畢赤酵母表達(dá)蒜酶及其體外抗氧化功能研究

韓楊，孫同韋，劉會杰，郭偉，王洪彬，劉逸寒，路福平（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

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畢赤酵母表達(dá)蒜酶及其體外抗氧化功能研究

韓楊，孫同韋，劉會杰，郭偉，王洪彬，劉逸寒，路福平*
（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

摘要：從大蒜鱗莖中克隆蒜酶基因，構(gòu)建蒜酶真核表達(dá)載體，并在畢赤酵母系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)，探討重組蒜酶的活性及其催化蒜氨酸分解產(chǎn)生蒜素的抗氧化活性。利用RT-PCR方法克隆大蒜鱗莖蒜酶基因，通過pPIC9K載體構(gòu)建pPIC9K-alliinase真核表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入畢赤酵母GS115，篩選陽性克隆，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后取發(fā)酵上清液進(jìn)行SDSPAGE分析。利用丙酮酸法檢測重組蒜酶的活性。并采用DPPH·法，分別研究有氧及無氧條件下蒜酶催化蒜氨酸分解產(chǎn)生蒜素的抗氧化活性。從大蒜中克隆出蒜酶基因，重組酶存在于畢赤酵母表達(dá)上清液中，形成糖蛋白，酶的比活力為（115.81±1.93）U/mg；無氧條件下蒜酶催化蒜氨酸分解產(chǎn)生蒜素的抗氧化能力高于有氧條件。克隆了蒜酶編碼基因，并成功實現(xiàn)在畢赤酵母中的有效表達(dá)。無氧條件下蒜酶催化蒜氨酸分解產(chǎn)生蒜素抗氧化能力比有氧條件下高，為體內(nèi)利用蒜酶和蒜氨酸制備高抗氧化能力的制劑提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蒜酶；畢赤酵母；蒜氨酸；抗氧化

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，人們對抗氧化劑的研究越來越多。眾所周知，適當(dāng)補充外源抗氧化劑，或給予能夠促使機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物恢復(fù)到一定水平的藥物，可改善衰老以及疾病的情況［1］。

大蒜（Allium sativum L.）又名胡蒜、獨蒜等，單子葉植物百合科蔥屬植物，為香辛類蔬菜。大蒜能夠增強(qiáng)人體免疫力，同時具有抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇、預(yù)防心血管疾病、降血壓等功效，這些藥用價值都是由大蒜的獨特成分蒜素（allicin）決定的。在完整的大蒜細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生蒜素的底物蒜氨酸和蒜氨酸酶（簡稱蒜酶）是分隔存在的，蒜氨酸存在于細(xì)胞質(zhì)中，蒜酶存在于液泡中。細(xì)胞受傷時，蒜酶和蒜氨酸相遇，發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸、氨以及包括蒜素在內(nèi)的含硫化合物［2-3］。蒜素相當(dāng)不穩(wěn)定，遇到光、熱或有機(jī)溶劑易轉(zhuǎn)化為其他硫化物，稱為大蒜油，研究表明，蒜素比大蒜油具有更好的抗氧化等生物活性［4］。

目前，國內(nèi)外研究思路是從鮮蒜中提取化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定的蒜氨酸及蒜酶，然后科學(xué)組方，制成蒜氨酸/蒜酶復(fù)合制劑，讓其在受體內(nèi)釋放蒜素充分發(fā)揮療效［5-10］。該研究思路減少了蒜素在外界環(huán)境中的滯留時間，對于發(fā)揮蒜素的抗氧化等藥理作用很有意義，但是溶液提取獲得的蒜酶量較低，且由于蒜酶不穩(wěn)定，在提取過程中，活性容易喪失導(dǎo)致蒜素生成能力降低［11］。

隨著大蒜生產(chǎn)和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，大蒜的抗氧化作用逐漸被人們了解和重視。本研究擬用分子生物學(xué)方法克隆蒜酶基因，在畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)重組蒜酶蛋白，對重組蒜酶進(jìn)行活性分析，并采用DPPH·法研究重組蒜酶催化蒜氨酸形成的蒜素在有氧和無氧兩種條件下的抗氧化能力，以期為進(jìn)一步開發(fā)高效能的蒜氨酸/蒜酶復(fù)合制劑在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

新鮮大蒜鱗莖：購買于天津當(dāng)?shù)厥袌?；畢赤酵母Pichia pastoris（Guillierm.）GS115、大腸桿菌DH5α、pET22b（+）載體、pPIC9K載體：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院實驗室；二苯代苦味酰基自由基（1，1-pheny-2-picrylhydrazyl，DPPH·）、Trizol試劑、PCR純化試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、Reverse Transcriptase XL反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、蒜氨酸：Takara公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1大蒜鱗莖總RNA的提取及pET22b-alliinase重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

取新鮮大蒜鱗莖于液氮中研碎，按照Trizol試劑說明書進(jìn)行總RNA的提取并進(jìn)行RT-PCR。以合成的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Genbank序列號S73324.1登錄的蒜酶序列，在其ORF框上下游設(shè)計一對引物。上游引物：5＇-CGCGGATCCGATGATCTGCCTAGTGATTTTG-3＇，含BamHI酶切位點；下游引物：5＇-CCCAAGCTTAATGAAAGGACGACGG-3＇，含HindIII酶切位點，擴(kuò)增蒜酶序列。PCR參數(shù)為95℃、5 min，94℃、40 s，55℃、45 s，72℃、1 min 30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。1%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物純化后克隆到pET22b（+）載體。并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆于37℃過夜震蕩培養(yǎng)，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.2.2pPIC9K-alliinase重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重新設(shè)計上下游引物。上游引物：5＇-CGGGAATTCATGATCTGCCTAGTGATTTTG-3＇，含EcoRI酶切位點；下游引物：5＇-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAAATGAAAGGACGACGG-3＇。含NotI酶切位點。以pET22b-alliinase為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物和pPIC9K載體分別經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切進(jìn)行連接構(gòu)建，重組質(zhì)粒pPIC9K-alliinase經(jīng)雙酶切鑒定，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.2.3重組蒜酶在畢赤酵母中的表達(dá)及其SDS-PAGE分析

接種畢赤酵母GS115于5 mL YPD培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜。取0.5 mL培養(yǎng)物接種于150 mL新鮮YPD培養(yǎng)基中，搖至吸光度OD600值為1.3～1.5。4℃，1 500 r/min，離心5 min，收集菌體細(xì)胞，用100 mL冰預(yù)冷的無菌水重懸細(xì)胞，同上離心。用50 mL 1 mol/L山梨醇溶液重懸細(xì)胞，同上離心，洗滌兩次，再用1 mL 1 mol/L山梨醇重懸細(xì)胞至終體積為1.5 mL，制得畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。混合80 μL感受態(tài)細(xì)胞與5 μg～20 μg經(jīng)SacI線性化的pPIC9K-alliinase質(zhì)粒，轉(zhuǎn)移至冰預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置5 min，電壓1 500 V，電擊6 ms～9 ms，立即加入1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液，取200 μL～600 μL溶液涂布于MD平板，30℃培養(yǎng)72 h。從MD平板上挑取單克隆分別接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，于30℃200 r/min條件下培養(yǎng)過夜，提取基因組，以alliinase上下游引物進(jìn)行PCR鑒定重組的陽性克隆。取含有alliinase基因的重組菌接種于100 mL BMMY培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min～300 r/min，培養(yǎng)至OD600值為2.0～3.0。1 500 r/min，室溫離心5 min，收集細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于30 mL BMMY培養(yǎng)基中，繼續(xù)振搖培養(yǎng)。加100%甲醇使終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，每隔24 h取樣。樣品1 500 r/min室溫離心5 min。收集上清液為粗酶液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及酶活測定。以pPIC9K空載體表達(dá)菌發(fā)酵上清為空白對照。

1.2.4蒜酶酶活分析

參考茍萍［11］的方法，繪制丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，求得回歸方程為Y=0.024 4X+0.016 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 0。酶活測定方法：1.0 mL酶液加2.0 mL 3 mmol/L蒜氨酸底物在35℃下反應(yīng)5 min，加3 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，吸取2.0 mL反應(yīng)物與0.5 mL 2，4-二硝基苯肼充分反應(yīng)后，加入5 mL 1 mol/L NaOH搖勻顯色，于520 nm測定吸光值。酶活定義為在35℃條件下，產(chǎn)生1 μg/min丙酮酸為1個活力單位（U）。

1.2.5自由基清除能力的測定

參照Brand-Williams W.［12］的方法。以下操作分別在有氧條件和無氧條件下進(jìn)行：用超純水混合蒜氨酸及重組蒜酶粗酶液，制成蒜氨酸/蒜酶混合物溶液（蒜氨酸終濃度為10 mmol/L，蒜酶粗酶液總蛋白含量為0.275 mg/mL），于37℃水浴中酶催化反應(yīng)不同時間，取1 mL樣品及4 mL濃度為0.12 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，如有沉淀在5 000 r/min條件下離心5 min。用95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液作參比，于517 nm測定吸光值。根據(jù)下式計算樣品液對DPPH·的清除率：

清除率/%=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100

式中：Ai為加樣品液后DPPH溶液的吸光值；Aj為樣品液的吸光值；Ac為未加樣品液時DPPH溶液的吸光值。

圖1　丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of pyruvic acid

2　結(jié)果

2.1蒜酶基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果及pET22b-alliinase重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

根據(jù)GenBank登錄序列，RT-PCR蒜酶產(chǎn)物大小預(yù)期為1 422 bp（堿基對），如圖2A所示，約在1 500 bp以下可見一條明顯的特異性條帶，與預(yù)期大小基本一致。將蒜酶基因連接到載體pET22b上，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α中，提取重組質(zhì)粒pET22b-alliinase，經(jīng)BamHI及HindIII雙酶切后，出現(xiàn)5 000 bp以上載體條帶及1 500 bp左右的特異性目的條帶，與預(yù)期大小基本一致，如圖2B所示。

1：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；M：1kb DNA Ladder Marker。

2.2pPIC9K-alliinase重組質(zhì)粒的鑒定

pPIC9K-alliinase重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切在1 500 bp以下出現(xiàn)一條明亮特異性條帶，如圖3所示，大小與預(yù)期基本相符，經(jīng)測序鑒定后氨基酸序列與原始序列相似性為100%。重組質(zhì)粒pPIC9K-alliinase構(gòu)建成功。

圖3　pPIC9K-alliinase重組質(zhì)粒EcoRI，NotI雙酶切鑒定電泳圖Fig.3　The agarose gel electrophoresis identification of recombinant plasmid pPIC9K-alliinase digested with EcoRI and NotI

2.3蒜酶在畢赤酵母中的表達(dá)及活性測定

取蒜酶畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)72 h上清進(jìn)行SDSPAGE分析，在7 200 u與12 654 u之間見到一條蛋白條帶，如圖4所示。

圖4　Alliinase重組蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4　SDS-PAGE analysis of solubility of recombinant alliinase

而對照組（pPIC9K空載體重組菌）在相應(yīng)位置未見明顯條帶。將不同時間誘導(dǎo)表達(dá)的重組蒜酶粗酶液進(jìn)行活性檢測，重組酶得到了有效表達(dá)，在誘導(dǎo)表達(dá)72 h后，酶的比活力達(dá)到（115.81±1.93）U/mg，如圖5所示。

圖5　不同誘導(dǎo)時間重組蒜酶的活性檢測Fig.5　AIliinase activity in different induced time

2.4體外抗氧化活性分析

蒜酶催化蒜氨酸反應(yīng)生成的蒜素，具有較高的抗氧化活性，但是蒜素容易被氧化失活。本研究分別在有氧和無氧條件下，考察了蒜氨酸/蒜酶反應(yīng)物的抗氧化活性。結(jié)果如圖6所示。

圖6　 有氧和無氧環(huán)境下蒜氨酸/蒜酶反應(yīng)物對DPPH·的清除率Fig.6　The DPPH·scavenging rate of alliin/alliinase in different environments

由圖6可以看出，蒜氨酸/蒜酶反應(yīng)物在有氧條件下的DPPH·清除能力明顯不如無氧條件下的清除能力，且隨著時間的延長兩種條件下自由基清除率都呈下降趨勢。有氧條件下，反應(yīng)物放置1 h后DPPH·清除能力為25.2%，5 h后下降到10.5%，下降幅度達(dá)到了58.3%。無氧條件下，反應(yīng)物放置1 h后DPPH·清除能力為30.3%，5 h后下降到22.7%，下降幅度為24.8%，下降速度明顯小于有氧條件下的速度。

3　討論

根據(jù)Genbank登錄的蒜酶序列（目的蛋白相對分子質(zhì)量約為5 688 u）設(shè)計引物，通過RT-PCR技術(shù)合成蒜酶基因，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。SDSPAGE檢測發(fā)現(xiàn)，表達(dá)產(chǎn)物分子量較理論相對分子質(zhì)量5 688 u的蒜酶大，而接近8 727 u（蛋白條帶在7 200 u～12 654 u之間）的表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)蛋白糖基化位點預(yù)測軟件NetNGlyc 1.0 Server分析發(fā)現(xiàn)，分泌到胞外的重組蒜酶蛋白序列中存在4個明顯的N-糖基化位點。分析可能原因是蒜酶在畢赤酵母表達(dá)過程中發(fā)生了糖基化，因此經(jīng)SDS-PAGE檢測重組蛋白的分子量高于理論分子量。

本研究中重組酵母菌表達(dá)的蒜酶，發(fā)酵液上清酶的比活力為（115.81±1.93）U/mg，高于吳曉麗等報道的重組蒜酶比活力（82.09±3.89）U/mg，但低于天然蒜酶比活力（176.49±5.06）U/mg［13］。分析原因可能是，畢赤酵母GS115非蛋白酶缺陷型宿主菌，重組蛋白受酵母自身蛋白酶降解影響導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量較低；序列中的4個糖基化位點的糖基化都可能導(dǎo)致生物活性的降低。因此今后的研究工作主要是提高重組蛋白的生物活性和表達(dá)量。

通過測定DPPH·清除能力比較了有氧和無氧條件下蒜氨酸/蒜酶反應(yīng)物的抗氧化性能。結(jié)果表明，氧氣的存在和作用對蒜氨酸/蒜酶反應(yīng)物的抗氧化能力有很大影響，導(dǎo)致其隨著時間的延長抗氧化能力不斷下降。但是，無氧條件下蒜氨酸/蒜酶反應(yīng)物的抗氧化能力隨著時間的延長也呈現(xiàn)下降趨勢，該下降與氧氣無關(guān)，我們推測是因為蒜酶能夠在催化生成蒜素之后，能夠繼續(xù)對蒜素進(jìn)行作用生成其他物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致抗氧化能力呈現(xiàn)一定的下降趨勢。鑒于開放環(huán)境下氧的存在不利于蒜素抗氧化能力的保持，可以猜想，若能分別制備蒜氨酸和蒜酶的包被制劑，使之服用后在人體內(nèi)釋放并相互反應(yīng)生成蒜素，則能更充分地發(fā)揮蒜素的療效和保健功能。本研究對抗氧化能力受氧影響的試驗結(jié)果，為將來科學(xué)組方蒜氨酸/蒜酶復(fù)合制劑提供了理論參考。

4　結(jié)論

本文實現(xiàn)了蒜酶在畢赤酵母中的表達(dá)。酶的比活力達(dá)到（115.81±1.93）U/mg。體外抗氧化研究結(jié)果表明，無氧條件下蒜酶催化蒜氨酸形成的蒜素的抗氧化能力比有氧條件下高，為體內(nèi)利用蒜酶和蒜氨酸制備高抗氧化能力的制劑提供理論參考。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.040

作者簡介：韓楊（1983—），女（回），博士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程。

*通信作者：路福平（1967—），男（漢），教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程。

收稿日期：2015-05-28

Expression of Alliinase Gene in Pichia pastoris and Its Antioxidant Activity in Vitro

HAN Yang，SUN Tong-wei，LIU Hui-jie，GUO Wei，WANG Hong-bin，LIU Yi-han，LU Fu-ping*

（The College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：To clone the alliinase gene from the garlic bulb and construct the eukaryote expression plasmid for expressing the recombinant alliinase in Pichia pastoris system and analyzing its bioactivity and antioxidant activity of alliin/alliinase mixture.The alliinase gene was cloned from the garlic bulb by RT-PCR and the eukary－ote expression plasmid of alliinase was constructed with the pPIC9k vector.The recombinant plasmid was transformed into Pichia pastoris GS115 by eletroporation.The positive clones were screened and were induced by methanol.Supernatants after induction were analyzed by SDS-PAGE.The activity of the recombinant protein was detected by the pyruvic acid method.Antioxidant activities of the alliin/alliinase mixture in vitro were analyzed by DPPH·in aerobic and anaerobic conditions respectively.The alliinase gene was successfully cloned from the garlic bulb，the recombinant alliinase existed in the supernatant of Pichia pastoris in the forming of glycoprotein.The specific activity of the recombinant protein was（115.81±1.93）U/mg.The total antioxidant capacity of alliin/alliinase mixture in anaerobic condition was higher than in aerobic condition.The alliinase gene is successfully expressed in Pichia pastoris system.alliin/alliinase mixture showed very good oxidation resistance is a very prospect for development with the material.

Key words：alliinase；pichia pastoris；alliin；antioxidation