分散固相萃取-HPLC-MS/MS法測(cè)定椰汁中Y-壬內(nèi)酯

王玉健，龐道標(biāo)，梁振綱，黃惠玲，莊鵬，董存柱（.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南海口5703；2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南?？?70228）

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分散固相萃取-HPLC-MS/MS法測(cè)定椰汁中Y-壬內(nèi)酯

王玉健1，龐道標(biāo)1，梁振綱1，黃惠玲1，莊鵬1，董存柱2，*
（1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南?？?70311；2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南海口570228）

摘要：建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定椰汁中γ-壬內(nèi)酯含量的方法，對(duì)提取條件、流動(dòng)相、質(zhì)譜條件進(jìn)行了研究，并對(duì)γ-壬內(nèi)酯可能的斷裂機(jī)理進(jìn)行了推測(cè)。待測(cè)樣品直接用乙腈提取，PSA分散固相萃取，采用電噴霧離子源（ESI）、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式掃描，選擇m/z 157.1/139.1、m/z 157.1/121.1作為γ-壬內(nèi)酯的定性、定量離子對(duì)，外標(biāo)法定量。γ-壬內(nèi)酯在0.025μg/mL～0.50μg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，儀器檢出限為0.025 μg/mL，方法的檢測(cè)限為0.10mg/kg，定量限為0.40 mg/kg，添加水平為0.10、0.20、0.40 mg/kg時(shí)γ-壬內(nèi)酯的平均回收率范圍分別為92.4%～98.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.8%～7.6%（n=10）。

關(guān)鍵詞：γ-壬內(nèi)酯；椰汁；分散固相萃??；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

飽和內(nèi)酯類化合物是一類非常重要的食用香料，天然存在于各種水果中，現(xiàn)已廣泛用于各種飲料焙烤食品等食用香精的配方中［1］。γ-內(nèi)酯是γ-羥基羧酸分子內(nèi)酯化得到的一類內(nèi)酯類化合物，它們富含奶香、果香，具有留香時(shí)間長(zhǎng)、香氣圓潤(rùn)等特點(diǎn)［2］。γ-壬內(nèi)酯是γ-內(nèi)酯中的典型代表化合物［3］，具有椰子香氣，有油脂氣息［4］，可用于需有油脂氣息的香精及調(diào)味香精（例如椰子及杏仁香精）之中。雖然GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中γ-壬內(nèi)酯被認(rèn)為是一種“自我限量”的添加物，它的添加量往往受到消費(fèi)者的接受程度的控制［5-6］，一般情況下不會(huì)出現(xiàn)超量使用的問(wèn)題，但是隨著食品工業(yè)的日益發(fā)展，香精香料使用的逐漸普遍，消費(fèi)者的味蕾對(duì)于香味的識(shí)別閾值也在逐年提高，可能造成食用香精香料在使用過(guò)程中逐漸增量［7-8］，從而帶來(lái)健康隱患。因此，建立椰汁中γ-壬內(nèi)酯含量的檢測(cè)方法是很有必要的。

目前鮮見(jiàn)關(guān)于食品中γ-壬內(nèi)酯檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時(shí)定性、定量測(cè)定椰汁中γ-壬內(nèi)酯含量的方法，方法前處理簡(jiǎn)單、快速，適用性強(qiáng)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1200超高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；API 4000Q四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源）：美國(guó)ABI公司；Harvard II針泵：美國(guó)Varian公司；MS3 Basic旋渦混勻器：廣州IKA公司；Centrifuge 5810R離心機(jī)：Eppendorf公司；G-285電子天平：Mettler公司；氮吹儀：美國(guó)Caliper公司。

乙腈、甲酸為色譜純?cè)噭好绹?guó)TEDIA公司；γ-壬內(nèi)酯（純度95%）：美國(guó)ChromaDex公司；其余試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)溶液：用乙腈配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0℃～4℃避光保存。

1.2樣品處理

稱取待測(cè)樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入10mL乙腈，渦旋振蕩2min，加入4g無(wú)水硫酸鎂和10g氯化鈉，渦旋混合1min，以4000r/min離心5 min，取上清液0.5 mL于玻璃離心管中，加入50 mg PSA吸附劑，混合30 s后離心5 min，取上清液，加入0.5 mL水，渦旋混勻后過(guò)0.2 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3色譜條件

色譜柱為Accucore Phenyl-Hexyl（100 mm×3 mm i.d.，2.6μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序：0～3.0 min，10%A～90%A；3.0 min～4.0 min，保持90%A；4.0 min～4.1 min，90%A～10%A；4.1 min～7.0 min，保持10%A。流速：0.60 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

1.4質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度：500℃；離子源電壓：5 000 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮?dú)?。MRM監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓及碰撞電壓見(jiàn)表1。

表1　γ-壬內(nèi)酯的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table 1　The opimized MS/MS conditions of imazalil and pyrimethanil

2　結(jié)果與討論

2.1提取條件的選擇

乙腈作為一種通用的提取溶劑在殘留檢測(cè)方面得到廣泛的應(yīng)用，由于其對(duì)糖、蛋白質(zhì)類化合物較難提取［9-10］，對(duì)γ-壬內(nèi)酯有較高的回收率，因此本文采用乙腈作為提取試劑，以最大限度地提取椰汁中的γ-壬內(nèi)酯，并使提取液中的干擾物較少。

2.2儀器分析條件的選擇

分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液等流動(dòng)相對(duì)γ-壬內(nèi)酯的峰形和分離效果。結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物色譜峰略有拖尾。而加入0.1%甲酸有利于γ-壬內(nèi)酯的離子化，可提高靈敏度，峰形也較好。因此本文選擇以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相。

2.3質(zhì)譜條件的選擇

將γ-壬內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用流動(dòng)注射直接進(jìn)樣，通過(guò)全掃描確定化合物母離子，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子，通過(guò)優(yōu)化條件，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。通過(guò)多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）選擇相對(duì)豐度較高的離子對(duì)，確定為定性定量離子對(duì)，并優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等參數(shù)，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2.4斷裂機(jī)理推測(cè)

γ-壬內(nèi)酯分子式為C9H16O2，相對(duì)分子質(zhì)量為156.2。γ-壬內(nèi)酯可能的斷裂方式如圖1所示。

圖1　γ-壬內(nèi)酯可能的斷裂方式Fig.1　Possible fragmentation mechanism of γ-nonanolactone

即分子離子峰m/z 157重排開(kāi)環(huán)，然后脫去一個(gè)水分子，得到m/z 139的碎片離子峰；而m/z 139的碎片離子峰重排后形成六元環(huán)，再通過(guò)氫遷移重排丟失一個(gè)水分子，正電荷轉(zhuǎn)移至碳上，形成較穩(wěn)定的共軛體系，得到m/z 121的碎片峰。

圖2為γ-壬內(nèi)酯子離子全掃描質(zhì)譜圖。

圖2　γ-壬內(nèi)酯子離子全掃描質(zhì)譜圖Fig.2　Product ions full scan mass spectra of γ-nonanolactone

γ-壬內(nèi)酯母離子157.1產(chǎn)生的子離子分別為m/z 139.1、69.1、121.1、97.1，由于試劑空白在69.1有干擾，因此根據(jù)子離子的豐度，本文選擇m/z 139.1、121.1作為γ-壬內(nèi)酯的定量離子。

2.5線性關(guān)系及檢出限

以空白樣品基質(zhì)配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.025、0.050、0.075、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.0 μg/mL），并依次進(jìn)樣，分別以γ-壬內(nèi)酯的峰面積Y為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度值X為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，γ-壬內(nèi)酯在0.025 μg/mL～0.50 μg/mL范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程Y=937X（r=0.999 1）。

為檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，對(duì)相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行同日內(nèi)不同時(shí)間段10次重復(fù)進(jìn)樣，γ-壬內(nèi)酯峰面積的變異系數(shù)為1.59%，表明本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

以實(shí)際檢測(cè)時(shí)的信噪比（RSN）為3作為檢出限，儀器的檢出限為0.025 μg/mL，方法的檢測(cè)限為0.10 mg/kg，定量限為0.40 mg/kg。γ-壬內(nèi)酯及陽(yáng)性椰汁樣品MRM色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

圖3　γ-壬內(nèi)酯標(biāo)樣的MRM色譜圖Fig.3　MRM chromatogram of γ-nonanolactone standards

圖4　陽(yáng)性椰汁樣品MRM色譜圖Fig.4　MRM chromatogram of incurred positive sample

2.6回收率與精密度試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在5 g（精確至0.01 g）陰性椰汁樣品中進(jìn)行3個(gè)水平（0.10、0.20、0.40 mg/kg）、10平行的添加回收試驗(yàn)，測(cè)定后得到γ-壬內(nèi)酯的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。在試驗(yàn)條件下，3個(gè)添加水平下γ-壬內(nèi)酯的平均回收率范圍為92.4%～98.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.8%～7.6%（見(jiàn)表2）。

表2　3個(gè)添加水平下γ-壬內(nèi)酯的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）Table 2　Spiked recoveries and RSDs of γ-nonanolactone（n=10）

椰汁陰性樣品和標(biāo)準(zhǔn)添加樣品的MRM色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5　椰汁樣品中γ-壬內(nèi)酯殘留的MRM色譜圖Fig.5　MRM chromatogram of γ-nonanolactone in coconut milk

2.7實(shí)際樣品的檢測(cè)

使用本方法對(duì)10個(gè)市售椰漿和果肉椰汁樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果在其中4個(gè)樣品中檢出了γ-壬內(nèi)酯，含量分別為46.4、3.97、0.319、43.6 mg/kg。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了椰汁中γ-壬內(nèi)酯含量的測(cè)定方法，方法前處理簡(jiǎn)單、快速，操作簡(jiǎn)便易行，且準(zhǔn)確、靈敏度高，重現(xiàn)性好，檢出限低，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.026

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK153）；海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（ZDXM2014083）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360447）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（212018；313105）

作者簡(jiǎn)介：王玉?。?979—），女（漢），高級(jí)工程師，博士，研究方向：食品中有毒有害物殘留檢測(cè)。

*通信作者

收稿日期：2015-05-23

Determination of γ-Nonanolactone in Coconut Juice by Dispersive Solid Phase Extraction Coupled
with High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Yu-jian1，PANG Dao-biao1，LIANG Zhen-gang1，HUANG Hui-ling1，ZHUANG Peng1，DONG Cun-zhu2，*

（1.Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau China，Haikou 570311，Hainan，China；2.College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：A dispersive solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method with dispersive solid phase extraction was established for the determination of γnonanolactone in coconut juice.The effect of extration condition，flow phase，and tandem mass spectrometry parameters were investigated.And the possible fragmentation mechanisms of γ-nonanolactone were presumed.The sample was extracted with acetonitrile and determined under the multiple reaction monitoring（MRM）mode by employing external method.The precursor-product ion pair m/z 157.1/139.1 was selected as qualitative ions，and m/z 157.1/121.1 was selected as quantitaive ion.The calibration curve was linear in the range of 0.025 μg/mL～0.50 μg/mL.The limits of detection were 0.025 μg/mL for the instrument and 0.10 mg/kg for the method respec tively.The LOQ was 0.40 mg/kg for the method.The average recoveries of γ-nonanolactone were between 92.4%and 98.4%at spiked levels of 0.10，0.20 mg/kg and 0.40 mg/kg with relative standard derivation（RSDs）of 6.8%～7.6%（n=10）.

Key words：γ-nonanolactone；coconut juice；dispersive solid-phase extraction；high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry