不同稀釋液對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

吳大江，王家海，張 彬，張 勛

(1.貴州省習(xí)水縣農(nóng)牧局，貴州 習(xí)水 552200;2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025;3.貴州省盤縣草地畜牧業(yè)發(fā)展中心，貴州 盤縣 553500)

不同稀釋液對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

吳大江1，王家海2，張 彬2，張 勛3*

(1.貴州省習(xí)水縣農(nóng)牧局，貴州 習(xí)水 552200;2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025;3.貴州省盤縣草地畜牧業(yè)發(fā)展中心，貴州 盤縣 553500)

試驗(yàn)利用北京信邦稀釋液(試驗(yàn)Ⅰ組)和臺(tái)灣精旺稀釋液(試驗(yàn)Ⅱ組)對(duì)豬精液進(jìn)行常溫保存，測(cè)定精子活率、有效存活時(shí)間、生存指數(shù)、pH值。試驗(yàn)結(jié)果:試驗(yàn)Ⅱ組稀釋后第4天，精液的pH值顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ組的精液pH值始終高于試驗(yàn)Ⅰ組;試驗(yàn)Ⅱ組稀釋后精子活率在第4天顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ組精子的有效存活時(shí)間與試驗(yàn)Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)Ⅱ組采用的臺(tái)灣精旺稀釋液更有利于精液的保存，適宜大規(guī)模推廣應(yīng)用。

豬精液;稀釋液;效果

豬的人工授精技術(shù)不僅可提高優(yōu)良公豬的利用價(jià)值，改善商品豬的質(zhì)量，提高母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，而且可以降低生產(chǎn)成本，減少生殖道疾病的傳播，從而提高養(yǎng)豬生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益［1］。與冷凍精液相比，常溫液態(tài)保存的精液具有受胎率高、窩產(chǎn)仔數(shù)高、費(fèi)用低、操作程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此，常溫保存更有利于提高良種公豬遺傳資源的利用率。

近年來，隨著豬人工授精技術(shù)的不斷完善，常溫保存精液在集約化、規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中的推廣與應(yīng)用愈來愈廣泛。在常溫保存時(shí)，豬精液稀釋液配方尤為關(guān)鍵，稀釋液不但能為精子補(bǔ)充能量，還能減少精子自身能量消耗，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，提高精子的受精能力。

目前豬精液常溫保存的稀釋液配方種類很多，但由于豬品種和配方的差異，部分稀釋液存在效果不穩(wěn)定、成本高、母豬的受胎率較低、產(chǎn)仔數(shù)少等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了豬人工授精技術(shù)的推廣。為探討不同精液常溫保存液的效果，保證良種公豬精液的高效利用，試驗(yàn)選用2種目前較常用的豬精液常溫保存稀釋液對(duì)黔北黑豬的精液進(jìn)行常溫保存，分析精子活率、有效存活時(shí)間、生存指數(shù)、pH值等指標(biāo)，探討不同常溫保存稀釋液在保存期間對(duì)豬精子活力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 精液的采集:選擇3～5歲、體重100 kg左右、體質(zhì)健康、強(qiáng)壯的黔北黑豬種公豬3頭。手握法采精，收集中段濃縮部分，經(jīng)濾紙過濾后保存于保溫杯中，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)過初步檢查，選擇色澤和氣味正常，精子活率在0.8以上，密度為3×108～5×108個(gè)/mL的精液用于試驗(yàn)研究。

1.1.2 精液的稀釋和分裝:將每次采集的精液分成3份，按照2∶1的比例緩慢將等溫稀釋液加入精液中，輕輕搖晃混勻。然后用10層紗布包裹緩慢降溫5～10 min，使精液的溫度降至17℃，置于17℃精液保存箱中保存。每隔12 h搖動(dòng)精液1次，每隔24 h檢測(cè)精子活率1次，直至精子活率低于 0.50。

1.1.3 精液稀釋液的選擇:從種豬場(chǎng)常用的稀釋液中選擇性能比較穩(wěn)定、價(jià)格較低、使用效果較好的北京信邦稀釋液(pH 7.5)和臺(tái)灣精旺稀釋液(pH 7.34)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.4 主要儀器設(shè)備:恒溫冰箱、顯微鏡、精密溫度計(jì)、燒杯、精液保存袋、稀釋精液保存瓶、蓋玻片、恒溫電熱板、玻璃棒、雙蒸餾水、保溫盒、恒溫水浴鍋、原精液250 mL以上2份、輸精瓶28個(gè)、稀釋粉3種、標(biāo)簽紙40枚以上、記號(hào)筆、暫時(shí)保溫箱1個(gè)、計(jì)數(shù)板1塊、計(jì)數(shù)器等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇種豬場(chǎng)常用的北京信邦稀釋液和臺(tái)灣精旺稀釋液，測(cè)定稀釋后的精子活率、有效存活時(shí)間、生存指數(shù)、精液的pH值等。試驗(yàn)Ⅰ組采用北京信邦稀釋液，試驗(yàn)Ⅱ組采用臺(tái)灣精旺稀釋液。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 精子活率:精子活率的測(cè)定采用目測(cè)法。每隔12 h測(cè)定2種稀釋液和生理鹽水保存的精子活率。從恒溫箱中取出常溫保存精液，用移液槍吸取30 μL置于載玻片上，蓋上蓋玻片后立即在200～400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。每個(gè)樣品隨機(jī)觀察3個(gè)視野，檢測(cè)視野中直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例，求其平均值作為精子活率。

1.3.2 精子有效存活時(shí)間:精子活率不低于0.50的保存時(shí)間。

1.3.3 精子生存指數(shù):生存指數(shù)=(上次精子活率+下次精子活率)×2/間隔時(shí)間。精子生存時(shí)間越長(zhǎng)，生存指數(shù)越大，說明精子活率越強(qiáng)，品質(zhì)越好。

1.3.4 精液pH值:利用酸度儀分別檢測(cè)原精液、稀釋液以及稀釋后精液的pH值。每天檢測(cè)1次，觀察其變化規(guī)律。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 每組至少重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋液稀釋后精液pH值的變化 從表1可知，試驗(yàn)Ⅱ組稀釋后第4天，精液的pH值顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P＜0.05)。稀釋后，試驗(yàn)Ⅱ組的精液pH值始終高于試驗(yàn)Ⅰ組。原精、稀釋劑以及稀釋后精液pH值偏堿性，稀釋液的pH值隨著時(shí)間下降，最后趨于穩(wěn)定在7.11。

表1 不同常溫保存稀釋液稀釋后不同保存時(shí)間精液的pH

2.2 不同稀釋液稀釋后精子存活時(shí)間和生存指數(shù)的影響 由表2可知，試驗(yàn)Ⅱ組稀釋后精子活率在第4天顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ組精子的有效存活時(shí)間與試驗(yàn)Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05)。另外，試驗(yàn)Ⅱ組精子的生存指數(shù)高于試驗(yàn)Ⅰ組。從精子生存指數(shù)分析，試驗(yàn)Ⅱ組用的臺(tái)灣精旺稀釋液對(duì)黔北黑豬的精液常溫保存的效果較好。

表2 不同常溫保存稀釋液稀釋后對(duì)精子存活時(shí)間和生存指數(shù)的影響

3 討論

3.1 不同常溫保存稀釋液對(duì)豬精液pH值的影響

Kuster等［2］認(rèn)為弱酸環(huán)境可抑制精子的代謝和活動(dòng)，能量消耗降低，體外存活時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)。稀釋液pH值為5.5～6.5，稀釋后精液 pH 值在6.5～7.0時(shí)對(duì)延長(zhǎng)精子壽命效果顯著，弱酸環(huán)境被認(rèn)為是精液保存的理想環(huán)境。但戈新等［3］認(rèn)為，精液在保存過程中會(huì)產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，堿性稀釋液能夠中和一部分酸性物質(zhì)，防止稀釋液過酸造成精子死亡。高飛等［4］研究發(fā)現(xiàn)，為了維持精液pH值的相對(duì)穩(wěn)定，在稀釋液中添加碳酸氫鈉、檸檬酸鈉等緩沖劑可平衡精子和細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，維持精子生存環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，同樣起到保護(hù)精子的作用，更利于精子的長(zhǎng)期保存。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)Ⅱ組用的臺(tái)灣精旺稀釋液更有利于精子的保存，這可能是由于稀釋液中含有碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、TRIS等緩沖液，較好地維持了精子生存環(huán)境的穩(wěn)定，從而有利于保存精子。本研究發(fā)現(xiàn)2種稀釋液均呈弱堿性，與戈新等的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)槿鯄A性的稀釋液在稀釋精液時(shí)對(duì)精子的刺激小，更符合精子的生存環(huán)境，且在精液保存的過程中弱堿性的稀釋液可以中和精子代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物，防止精液pH值過酸造成精子死亡，延長(zhǎng)了精子保存時(shí)間，提高了精液保存效果。

3.2 不同常溫保存稀釋液對(duì)豬精子生存指數(shù)影響

在豬精液保存時(shí)，稀釋液成分對(duì)精液的保存效果至關(guān)重要。精液稀釋后不僅可以擴(kuò)大容積，還可以為精子代謝提供所需的能量物質(zhì)［5］。因此，稀釋液中含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化劑、酶和激素等各種成分，以維持或延長(zhǎng)精子活率。據(jù)報(bào)道［4］，葡萄糖能為精子提供能量，在絕大多數(shù)配方中被使用;牛血清白蛋白可以穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)，中和精子有害代謝產(chǎn)物，有效延長(zhǎng)精子保存時(shí)間，提高受精能力;乙二胺四乙酸能防止精子在保存過程中發(fā)生頂體反應(yīng)，喪失受精能力。本次試驗(yàn)選用2種不同稀釋液研究在溫度、稀釋倍數(shù)等條件相同情況下保存豬精液的效果，表明臺(tái)灣精旺稀釋液的保存效果較好，精子活率在保存5 d后還保持在0.61，且有效保存時(shí)間和生存指數(shù)均較高。這可能是因?yàn)榕_(tái)灣精旺稀釋液中含有葡萄糖、BSA、EDTA等有效成分，不僅在體外保存期間為豬精子提供能量，還可以穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)，清除精液中的有害成分，從而提高了精液的保存效果。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在黔北黑豬精液常溫保存中，臺(tái)灣精旺稀釋液的效果要優(yōu)于北京信邦稀釋液，適宜大面積推廣應(yīng)用。因影響精液常溫保存效果的因素很多，其作用機(jī)理也非常復(fù)雜，關(guān)于不同種類的稀釋液以及稀釋液中不同成分對(duì)精子的作用機(jī)理有待于進(jìn)一步探討。

［1］張守全，吳同山，李炳坤，等.人工授精與本交對(duì)引進(jìn)品種母豬繁殖表現(xiàn)的影響［J］.養(yǎng)豬，1999，(4):14～15.

［2］Kuster C E，Althouse G C.The fecundity of porcine semen stored for 2 to 6 days in Androhep and Xcelitm extenders［J］.Therigenology，1999，(52):365～376.

［3］戈新，張寶殉，王建華，等.帶精漿直接稀釋法探討豬精液低溫保存的可能性［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，(25):23～30.

［4］高飛，岳奎忠，楊增明.豬精液液態(tài)保存的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧雜志，2004，40(6):46～49.

［5］荊汝頂.豬長(zhǎng)效精液稀釋劑的研制及臨床應(yīng)用研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

Effect of Different Diluent on the Preservation of Pig Semen at Room Temperature

Wu Dajiang1，Wang Jiahai2，Zhang Bin2，Zhang Xun3*
(1.Guizhou Xishui County Agriculture and Animal Husbandry Bureau，Xishui Guizhou 552200，China;2.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;3.Panxian Grassland Animal Husbandry Development Center，Panxian Guizhou 553537，China)

This experiment using Beijing sinbon dilution(group Ⅰ)and Taiwan＇s fine Wang dilution(test group Ⅱ)on porcine semen at room temperature preservation，determination of sperm live rate，survival time and survival index and pH value.The results showed that 4 days after the experiment groupⅡ dilution，semen pH value was significantly higher than that of experiment groupⅠ (P＜ 0.05)and experiment groupⅡ of the semen pH value is always higher than that of experimental groupⅠ;experiment groupⅡdiluted sperm live rate at day 4 was significantly higher than that of groupⅠ(P ＜ 0.05)，test groupⅡ sperm effective survival time and testⅠ group，the difference was not significant(P ＞ 0.05).The results showed that the Taiwan sperm dilution solution used in the test group was more favorable for the preservation of semen，which was suitable for large－scale popularization and application.

Diluent;Pig Semen;Effect

S828.3+4

A

1007－1474(2016)01－0011－03

2015－10－13

吳大江(1970—)，男，畜牧師，主要從事畜牧工作。E －mail:207318085@qq.com

*通訊作者:E－mail:1415021447@qq.com