胚性愈傷率不同的普通小麥成熟胚生化及形態(tài)特性的差異

雒盼妮，王志成，王勇鋒，崔桂賓，張舒夢(mèng)，

?

胚性愈傷率不同的普通小麥成熟胚生化及形態(tài)特性的差異

雒盼妮1，王志成2，王勇鋒1，崔桂賓1，張舒夢(mèng)1，

楊國(guó)玉1，孫風(fēng)麗1，張 超1，劉曙東1，奚亞軍1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.隴縣種子管理站，陜西隴縣 721200)

摘要：胚性愈傷率直接決定組織培養(yǎng)中植物再生的效率。為探究胚性愈傷率誘導(dǎo)效果不同的普通小麥成熟胚之間的差異性，以根據(jù)胚性愈傷率誘導(dǎo)效果高低所取得的共10種小麥基因型的成熟胚為材料，分別對(duì)可溶性糖、可溶性蛋白、纖維素、谷胱甘肽和游離氨基酸5種生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與分析，并利用實(shí)體顯微鏡和石蠟切片的方法分別觀察10種小麥基因型成熟胚的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，兩類小麥成熟胚的可溶性蛋白和纖維素含量存在顯著性差異，而可溶性糖、谷胱甘肽和游離氨基酸含量在兩者間差異并不顯著。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，小麥成熟胚胚性愈傷率與纖維素含量存在極顯著正相關(guān)，與可溶性蛋白含量存在顯著負(fù)相關(guān)。在對(duì)外部形態(tài)進(jìn)行的觀察中，發(fā)現(xiàn)兩類小麥成熟胚的高度之間存在顯著性差異。而對(duì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行的觀察中，并未發(fā)現(xiàn)兩類小麥成熟胚之間存在顯著性差異。

關(guān)鍵詞：普通小麥；成熟胚；胚性愈傷組織；差異性

轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有打破種間隔離限制、縮短育種年限等優(yōu)點(diǎn)，在品種改良方面存在十分廣闊的應(yīng)用前景[1]。到目前為止，世界各國(guó)已成功培育了大約200多種轉(zhuǎn)基因植物，其中，棉花、大豆、油菜、玉米和馬鈴薯等一些作物的轉(zhuǎn)基因品種在生產(chǎn)上已開(kāi)始大面積推廣應(yīng)用，并且取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益[2]。小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植面積最大和分布范圍最廣的糧食作物，開(kāi)展其轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究具有十分重要的意義。目前，植物轉(zhuǎn)基因受體主要采用外植體經(jīng)脫分化得到的愈傷組織。誘導(dǎo)小麥愈傷組織的外植體包括幼胚、幼穗、花藥、成熟胚、幼葉、種子、子房、莖尖和根尖分生組織等[3-4]，其中，幼胚被認(rèn)為是十分理想的外植體材料，其愈傷組織的誘導(dǎo)率及植株的再生率均相對(duì)較高[5]。目前獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株的報(bào)道多以幼胚或幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織為受體[6]。然而，由于小麥幼胚的取材受到季節(jié)的限制，并且適當(dāng)?shù)娜〔臅r(shí)期、所取材料的狀態(tài)和發(fā)育階段的一致性很難得到保障，這在某些程度上就影響了小麥的轉(zhuǎn)基因研究。而小麥成熟胚因?yàn)槿〔姆奖?，不受生長(zhǎng)季節(jié)、發(fā)育階段等因素約束，并且不同個(gè)體間生理狀態(tài)都具有一致性，所以被認(rèn)為是進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化最為方便的外植體[7]。

在小麥成熟胚離體培養(yǎng)過(guò)程中，愈傷組織質(zhì)量特別是胚性愈傷率的高低存在較大的基因型差異。目前已有眾多報(bào)道從小麥成熟胚培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基類型、激素種類與濃度、繼代方式及次數(shù)和基因型等方面研究了小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型小麥成熟胚誘導(dǎo)的胚性愈傷率差異極為顯著，從0到67.8%不等[11]，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于成熟胚特性與胚性愈傷率是否具有相關(guān)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)本課題組研究結(jié)果挑選出胚性愈傷率高(大于43%)、低(小于10%)的兩類小麥基因型各5個(gè)[11]，分別對(duì)其成熟胚的生化指標(biāo)、外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定和觀察，探索胚性愈傷率誘導(dǎo)效果不同的小麥成熟胚之間是否存在差異，以期為小麥和其他植物組織培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料共計(jì)10份，包括CW2、90(147)-1、SQ04、9129、寶豐228、QX2、ZMD4、S534、091和西農(nóng)2208，其中，前5份(第Ⅰ類)為本研究所選的胚性愈傷率高的小麥基因型材料，胚性愈傷率分別為67.80%、46.49%、44.44%、43.93%和43.53%；后5份(第Ⅱ類)為本研究所選的胚性愈傷率低的小麥基因型材料，胚性愈傷率分別為9.55%、9.15%、8.18%、4.97%和2.33%，所有材料均于2013年6月收獲，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥分子育種課題組保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1成熟胚的獲取

取兩類共10份基因型材料的成熟種子，用刀片切取成熟胚并剔除胚乳。

1.2.2成熟胚生化指標(biāo)的測(cè)定

將成熟胚研磨過(guò)篩(40目)后，采用蒽酮硫酸法測(cè)定可溶性糖含量和纖維素含量[12]，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量[12]，DTNB法測(cè)定谷胱甘肽含量[13]，茚三酮法測(cè)定游離氨基酸含量[14]。測(cè)定每個(gè)生化指標(biāo)時(shí)，每個(gè)基因型的成熟胚稱取0.2 g(大約70個(gè)胚)，且重復(fù)3次。

1.2.3成熟胚的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

利用連續(xù)變倍實(shí)體顯微鏡SMZ1500觀察兩類小麥成熟胚的形態(tài)結(jié)構(gòu)。利用ImageJ對(duì)圖片上成熟胚的長(zhǎng)、寬、高以及面積進(jìn)行測(cè)量，所測(cè)量指標(biāo)均重復(fù)5次。

1.2.4成熟胚的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)觀察

利用石蠟切片的方法，根據(jù)小麥成熟胚的硬度將切片厚度定為8 μm，并放大40倍觀察兩類小麥成熟胚的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[15]。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和圖表的繪制，使用SPSS v19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1兩類小麥成熟胚生化指標(biāo)的差異及其與胚性愈傷率的相關(guān)性

成熟胚占小麥籽粒的1.4%～3.9%，其中含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、谷胱甘肽、不飽和脂肪酸、碳水化合物、礦物質(zhì)和纖維素等[16-17]。從表1可以看出，第Ⅱ類小麥成熟胚的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于第Ⅰ類的小麥成熟胚?？扇苄蕴呛吭趦深惓墒炫咧械淖兓瘺](méi)有明顯規(guī)律。兩類小麥成熟胚相比，纖維素含量存在顯著性差異，且第Ⅰ類的成熟胚中的纖維素含量顯著高于第Ⅱ類成熟胚。游離氨基酸含量在兩類成熟胚之間并沒(méi)有明顯規(guī)律。谷胱甘肽含量在各基因型中變化較大，在兩組成熟胚內(nèi)部各基因型之間差異比較顯著。

將各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與胚性愈傷率做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)10份材料中可溶性蛋白質(zhì)含量與胚性愈傷率呈顯著的負(fù)相關(guān)(P=0.01，P<0.05)，纖維素含量與胚性愈傷率呈極顯著的正相關(guān)(P=0.002，P<0.01)，其他生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果與胚性愈傷率的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平。

表1　10個(gè)小麥基因型成熟胚生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的多重比較

同列數(shù)字后不同字母表示不同材料間差異在0.05水平上顯著；DW表示干重。下表同

Different lower-case letters indicate significant differences among different materials at 0.05 level; DW indicates dry weight. The same as below

表2　10個(gè)小麥基因型成熟胚長(zhǎng)、寬、高和面積測(cè)定結(jié)果的多重比較

2.2兩類小麥成熟胚外部形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異

從外部形態(tài)整體觀察來(lái)看，小麥第Ⅰ類與第Ⅱ類成熟胚之間無(wú)明顯差異(圖1)。利用ImageJ對(duì)各個(gè)基因型成熟胚的長(zhǎng)、寬、高和面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)10種小麥成熟胚的長(zhǎng)、寬、高和面積之間存在顯著差異，其中，僅有成熟胚的高在兩類基因型間差異顯著(表2)。圖2是小麥成熟胚的側(cè)面觀察結(jié)果，從側(cè)面圖中可以清楚觀察到小麥成熟胚的胚芽、胚軸和胚根。由于基因型不同，成熟胚內(nèi)部的顏色也有所不同?；蛐?0(147)-1、9129、QX2、S534、091和西農(nóng)2208的成熟胚顏色偏白，其他4種基因型成熟胚的顏色偏透明。

2.3成熟胚的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)差異

從圖3中可以看出，兩類小麥成熟胚的盾片、胚芽鞘、胚芽和胚根并無(wú)明顯差異，成熟胚的細(xì)胞均表現(xiàn)致密均勻且排列有序。

比例尺長(zhǎng)度為100 μm；a～j分別表示CW2、90(147)-1、SQ04、9129、寶豐228、QX2、ZMD4、S534、091和西農(nóng)2208。圖2中同

Scale bar is 100 μm; a to j indicate CW2,90(147)-1,SQ04,9129,Baofeng 228,QX2,ZMD4,S534,091 and Xinong 2208,respectively. The same as in Fig.2

圖1小麥成熟胚實(shí)體顯微鏡觀察圖

Fig.1 Wheat mature embryos observed by steromicroscope

3討 論

在植物組織培養(yǎng)研究中，人們更多關(guān)注的是怎樣篩選合適的基因型[18-20]，或者是如何調(diào)整培養(yǎng)基基本成分[21-22]以及外源激素的種類與濃度[23-24]來(lái)獲得更多的胚性愈傷組織，而外植體的狀態(tài)關(guān)注較少。本研究對(duì)小麥成熟胚的部分生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，且利用植物顯微技術(shù)對(duì)小麥成熟胚的外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷率不同的小麥成熟胚之間存在一定差異。在白皮松的相關(guān)研究中，胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量明顯高于非胚性愈傷組織，這表明胚性愈傷組織在形成的過(guò)程中代謝十分旺盛，從培養(yǎng)基中獲得的各種成分后，將它們轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰亢图?xì)胞的組成物質(zhì)，并大量的積累蛋白質(zhì)，為后期細(xì)胞分化做好準(zhǔn)備[25]。本研究所用的愈傷組織外植體為小麥成熟胚，它的蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，占整個(gè)麥胚的26.0%～31.5%[26]，其中20%～40%屬于膜蛋白，其他的蛋白質(zhì)多以各種酶的形式存在，比如氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶和連接酶等。它們主要為種子萌發(fā)提供能量，并參與蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)折疊和構(gòu)成細(xì)胞骨架[27]。但由于基因型的不同，蛋白質(zhì)的含量也有所不同。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩類小麥成熟胚的可溶性蛋白質(zhì)含量存在顯著差異。與白皮松不同的是，小麥成熟胚的可溶性蛋白質(zhì)含量與胚性愈傷率呈負(fù)相關(guān)。不同胚性愈傷率的外植體和不同胚性愈傷組織中可溶性蛋白含量的差異，推測(cè)植物胚性愈傷組織的形成過(guò)程與可溶性蛋白可能有著重要聯(lián)系。

圖2　小麥成熟胚側(cè)面實(shí)體顯微鏡觀察圖

比例尺長(zhǎng)度為200 μm；SC：盾片；CO：胚芽鞘；PL：胚芽；RA：胚根；a～j分別表示CW2、90(147)-1、SQ04、9129、寶豐228、QX2、ZMD4、S534、091和西農(nóng)2208

Scale bar is 200 μm; SC:Sculellum; CO:Coleoptile; PL:Plumule; RA:Radical; a to j indicate CW2,90(147)-1,SQ04,9129,Baofeng 228,QX2,ZMD4,S534,091 and Xinong 2208,respectively

圖3小麥成熟胚石蠟切片放大40倍后顯微鏡觀察圖

Fig.3Paraffin section of wheat mature embryos under 40 magnifications

在愈傷組織形成和分化的過(guò)程中，谷胱甘肽可以促進(jìn)細(xì)胞分化，并與愈傷組織綠點(diǎn)形成呈現(xiàn)正相關(guān)[28]，而游離氨基酸含量與愈傷組織綠苗分化關(guān)系密切[29]。與其他作物相比，在小麥的成熟胚中谷胱甘肽和游離氨基酸的含量相對(duì)較多，它們對(duì)小麥成熟胚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性都有重要的影響[30]。測(cè)定發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷率不同的兩類小麥成熟胚的谷胱甘肽和游離氨基酸含量差異不顯著，這說(shuō)明谷胱甘肽和游離氨基酸在愈傷組織形成過(guò)程中，可能更多的是參與愈傷組織后期的形成與分化，與愈傷組織最初的形成并沒(méi)有太大關(guān)系。在小麥成熟胚中，纖維素的含量并不多，約占麥胚營(yíng)養(yǎng)成分的2.0%～4.3%[26]，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)兩類小麥成熟胚當(dāng)中纖維素含量有顯著性差異，并與胚性愈傷率呈正相關(guān)。但具體存在著怎樣的關(guān)系，尚需要進(jìn)一步的研究。

碳水化合物作為滲透調(diào)節(jié)劑對(duì)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)具有重要的作用，其中可溶性糖的積累與植物胚性愈傷組織的形成密切相關(guān)，在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，可溶性糖為胚性細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)提供充足的能源物質(zhì)[31]。在小麥成熟胚中碳水化合物含量占總營(yíng)養(yǎng)成分的35%～45%，其中糖分含量占25%左右，主要是葡萄糖和戊聚糖，還有10%左右的膳食纖維[32]。經(jīng)測(cè)定，胚性愈傷率不同的兩類小麥成熟胚可溶性糖含量差異性并不顯著，說(shuō)明小麥成熟胚作為外植體在愈傷組織形成的過(guò)程中，大部分能源物質(zhì)可能是從培養(yǎng)基中獲取，因此成熟胚中可溶性糖含量對(duì)最終小麥胚性愈傷率的差異影響并不顯著。

胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)上都存在明顯的差異，胚性愈傷組織的質(zhì)地緊密，有光澤，每個(gè)球狀體用鑷子很容易從愈傷組織上分離下來(lái)；非胚性愈傷組織質(zhì)地疏松且濕軟，常伴有粘液物質(zhì)，沒(méi)有光澤。通過(guò)石蠟切片的微觀結(jié)構(gòu)觀察能明顯觀察到胚性愈傷組織細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞質(zhì)濃厚；而非胚性愈傷組織的內(nèi)部存在大的空隙，空隙周圍愈傷組織的細(xì)胞輪廓比較明顯，可以清楚地看到細(xì)胞壁和細(xì)胞核，但是細(xì)胞質(zhì)濃度并不高[33]。通過(guò)實(shí)體顯微鏡對(duì)小麥成熟胚外部形態(tài)進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)兩類小麥成熟胚的高度之間存在顯著性差異，通過(guò)石蠟切片的方法對(duì)小麥成熟胚的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，雖然各個(gè)基因型在一定程度上存在著顯著差異，但是在兩類成熟胚之間并未發(fā)現(xiàn)有顯著差異。

4結(jié) 論

本研究對(duì)兩類不同胚性愈傷率小麥成熟胚的5種生化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)2個(gè)有差異的生化指標(biāo)，即可溶性蛋白質(zhì)和纖維素，且它們與胚性愈傷率存在著顯著相關(guān)性；對(duì)成熟胚的外觀進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)差異指標(biāo)，即成熟胚的高度。這些結(jié)果從一定程度上說(shuō)明了兩類小麥成熟胚特性具有一定差異性，為小麥和其他植物脫分化和再分化研究提供了新的數(shù)據(jù)和研究思路。

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收稿日期：2016-01-02修回日期：2016-03-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2208ZX080022003)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2015KTZDNY01-08)

通訊作者：奚亞軍(E-mail:xiyajun11@126.com)

中圖分類號(hào)：S512.1；S312

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)06-0728-08

Characteristic Differences of Mature Wheat Embryos with Different Inducing Embryonic Callus Rates

LUO Panni1,WANG Zhicheng2,WANG Yongfeng1,CUI Guibin1,ZHANG Shumeng1,YANG Guoyu1,SUN Fengli1,ZHANG Chao1,LIU Shudong1,XI Yajun1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2.Longxian Seed Management Station,Longxian,Shaanxi 721200,China)

Abstract:Efficiency of plant regeneration is directly determined by embryonic callus rate. To explore the differences between wheat mature embryos with different embryonic callus rates,ten kinds of genotypes of wheat mature embryos were chosen and five kinds of physiological and biochemical indices were measured,according to embryonic callus rates,including soluble sugar,soluble protein,cellulose,glutathione and free amino acid. External and internal structures for mature embryos of ten kinds of genotypes were observed by stereomicroscope and paraffin section method. Biochemical tests showed that there were significant differences in soluble protein and cellulose content between two types of wheat mature embryos. Other indices like contents of soluble sugar,free amino acid and glutathione had no significant difference between the two groups of mature embryos. Correlation analysis showed that the induction rates of embryonic callus had highly significantly positive correlation with cellulose contents,but significantly negative correlation with soluble protein content. In observation of the external morphology,there was significant difference between the height of two types of wheat mature embryos. However,in the observation of the internal structure,no significant difference was found between the two types of wheat mature embryos.

Key words:Triticum aestivum L.; Mature embryo; Embryonic callus; Difference

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1536.012.html

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