diào)整為A∶B=30∶70比較恰當(dāng)。

3.2 樣品及對照品溶液處理方法的優(yōu)化。《中華人民共和國獸藥典》和《中華人民共和國藥典》中對青霉素樣品及對照品的處理均是直接加水溶解并定容，但是由于青霉素在水溶液中不穩(wěn)定，易分解，同時容易受到水中少量碳酸(來源于空氣中的CO2)、容器中殘留的酸堿(如洗滌劑)以及青霉素水解造成的含量下降等的影響，處理樣品時可加入少量0.01 mol/L的KOH溶液，利于保持樣品的穩(wěn)定性。另外，容器中殘留的少量水分及樣品溶解不充分和及時可能導(dǎo)致青霉素溶解過程中產(chǎn)熱不均從而造成樣品局部溫度不一致使含量測定出現(xiàn)偏差，稱樣時應(yīng)注意保持容器干燥，溶解樣品時應(yīng)迅速及時。檢驗中，如果多次出現(xiàn)青霉素干燥品含量超過101.0%的情況，可考慮是由于標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品在處理過程中分別受到了少量碳酸和殘留堿性洗滌劑的影響;如果樣品平行不好，則可能是稱樣時容器未完全干燥或有殘留酸堿物質(zhì)以及樣品溶解不迅速及時所致。

3.3 非隨行標(biāo)準(zhǔn)含量測定法的要點是要保證色譜條件的一致性，色譜條件任何細微的變動均可能帶來較大的偏差，容易導(dǎo)致定性上產(chǎn)生誤判和定量上出現(xiàn)較大偏差。因此，采用非隨行標(biāo)準(zhǔn)法測定含量時，要確保流動相配制、柱溫、流速等保持一致。同時，應(yīng)隨時監(jiān)測檢測器的靈敏度和響應(yīng)情況、色譜柱的柱效變化，并定期重新校正標(biāo)準(zhǔn)曲線。建議把非隨行標(biāo)準(zhǔn)檢測中，標(biāo)準(zhǔn)樣品雙樣雙平行首末次測量結(jié)果單位濃度峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.5%，作為判斷是否需要重新校正標(biāo)準(zhǔn)曲線的依據(jù)，并以此作為判斷儀器穩(wěn)定性是否能夠滿足測量要求的標(biāo)準(zhǔn)。即只要有一種可信的方法證明儀器的穩(wěn)定性滿足要求，在此期間建立的所有非隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線均無需重新校正。需要強調(diào)的是更換色譜柱后應(yīng)重新采集標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)并制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線，原因是同一類型的色譜柱，會由于生產(chǎn)廠家和生產(chǎn)批號不同而表現(xiàn)出不同的色譜分離特性［11］，也即響應(yīng)因子已經(jīng)不一樣了。

3.4 因青霉素溶液水解過程緩慢且有一定規(guī)律可循，故在使用《中華人民共和國獸藥典》中的方法檢測數(shù)量較多的青霉素樣品時，為避免因水解產(chǎn)生的測量偏差，應(yīng)注意適時重新運行標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液或插入質(zhì)控樣品，建議插入質(zhì)控樣品或重新運行標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的間隔時間為3、6、6 h，并保證全部樣品在24 h內(nèi)檢測完畢。這里的時間間隔從樣品處理結(jié)束后立即上機測定時開始計算。當(dāng)然，也可以酌情對樣品進行分批處理和檢測。

3.5 采用非隨行標(biāo)準(zhǔn)方法進行測量時，由于色譜條件不可能完全一致，如不同時間配制的流動相其組成可能存在細微的差別，因而不可避免地會出現(xiàn)保留時間產(chǎn)生一定漂移的情況，雖然保留時間在一定范圍內(nèi)發(fā)生漂移對含量產(chǎn)生的影響可以忽略不計，但是定性的準(zhǔn)確性會受到懷疑。因此，測量時最好插入已經(jīng)準(zhǔn)確定性的留存樣品作為質(zhì)控樣品輔助定性，或者檢測時使用二極管陣列檢測器通過紫外光譜圖進行定性。其次，色譜柱多次進樣后會受到樣品基質(zhì)污染使柱效下降，此時應(yīng)及時對色譜柱進行清潔和再生，以免影響含量測定的準(zhǔn)確性。如果含量測量結(jié)果偏低同時又屬于邊緣數(shù)據(jù)時，應(yīng)使用同行標(biāo)準(zhǔn)方法進行仲裁確認。

3.6 本研究建立了獸用青霉素鉀(鈉)含量的非隨行標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜測定法，實驗數(shù)據(jù)表明，本方法簡單，精密度高，重現(xiàn)性好，能夠有效控制獸用青霉素鉀(鈉)的質(zhì)量，特別適合獸藥生產(chǎn)企業(yè)進行內(nèi)部質(zhì)量控制，并可通過減少對標(biāo)準(zhǔn)品的使用有效降低檢測成本，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景和價值。

［1］汪正范.色譜定性與定量(第二版)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

［2］陳智棟，何明陽.化工分析技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.160.

［3］符斌，李華昌.分析化學(xué)實驗室手冊［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2012.116.

［4］安捷倫科技(中國)有限公司.Agilent HPLC化學(xué)工作站標(biāo)準(zhǔn)操作培訓(xùn)教材［M］.203～206.

［5］于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用(第二版)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.12～28.

［6］王炳強，張正兢.藥物分析與檢驗技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005，206～208.

［7］張嬡，黃利平，樊海斌.高效液相色譜法測定青霉素鈉的含量［J］.中國獸藥雜志，2001，35(4):27～28.

［8］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典(二部)［S］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.119～122.

［9］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015.596～600.

［10］中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.獸藥檢驗操作規(guī)程.2005.88.

［11］于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用(第二版)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.80.

Asynchronous Standard Determination of Content of Veterinary Benzylpenicillin Sodium or Potassium by HPLC

Chen Xilong
(Guizhou Provincial Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feeds，Guiyang Guizhou 550003，China)

An HPLC method has been developed to determine the content of Veterinary Benzylpenicillin Sodium or Potassium through data of it’s sample and standard acquired asynchronously，using C18column as stationary phase，with a mobile phase of A：B=30：70(A：solution of 0.5 mol/L potassium dihydrogen phosphate with pH adjusted to 3.5 by phosphoric acid：methanol：water=10：30：60，and B：solution of 0.5 mol/L potassium dihydrogen phosphate with pH adjusted to 3.5 by phosphoric acid：Methanol：water=10：50：40)，flow rate of 1.0 mL/min，column temperature of 30 degree Celsius，and wavelength of 225 nm.It was quantified by external standard method and the linear range of Benzylpenicillin was between 20 and 1 000 μg/mL.And the regression equation was Area=5.790 4 × Amt－30.007 with the correlation to be more than 0.999.It could be used for determining content of Benzylpenicillin Sodium or Potassium through standard data acquired only once with the same column so that can cut a plenty of costs during testing for much less use of standard substance.

Benzylpenicillin Potassium;Benzylpenicillin Sodium;Content;Asynchronous Standard;HPLC;Determination

S859.79+6

A

1007－1474(2016)01－0014－06

2015－10－19

陳錫龍(1969—)，男，高級獸醫(yī)師，貴州省畜牧獸醫(yī)學(xué)會理事，從事獸藥質(zhì)量檢驗檢測及相關(guān)研究工作。

E －mail:cxlofyjs@163.com