2015年寧夏小麥田禾谷孢囊線蟲的分布

趙 鵬，李惠霞，李健榮，徐鵬剛，堅晉卓，彭德良

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)科院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193)

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2015年寧夏小麥田禾谷孢囊線蟲的分布

趙 鵬1，李惠霞1，李健榮1，徐鵬剛1，堅晉卓1，彭德良2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)科院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193)

摘要：為明確寧夏地區(qū)小麥田孢囊線蟲分布情況及線蟲種類，2015年8月，采用z字形取樣法對寧夏5個地級市的14個縣(市/區(qū))小麥孢囊線蟲的分布與發(fā)生情況進行了調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，206份小麥根際土壤樣本中，有98份檢測出了孢囊，檢出率為47.6%。被調(diào)查的14個縣(市/區(qū))小麥田均有禾谷孢囊線蟲分布，其中固原市各縣/區(qū)禾谷孢囊線蟲的發(fā)生是首次報道。賀蘭縣的孢囊線蟲檢出率最高，達88.9%，彭陽縣的檢出率最低，為11.1%；14個縣(市/區(qū))依據(jù)孢囊線蟲檢出率的大小順序為：賀蘭縣>原州區(qū)>西吉縣>中寧縣>永寧縣>青銅峽市>平羅縣>同心縣>涇源縣>利通區(qū)>惠農(nóng)區(qū)>隆德縣>海原縣>彭陽縣。其中賀蘭縣、青銅峽市、同心縣發(fā)生最嚴重，每100 mL土樣孢囊數(shù)在 20個以上的樣品分別為5.6%、8.3%和11.1%。對所分離的主要線蟲群體進行形態(tài)學顯微觀察和測量，并對其rDNA-ITS序列進行測定和聚類分析。結(jié)果表明，來自寧夏地區(qū)的小麥田孢囊線蟲主要群體均為燕麥孢囊線蟲(Heterodera avenae)。

關(guān)鍵詞：禾谷孢囊線蟲；寧夏；發(fā)生與分布；鑒定

禾谷孢囊線蟲(cereal cyst nematode，CCN)是一種危害嚴重的全球性的禾谷類植物線蟲病害。1874年，在德國東部最早被發(fā)現(xiàn)，之后遍及歐洲、亞洲、非洲、北美洲、南美洲和大洋洲等40多個國家[1]。1989年，陳品三等[2]首次在我國湖北天門發(fā)現(xiàn)CCN危害小麥，隨后，在河南、河北、北京、內(nèi)蒙古、青海、山東、山西、陜西、寧夏、甘肅、安徽、江蘇、天津、西藏和新疆等15個省(市/自治區(qū))相繼被發(fā)現(xiàn)[3-9]。據(jù)調(diào)查，一般情況下，CCN發(fā)生可使植物減產(chǎn)20%～40%，嚴重時減產(chǎn)可達70%以上[10]。 黃文坤等[17]最早在寧夏發(fā)現(xiàn)CCN并對寧夏南部山區(qū)以北部分地區(qū)的線蟲分布做了報道，發(fā)現(xiàn)CCN發(fā)生面積達3.6 hm2。寧夏處于西北內(nèi)陸，是典型的中溫帶大陸型氣候區(qū)，干旱山區(qū)年平均降水量為400 mm，引黃灌區(qū)的平均降水量為157 mm，全年平均氣溫5.3～9.9 ℃，溫度和濕度條件都非常適合CCN的繁殖。從地域看，寧夏與發(fā)生CCN的甘肅省、陜西省和內(nèi)蒙古自治區(qū)接壤，且甘肅省和青海省地處黃河上游，通過河流灌溉及收割機跨區(qū)收割小麥會加劇CCN的傳播和蔓延，潛在為害逐年加重，一旦暴發(fā)，將對寧夏的小麥生產(chǎn)造成巨大損失。因此，本研究于2015年8月對寧夏全區(qū)小麥主要種植地區(qū)CCN的發(fā)生和分布進行了調(diào)查，并通過形態(tài)學和rDNA-ITS序列分析進行了類別鑒定，以明確寧夏小麥種植區(qū)CCN的分布現(xiàn)狀，為小麥病蟲害預(yù)防和高產(chǎn)栽培措施的制定提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1采樣點概況

寧夏位于中國西北部，北緯35°14′～39°23′,東經(jīng)104°23′～107°23′，地勢南高北低，地形南北狹長，平均海拔1 000 m以上。2015年8月份，在寧夏石嘴山市、銀川市、中衛(wèi)市、吳忠市、固原市五個地級市的14個縣(市/區(qū))采集小麥根際土壤。

1.2田間土樣采集方法

采用z字形取樣法，采集小麥根及根際的土壤。每塊小麥地塊采集20～30個點，將采集的小麥根系及土壤混合均勻后裝在塑料袋中，形成1份混合樣本。記錄采集地的經(jīng)緯度、海拔及所屬村鎮(zhèn)等信息，并對樣本進行編號。相鄰采樣點間隔的距離一般為10～20 km。

1.3孢囊的分離和計數(shù)

將混合均勻的樣本風干，從每個樣本中取100 mL土樣于塑料桶中，加水并不斷攪動，使土塊完全溶解，靜置2 min以上，沉淀后將懸浮液依次倒入26目和60目的篩網(wǎng)過濾，重復(fù)3次至桶中無漂浮的殘渣。用強水流沖洗26目篩網(wǎng)上的殘余物，使孢囊全部沖入60目的篩網(wǎng)中；小水流輕輕淋洗60目篩網(wǎng)上的殘余物于三角瓶中。將收集的懸浮液倒入裝有濾紙的三角漏斗中過濾，待濾液流盡后，將帶有孢囊的濾紙在解剖鏡下檢測孢囊數(shù)。每個樣點隨機挑取5個飽滿孢囊，擠破后檢測每個孢囊中的卵粒數(shù)。

1.4孢囊線蟲形態(tài)學鑒定

每個樣點隨機挑取5個飽滿孢囊，測量孢囊和卵的長寬；將二齡幼蟲熱殺死后制成臨時玻片，測量并觀察主要的形態(tài)特征。取部分飽滿孢囊切取陰門錐，將切下的陰門錐在無水乙醇中脫水固定后用甘油明膠制片，在顯微鏡下直接觀察并測量膜孔長寬和陰門裂長[13]。

1.5孢囊線蟲的分子鑒定

孢囊線蟲DNA的提取參照彭德良的方法[11]，-20 ℃貯藏備用。PCR擴增反應(yīng)體系(25 μL)：模板DNA 2 μL,引物各1 μL，2×DNA star mix 13 μL，ddH2O補足到25 μL，引物為TW81(5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)，AB28(5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)[14]。擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃30 s，56.7 ℃30 s，72 ℃1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，100 V，45 min；BIO-RAD成像儀觀測、照相。將擴增產(chǎn)物送至上海生工進行測序；將所得序列用Chromas、DNAMAN分析比對，并在NCBI查找已知近緣種序列，用MEGA 6中的UPGMA法構(gòu)建孢囊線蟲群體的系統(tǒng)發(fā)育樹，進行親緣關(guān)系分析。

2結(jié)果與分析

2.1CCN在寧夏不同地區(qū)的分布狀況

由表1可知，共采集到206份樣本，檢測出有孢囊的樣本98份，檢出率為47.6%。5個地級市中，孢囊檢出率最高的是銀川市，達73.3%，檢出率最低的是中寧市，為37.5%，固原市為57.9%，吳忠市為44.83%，石嘴山市為41.4%。14個縣(市/區(qū))孢囊檢出率由大到小依次為：賀蘭縣、原州區(qū)、西吉縣、中寧縣、永寧縣、青銅峽市、平羅縣、同心縣、涇源縣、利通區(qū)、惠農(nóng)區(qū)、隆德縣、海原縣、彭陽縣。賀蘭縣的孢囊檢出率最高，達88.9%，彭陽縣最低，為11.1%。其中固原市各縣/區(qū)CCN的分布狀況屬首次報道。

表1　寧夏小麥CCN在不同地區(qū)的分布

2.2CCN在寧夏不同地區(qū)的發(fā)生程度

由表2可知，寧夏14個縣(市/區(qū))CCN均有發(fā)生，不同地區(qū)小麥田的CCN發(fā)生程度不同。每100 mL土壤中平均孢囊數(shù)為5.3個，有37.2%的樣品孢囊數(shù)為1～10個，4.6%為11～20個，2.2%為21～30個。利通區(qū)、中寧縣、海原縣、原州區(qū)、涇源縣、彭陽縣等6個縣(市/區(qū))被測樣品的孢囊數(shù)均小于10個·100 mL-1土壤。檢出率最高的賀蘭縣，72.2%的樣品孢囊數(shù)在1～10個·100 mL-1土壤；樣品孢囊數(shù)為21～30個·100 mL-1土壤所占比例最大的是同心縣，為11.1%；發(fā)病地塊孢囊數(shù)為11～20個·100-1mL土壤所占比例最大是青銅峽市，為16.7%。所有樣品的孢囊數(shù)均小于30個·100 mL-1土壤。

2.3CCN的形態(tài)鑒定結(jié)果

對所分離的CCN進行形態(tài)學研究，結(jié)果顯示(圖1)，孢囊檸檬形，頸部和陰門錐明顯，呈淺褐色至深褐色。孢囊長600.5 μm(421.5～803.1 μm)；孢囊寬444.5 μm(303.9～555.1 μm)。陰門錐膜孔為雙膜孔，無下橋，陰門裂清晰可見。形態(tài)測量值分別為：陰門膜孔長43.4 μm(35.3～49.4 μm)；膜孔寬19.1 μm(16～24.4 μm)；陰門裂長11.9 μm(9.3～15.2 μm)，且陰門錐下方有較多不規(guī)則的泡狀突。二齡幼蟲都為蠕蟲形，唇區(qū)圓，與身體連接處縊縮明顯，口針強壯，中食道球發(fā)達；尾部呈錐形，有較長的透明區(qū)，其相關(guān)形態(tài)測量值為：線蟲體長536.1 μm(389.4～629.9 μm)；線蟲體寬23 μm(19.7～27.3 μm)；體長/體寬23.4(17.5～29.4)；體長/尾長9.9(6.4～15.8)；口針長20.2 μm(17.1～24.8 μm)；尾長56.2 μm(27.2～76.8 μm)；透明尾長36.8 μm(16.5～53.4 μm)。卵長124.4 μm(100.5～145.1 μm)；卵寬46.2 μm(38.2～58.1 μm)；孢囊卵量200.3粒(123～293.8粒)。根據(jù)上述形態(tài)觀測和測量值并參考陳品三[2]、Zafar[12]和王明祖等[13]對燕麥孢囊線蟲形態(tài)描述和測量值，將寧夏小麥田分離的CCN初部鑒定為燕麥孢囊線蟲(Heteroderaavenae)。

A:深褐色孢囊; B:卵; C:陰門雙膜孔; D:泡狀突; E:二齡幼蟲; F:二齡幼蟲的頭部; G:二齡幼蟲的尾部

A:Cyst; B:Eggs; C:Fenestra area; D:Ballae; E:Second-stage juvenile; F:Head of second-stage juvenile; G:Tail of second-stage juvenile

圖1 寧夏小麥孢囊線蟲部分群體的形態(tài)特征圖

Fig.1Illustration of cereal cyst nematode of populations from Ningxai

圖2　UPGMA法構(gòu)建的寧夏小麥禾谷孢囊線蟲及其近源種的rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4孢囊線蟲rDNA-ITS序列分析

將PCR產(chǎn)物測序后，得知ITS片段長度均為1 045 bp。將所得序列與NBCI的ITS序列進行Blast比對，這些序列分別包括Avenae組(澳大利亞的H.australis，中國、法國、德國、印度、以色列的H.avenae，德國的H.mani)、Schachtii組(伊朗的H.glycines，比利時的H.schachtii)、Goettingiana組(德國的H.goettingiana，荷蘭的H.cruciferae，意大利的H.carotae)和比利時的H.urticae。用MEGA6的UPGMA方法構(gòu)建ITS區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)(圖2)，所有序列聚為3個大的分支，其中本研究分離的14個燕麥孢囊線蟲與上述Avenae組的7個群體聚為一個大的分支，H.glycines和H.schachtii聚為一分支，Goettingiana組三個群體和H.urticae為一分支。在Avenae組的分支中，本研究分離的CCN與中國的H.avenae聚為一個小的分支，而其他國家的H.avenae聚在另一個分支中。

3討 論

小麥禾谷孢囊線蟲病是全球小麥生產(chǎn)的重要病害，可通過農(nóng)機具、農(nóng)事操作、水流等進行近距離傳播[15]，颶風與跨區(qū)聯(lián)合收割機收割進行遠距離傳播[16]。在地域上，寧夏回族自治區(qū)與已發(fā)現(xiàn)CCN的甘肅省、陜西省和內(nèi)蒙古自治區(qū)接壤，而甘肅省地處黃河上游，通過河流灌溉及收割機跨區(qū)收割小麥會加劇CCN在寧夏的傳播和蔓延。本研究發(fā)現(xiàn)，黃河流經(jīng)地區(qū)的CCN檢出率和孢囊量高于黃河未流經(jīng)的其他地區(qū)，如中衛(wèi)市的中寧縣和海原CCN檢出率差異顯著，這可能與黃河流經(jīng)過中寧縣有關(guān)。與黃文坤等[17]2011年對寧夏CCN分布與發(fā)生情況的調(diào)查結(jié)果相比，本研究中的CCN檢出率有所下降，這是由于近幾年寧夏大面積種植玉米，減少了小麥的種植面積，但孢囊量和平均卵量卻明顯增加，說明近幾年寧夏CCN危害程度有所增加。寧夏麥田平均孢囊密度5.3個·100 mL-1土壤，平均孢囊含卵量約200.3粒，已經(jīng)超過小麥正常生長允許的閾值。侯生英等[18]報道CCN密度每克土壤大于或等于10粒卵時造成小麥15.5%～55%的產(chǎn)量損失，并建議在線蟲種群密度大于每克土10粒卵的地區(qū)加強防范。因此對寧夏地區(qū)CCN的防治工作需要有關(guān)單位足夠重視。寧夏固原市CCN的分布屬首次提出，與其他4個地區(qū)相比較檢出率和孢囊量都較低，這可能與固原市小麥大多與馬鈴薯、玉米等作物輪作，且多為山區(qū)，不利于線蟲的傳播等因素有關(guān)。

陳品三[2]、Zafar[12]和王明祖等[13]對燕麥孢囊線蟲形態(tài)的測量值與本研究的測量數(shù)據(jù)存在略微差異，而形態(tài)描述基本一致。形態(tài)測量值差異可能是由不同地域的生態(tài)環(huán)境所致，不同的寄主也可能對群體分化有一定的影響。用UPGMA法構(gòu)建寧夏CCN及其近源種的rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，本研究中的CCN與中國的H.avenae和澳大利亞的H.australis聚為一個小的分支，揭示了他們之間具有更近的親緣關(guān)系。

小麥CCN的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、抗病品種、生物防治和化學防治等。重復(fù)使用單一的防治措施容易使病原產(chǎn)生抗性，因此應(yīng)綜合采用兩種或兩種以上的控制措施防治CCN。通過作物輪作結(jié)合其他實用保護性高效措施，不僅防治效果好，且環(huán)境風險低。

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收稿日期：2015-12-30修回日期：2016-01-26

基金項目：國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503114)；國家自然科學基金項目(31460463)

通訊作者：李惠霞(E-mail:lihx@gsau.edu.cn)

中圖分類號：S512.1；S432.4

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)06-0808-06

Distribution of Cereal Cyst Nematode in Wheat Field of Ningxia Region in 2015

ZHAO Peng,LI Huixia,LI Jianrong,XU Penggang,JIAN Jinzhuo,PENG Deliang

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education/Sino-U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pest/Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

Abstract:In order to identify the new situations distribution of the cereal cyst nematode(CCN) and nematode species in Ningxia region,a survey of the occurrence and distribution of CCN was carried out in wheat fields using Z type sampling in 14 counties of five regions of Ningxia region in China in August of 2015. 206 samples of wheat roots and soils were collected and CCN were detected in 98 samples,with the incidence rate of 47.6%. The CCN was found in the 14 counties(city/district) and the distribution of CCN in Guyuan city is first reported. The highest CCN incidence rate of 88.9% was detected in Helan county and the lowest one of 11.1% was detected in Pengyang county. The descending order of incidence rate of CCN in 14 counties was ranged as Helen county>Yangzhou region>Xiji county>Zhongning county>Yongning county>Qingtongxia city>Pingluo county>Tongxin county>Jingyuan county>Litong region>Huinong region>Longde county>Haiyuan county>Pengyang county. The higher density of CCN were detected in Helan county,Qingtongxia city and Tongxin county and the average CCN numbers over 20 per 100 mL soils were 5.6%、8.3% and 11.1%,respectively. The morphology of the CCN was observed and measured under microscope. rDNA-ITS of CCN populations were sequenced and clustered. The results showed that the populations of CCN distributed in Ningxia are all Heterodera avenae.

Key words:Cereal cyst nematode; Ningxia; Occurrence and distribution; Identification

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1549.036.html

第一作者E-mail：1554602375@qq.com