巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)腎損傷的臨床分析

王玉瑛，湯淑斌，焦愛萍，周巍玲，高怡玢，呂　明，龐偉斌，劉　瑩

(寶雞市婦幼保健院，陜西 寶雞 721000)

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巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)腎損傷的臨床分析

王玉瑛，湯淑斌，焦愛萍，周巍玲，高怡玢，呂明，龐偉斌，劉瑩

(寶雞市婦幼保健院，陜西 寶雞 721000)

[摘要]目的總結(jié)分析小兒人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染引起的腎臟損傷的臨床特點(diǎn)。方法回顧性分析2013年1月至2014年12月期間326例在寶雞市婦幼保健院住院診斷為HCMV感染患兒的臨床資料，分析其腎臟損傷的發(fā)生情況，感染嚴(yán)重程度及HCMV復(fù)制水平與腎臟損傷之間的關(guān)系。結(jié)果326例中腎臟損傷92例(28.22%)，其中單純性鏡下血尿32例(9.82%)單純性蛋白尿51例(15.64%)，血尿+蛋白尿9例(2.53%)沒有發(fā)現(xiàn)肉眼血尿及急性腎損傷者，不同年齡、臨床表現(xiàn)、HCMV復(fù)制水平與腎臟損傷之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論巨細(xì)胞病毒感染引起腎臟損傷的發(fā)生率較高，以單純性蛋白尿居多。

[關(guān)鍵詞]小兒；人巨細(xì)胞病毒；感染；腎臟損傷

在我國人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染率較高，一般人群巨細(xì)胞病毒(CMV)抗體陽性率為86%～96%，孕婦為95%左右，嬰幼兒時(shí)期為60%～80%[1]；肝臟是巨細(xì)胞病毒感染的主要靶器官，此外還可侵犯呼吸、神經(jīng)、血液、腎臟等，嚴(yán)重者危及生命。近年來隨著器官移植的開展，CMV感染相關(guān)腎損害逐漸受到重視。本文回顧性分析了寶雞市婦幼保健院兒科2013年1月至2014年12月住院診斷為HCMV感染患兒326例的臨床資料，總結(jié)其腎臟損傷的發(fā)生情況、臨床特點(diǎn)與其感染嚴(yán)重程度、CMV復(fù)制水平間的關(guān)系。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇2013年1月至2014年12月期間在陜西省寶雞市婦幼保健院住院的CMV感染患兒326例。男167例，女159例，年齡為1個(gè)月～14歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合1998年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會感染消化學(xué)組在宜昌會議制訂的CMV感染診斷方案，進(jìn)行CMV抗體(IgM)和(或)血清CMV-DNA>500拷貝/mL、尿CMV-DNA>500拷貝/mL為急性感染CMV者；②打電話征求患兒家屬同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①確診為CMV感染但未進(jìn)行尿及腎功能檢測者；②合并其它病原體(其它病毒、支原體、鏈球菌及其它非特異性細(xì)菌)感染；③存在其它可導(dǎo)致腎臟損傷的疾病或者腎臟畸形等基礎(chǔ)病變者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集

入選的326例急性感染CMV者，在入院次日，晨空腹4h以上用無菌注射器抽取受檢者2mL外周靜脈血，同時(shí)留取清潔新鮮中段尿2mL。

1.2.2標(biāo)本處理

血液標(biāo)本：將2mL外周靜脈血置于EDTA無菌離心管中，4℃靜置過夜，分離血清(含病毒DNA)，置于1.5mL EP管中。

尿液標(biāo)本：留取2mL尿液于干燥管中用于檢測尿中紅細(xì)胞、蛋白、尿微量白蛋白等腎臟損害的指標(biāo)。

1.2.3血樣提取DNA

血液標(biāo)本：取50μL血清加入等量DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10min，12 000r/min離心10min，備用。

1.2.4血液人類巨細(xì)胞病毒-DNA試劑與儀器

CMV-DNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)診斷試劑盒及DA-7600實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀。內(nèi)含有DNA提取液、HCMV-PCR反應(yīng)管(HCMV特異性引物探針、酶系和Tris鹽酸緩沖液)、陽性定量參考品、弱陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、稀釋液。引物序列為F5'-GCTAACTATG￣CAGAGCATGTA-3'，R5'-GCTGAGTTCTTGGT￣AAAGAAC-3'。

1.2.5血液人類巨細(xì)胞病毒-DNA聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增

將5μL樣本加入已配好PCR反應(yīng)管，放入熒光定量PCR分析儀樣品槽。擴(kuò)增條件：93℃ 2min預(yù)變性；93℃ 45s→55℃ 60s，10個(gè)循環(huán)；93℃ 30s→55℃ 45s，采集熒光，做30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由電腦軟件自動(dòng)分析結(jié)果。

根據(jù)陽性定量參考品的CT值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣品的CT值計(jì)算DNA的病毒載量。試劑由中山大學(xué)安達(dá)基因股份有限公司生產(chǎn)的(PCR熒光法)核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光法)。

1.2.6尿液檢測方法

鏡下血尿檢測：留取清潔中段尿2mL由尿液分析系統(tǒng)工作臺自動(dòng)檢測尿液紅細(xì)胞(RBC)>22.8個(gè)/μL為陽性結(jié)果(儀器購自日本西森美床公司)。

蛋白尿檢測：留取清潔中段尿2mL，將尿液分析試紙的試紙區(qū)完全放入尿液1～2s取出，輕刮除去多余尿液后放置于尿液分析儀載物臺上，檢測尿蛋白，以(+)或以上者為陽性結(jié)果(試紙及儀器均購自煙臺寶成生物技術(shù)有限公司)。

尿微量白蛋白檢測：留取清潔中段晨尿2mL，取40μL尿液加入R1液(成分0.1mol/L PBS緩沖液、PEG、0.1%NaN3、表面活性劑)1 400μL，混勻后放入溫育箱37℃溫育10min后加入R2液(成分：羊抗人尿微量白蛋白純化抗體、0.1mol/L PBS緩沖液、0.1%NaN3、穩(wěn)定表面活性劑)350μL，混勻后放入溫育箱37℃溫育10min，取標(biāo)本以免疫散色比濁法檢測尿微量白蛋白，以>30mg/L為陽性結(jié)果(試劑購自上海捷門生物技術(shù)合作公司，檢測儀購自上海第三分析儀器廠)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1人類巨細(xì)胞病毒感染患兒腎臟損傷的發(fā)生情況

326例HCMV感染患兒中腎臟損傷92例(28.22%)。其中單純性鏡下血尿32例(9.82%)單純性蛋白尿51例(15.64%)，其中尿蛋白(+++)2例，尿蛋白(++)14例，尿蛋白(+)33例，微量蛋白尿2例。血尿+蛋白尿9例(2.53%)，沒有發(fā)現(xiàn)1例肉眼血尿及急性腎損傷者。

2.1.1不同年齡組與腎臟損傷的相關(guān)分析

各年齡組間腎損傷發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.41，P>0.05)；腎臟損傷程度分布與年齡之間無相關(guān)性(χ2=3.27，P>0.05)，見表1。

表1　　不同年齡與腎臟損傷的關(guān)系[n(%)]

2.1.2不同臨床表現(xiàn)與腎臟損傷之間相關(guān)分析

不同臨床表現(xiàn)的患兒腎損傷發(fā)生率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.81，P>0.05)。腎臟損傷程度分布與臨床表現(xiàn)之間無相關(guān)性(χ2=6.17，P>0.05)，見表2。

表2　　不同臨床表現(xiàn)與腎臟損傷的相關(guān)分析[n(%)]

2.2人類巨細(xì)胞病毒復(fù)制水平與腎臟損傷發(fā)生的相關(guān)分析

血液中CMV-DNA定量檢測，>107者18例；>106～107者90例；>105～106者116例；>104～105者64例；>103～104者37例；有1例CMV-DNA定量位于500～103之間，無腎臟損傷，例數(shù)太少未參與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

腎臟損傷程度分布與HCMV-DNA復(fù)制水平之間無相關(guān)性(χ2=1.09，P>0.05)，見表3。

表3CMV-DNA水平(血清)與腎臟損傷的相關(guān) 分析[n(%)]

Table 3　The relationship between CMV-DNA (serum) and renal injury[n(%)]

3討論

3.1巨細(xì)胞病毒感染的機(jī)制

HCMV是人類先天性病毒感染中最常見的病原體之一，屬人皰疹病毒β亞群，是一種雙鏈DNA病毒，長度約為230kb，病毒整體呈球形，直徑約為180nm[2]。因細(xì)胞被病毒感染后體積增大且有核內(nèi)皮胞質(zhì)包涵體而命名巨細(xì)胞病毒，CMV感染途徑主要為接觸被病毒感染的尿液、唾液、分泌物，以及母嬰垂直傳播。病毒可由乳汁、唾液及尿排出，可持續(xù)數(shù)周到幾年[3]。兒童是CMV感染的高發(fā)人群，尤其是出生3個(gè)月以內(nèi)的嬰幼兒[4]。急性感染恢復(fù)后，病毒可長期潛伏在體內(nèi)，一旦機(jī)體免疫功能減損，病毒即可激活致病，故為“機(jī)會”致病微生物。根據(jù)臨床癥象可分為癥狀性感染和無癥狀性感染[5]。

由于與人免疫系統(tǒng)共同進(jìn)化，CMV侵入人體后形成多種獨(dú)立機(jī)制逃避人體免疫系統(tǒng)的追剿，機(jī)體中T細(xì)胞、NK細(xì)胞等介導(dǎo)的細(xì)胞免疫起到重要作用，但也不能完全清除病毒，使大部分人成為隱性或潛伏感染[6]。病毒在宿主體內(nèi)潛伏或呈低度增殖，并與宿主保持相對平衡，主要在上皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞長期存在和復(fù)制。

3.2巨細(xì)胞病毒感染引起多器官功能損傷

CMV的細(xì)胞嗜性較廣，對人體的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞普遍易感；對特殊的實(shí)質(zhì)細(xì)胞如腦和視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞、胃腸道細(xì)胞和肝細(xì)胞也能感染。對人體組織的侵害與機(jī)體的年齡、免疫狀況和組織細(xì)胞特異性等相關(guān)[7]。巨細(xì)胞病毒感染可伴隨有危及生命的并發(fā)癥[8]。

由于CMV對人體組織有廣泛的親嗜性以及對上皮細(xì)胞的易感性，HCMV感染可引起多種不同的感染綜合征，可導(dǎo)致巨細(xì)胞肝炎、巨細(xì)胞肺炎、先天缺陷及神經(jīng)、血液、腎臟、骨髓等多臟器功能受損[9]。近年來引起肝臟等臟器損傷的報(bào)道很多，對血液系統(tǒng)及腎臟損傷的報(bào)道相對較少，李光焰(2013年)報(bào)告HCMV感染的新生兒50%以上有血小板減少及紫癜。1987年Cregory等首次用直接免疫熒光法在IgA腎病腎小球系膜區(qū)檢測到巨細(xì)胞病毒抗原，1991年Muller等也發(fā)現(xiàn)腎病患者腎小球HCMV大量繁殖。李士軍等(2004年)報(bào)道21例急性腎炎患兒中9例存在HCMV感染，12例腎病綜合征中4例存在HCMV感染，HCMV陽性患兒中血清胱抑素C(cystatinc)，提示HCMV感染與小兒腎損傷密切相關(guān)，HCMV感染可引起脂質(zhì)代謝異常，引起腎小球動(dòng)脈硬化及腎小球損傷。

3.3人類巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)性腎損害的發(fā)病機(jī)制

HCMV致腎臟損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，病情輕重不一，多表現(xiàn)為鏡下血尿及輕微蛋白尿，肉眼血尿少見，本文報(bào)告中HCMV感染中腎臟損傷的發(fā)生率為28.22%，以單純性蛋白尿多見，占15.64%，其次為單純性鏡下血尿，占9.82%，部分鏡下血尿?yàn)殚g斷性，單次檢查表現(xiàn)為假陰性，也可能是單純性血尿低于單純性蛋白尿的原因。血尿合并蛋白尿少見，無肉眼血尿及急性腎損傷發(fā)生，可能與尿檢時(shí)間與病毒潛伏、激活時(shí)間及機(jī)體免疫狀態(tài)、反復(fù)激活有關(guān)，本文為小樣本分析，有待進(jìn)一步大樣本多中心研究。

本文326例HCMV感染中1歲以下嬰兒為201例(61.66%)，占絕大多數(shù)，可能與年齡稍大一些患兒未住院治療未納入統(tǒng)計(jì)有關(guān)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各年齡段之間腎臟損傷發(fā)生率無顯著差異。臨床表現(xiàn)以HCMV肝炎(30.06%)及肺炎(30.98%)占絕大部分，其次為除腎臟損傷外兩個(gè)以上臟器損傷者較多，各臨床表現(xiàn)之間與腎臟損害發(fā)生情況經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示無顯著差異(P>0.05)，同時(shí)單純性鏡下血尿及單純性蛋白尿的發(fā)生在各臨床表現(xiàn)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示不同年齡、機(jī)體感染狀態(tài)及感染嚴(yán)重程度與腎臟損傷的發(fā)生沒有直接關(guān)系。

有報(bào)道HCMV感染易引起免疫損害，對免疫功能正常的個(gè)體并不具有明顯致病性，但可導(dǎo)致免疫功能低下或免疫功能不成熟的個(gè)體發(fā)病[10]。李倩倩等(2014年)報(bào)告患兒體質(zhì)量增長率與巨細(xì)胞病毒拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)，3～6月齡患兒負(fù)相關(guān)性尤為明顯。劉春梅等(2014年)報(bào)告嬰幼兒尿液中HCMV-DNA檢測率明顯高于血液的檢測率，患兒CMV-DNA檢出拷貝數(shù)越高，肝功能損傷的可能性就越大。本研究發(fā)現(xiàn)隨著HCMV-DNA復(fù)制水平增高，腎臟損傷似乎有增加趨勢，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果不支持這一特點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)單純性鏡下血尿及單純性蛋白尿的發(fā)生與血清HCMV-DNA的復(fù)制水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HCMV感染后免疫介導(dǎo)的腎臟損傷占主要作用。劉伯玉等(2006年)報(bào)道，在已建立的HCMV先天性潛伏感染老年BALA/C小鼠模型基礎(chǔ)上，用環(huán)磷酰胺激活小鼠內(nèi)潛伏的HCMV，造成急性感染狀態(tài)，結(jié)果病理學(xué)證實(shí)實(shí)驗(yàn)組和病毒激活組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變，尤以病毒再激活組為甚，并在該組細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)HCMV特征性包涵體，表明HCMV長期反復(fù)潛伏激活是導(dǎo)致腎組織損傷的重要原因。

本資料中所有患兒均未作腎臟活檢，腎臟病理資料尤其是腎臟CMV標(biāo)志物缺如，需要進(jìn)一步對HCMV感染相關(guān)性腎損傷患兒的腎組織中HCMV-DNA及病理學(xué)檢查等明確其腎臟損傷發(fā)生機(jī)制。另外本文研究只是HCMV感染急性期腎臟損傷的發(fā)生情況，HCMV感染的潛伏狀態(tài)及遠(yuǎn)期預(yù)后也有待于進(jìn)一步的前瞻性研究。

本研究HCMV感染以單純性蛋白尿、單純性血尿?yàn)橹?，多無典型臨床表現(xiàn)(肉眼血尿、水腫、高血壓等)，提示臨床醫(yī)師對HCMV感染者應(yīng)早期進(jìn)行尿液篩查，以便早期發(fā)現(xiàn)腎臟損傷。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：黃燕萍]

[收稿日期]2016-01-20

[作者簡介]王玉瑛(1964-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事兒科臨床工作。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.04.020

[中圖分類號]R72

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)04-0476-04

Clinical analysis of human cytomegalovirus infection associated renal injury

WANG Yu-ying, TANG Shu-bin, JIAO Ai-ping, ZHOU Wei-ling, GAO Yi-fen, LYU Ming, PANG Wei-bin, LIU Ying

(Maternal and Child Health Hospital of Baoji, Shaanxi Baoji 721000, China)

[Abstract]Objective To analyze and summarize the clinical characteristics of children with renal injury caused by human cytomegalovirus (HCMV) infection. Methods A retrospective analysis was conducted on clinical data of 326 children who were diagnosed with HCMV infection in Maternal and Child Health Hospital of Baoji during the period of January 2013 to December 2014, and the incidence of renal injury, severity of infection, and relationship between HCMV replication level and renal injury were analyzed. Results In 326 cases, there were 92 cases (28.22%) with renal injury, including 32 cases (9.82%) of simple microscopic hematuria, 51 cases (15.64%) of simple proteinuria and 9 cases (2.53%) of proteinuria with hematuria. No case was found with gross hematuria or acute renal injury. The differences in age, clinical manifestations, HCMV replication level and renal injury were not statistically significant (all P>0.05). Conclusion The incidence of renal injury caused by HCMV infection is relatively high, and simple proteinuria is dominated.

[Key words]children; human cytomegalovirus (HCMV); infection; renal injury