慢病毒介導(dǎo)2型阿諾堿受體RNA干擾有效靶序列的篩選

楊春杰， 丁志文， 龔　惠， 鄒云增*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院上海市心血管病研究所， 上?！?00032 2. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院， 上?！?00032

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·技術(shù)與方法·

慢病毒介導(dǎo)2型阿諾堿受體RNA干擾有效靶序列的篩選

楊春杰1， 丁志文2， 龔惠1， 鄒云增1*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院上海市心血管病研究所， 上海200032 2. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院， 上海200032

[摘要]目的： 篩選慢病毒介導(dǎo)2型阿諾堿受體(RyR-2)RNA干擾的有效靶序列。方法： 設(shè)計(jì)5條RyR-2干擾候選靶序列，將靶序列構(gòu)建到慢病毒載體中，在HEK-293T細(xì)胞中包裝成慢病毒，感染心肌細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法鑒定靶序列干擾RyR-2的效果。結(jié)果： 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得5條RyR-2干擾靶序列，成功構(gòu)建shRyR-2慢病毒載體，獲得高效感染心肌細(xì)胞的慢病毒；感染心肌細(xì)胞后實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡顯示shRyR-2_1007具有較高的干擾效果(P<0.05)。結(jié)論： 成功篩選出高效的RyR-2RNA干擾靶序列。

[關(guān)鍵詞]2型阿諾堿受體；慢病毒；RNA干擾

心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)是保證心臟功能正常的重要基礎(chǔ)，其穩(wěn)態(tài)異常與心臟肥大、心力衰竭密切相關(guān)[1-4]。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)由鈣調(diào)蛋白調(diào)控，它們控制心肌細(xì)胞的功能，如興奮收縮耦聯(lián)等[5-6]。細(xì)胞膜去極化可導(dǎo)致鈣誘導(dǎo)的鈣離子從肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)釋放，引起心肌收縮，其中RyR-2離子通道發(fā)揮了重要作用[7]。

RyR-2是RyR家族成員之一，主要在心肌中表達(dá)，其功能改變會(huì)導(dǎo)致各種類型的心臟疾病，包括CPVT、ARVC2、心肌肥大、心力衰竭等[8]，且作用機(jī)制目前仍不明確。因此，本研究采用慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)降低大鼠乳鼠心肌細(xì)胞中RyR-2基因的表達(dá)，篩選出有效的RyR-2 RNA干擾序列，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株的來(lái)源及培養(yǎng)心肌細(xì)胞取自新生SD大鼠乳鼠心室，采用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，供培養(yǎng)、使用。HEK-293T細(xì)胞株是復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院上海市心血管疾病研究所存放于液氮保種的細(xì)胞株。細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，HEK-293T細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。DMEM/F12培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司。

1.2候選干擾靶序列的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)Bioinformatics & Research Computing數(shù)據(jù)庫(kù)(http://sirna.wi.mit.edu/)篩選獲得5條潛在的SD大鼠RyR-2干擾靶序列，分別為shRyR-2_2271、shRyR-2_8206、shRyR-2_1007、shRyR-2_8033、shRyR-2_10404，具體位置見(jiàn)圖1。干擾序列由英濰捷基公司合成，其信息如下，RyR2_siRNA_F: 5＇-CCGG-21 bp sense-CTCGAG-21 bp antisense-TTTTTG-3＇；Ry-R2_siRNA_R: 5＇-AATTCAAAAA-21 bp sense-CTCGAG-21 bp antisense-3＇。

圖1　RyR-2干擾靶序列設(shè)計(jì)示意圖

1.3慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定pLKO.1 puro質(zhì)粒、pLKO.1 puro GFP質(zhì)粒、psPAX2質(zhì)粒和pMD2.G質(zhì)粒均來(lái)源于Addgene數(shù)據(jù)庫(kù)。采用NEB公司的AgeⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶將pLKO載體進(jìn)行酶切，將干擾序列克隆到pLKO載體上，PCR鑒定結(jié)果。

構(gòu)建好的pLKO、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)在HEK-293T細(xì)胞中包裝shRyR-2慢病毒，同時(shí)使用pLKO-GFP病毒作為對(duì)照。分離SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，在6孔板中培養(yǎng)。在心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后感染shRyR-2慢病毒，同時(shí)使用pLKO-GFP慢病毒作為對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.4不同靶序列干擾效果的對(duì)比

1.4.1熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RyR-2基因表達(dá)取慢病毒感染3 d的心肌細(xì)胞，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，使用TaKaRa公司的SYBR Premix EXTaq試劑盒進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，引物信息如下，GAPDH(rat)_Forward Primer：5＇CA-ACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3＇，GAPDH(rat)_Reverse Primer：5＇-GGCATGGACTGTGGTCA-TGA-3＇ ；RyR-2(rat)_Forward Primer：5＇-GTGGT-TATGCTGTATCCAGAGGG-3＇ ，RyR-2(rat)_Reverse Primer：5＇-CAGGAAACTG-TAGGCAA-ATCGCT-3＇。

1.4.2蛋白印跡檢測(cè)RyR-2蛋白表達(dá)取慢病毒感染4 d的心肌細(xì)胞，采用碧云天公司的RIPA裂解液提取心肌細(xì)胞蛋白，Thermo公司的Pierce BCA Protein Assay Kit測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，RyR-2抗體來(lái)自Proteintech公司，內(nèi)參使用GAPDH。

2結(jié)果

2.1慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)染效率成功構(gòu)建慢病毒載體，PCR鑒定結(jié)果與預(yù)期大小一致(圖2)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后對(duì)照組中HEK-293T細(xì)胞熒光比例較高，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果良好(圖3A)。pLKO-GFP慢病毒感染的心肌細(xì)胞中綠色熒光細(xì)胞占80%以上(圖3B)，提示慢病毒載體可有效感染大鼠乳鼠心肌細(xì)胞。

圖2　shRyR-2慢病毒載體構(gòu)建后的PCR鑒定圖

圖3　慢病毒載體的包裝及轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光顯微鏡下表現(xiàn)

A:HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后；B:大鼠乳鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后. Original magnification: ×200(A), ×400(B)

2.2不同靶序列shRyR-2慢病毒干擾效果的對(duì)比熒光定量PCR結(jié)果表明：shRyR-2_1007慢病毒可使心肌細(xì)胞中RyR-2基因的表達(dá)水平下降至小于40%，其抑制效率最高(P<0.05,圖4)。蛋白免疫印跡結(jié)果表明：shRyR-2_1007慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后抑制效率最高(P<0.05,圖5)。

圖4　熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同靶位點(diǎn)慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后RyR-2基因的表達(dá)量

圖5　蛋白免疫印跡檢測(cè)不同靶位點(diǎn)慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后RyR-2蛋白的表達(dá)

3討論

目前構(gòu)建基因干擾質(zhì)粒的方法較多，將RNA干擾序列克隆到載體中構(gòu)建的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率普遍低下；將21～23 bp的小RNA片段直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建的干擾質(zhì)粒存在小RNA片段不穩(wěn)定、易降解的缺點(diǎn)[9-10]。慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)與上述兩種技術(shù)相比，具有感染效率高且轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，是一種快速、有效降低目的基因表達(dá)的研究手段。本研究利用慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA干

擾技術(shù)成功建立了心肌細(xì)胞RyR-2基因敲減模型，對(duì)原代心肌細(xì)胞具有較好的干擾效果。

本研究設(shè)計(jì)了5對(duì)針對(duì)RyR-2 mRNA不同位點(diǎn)干擾靶序列，基因及蛋白檢測(cè)結(jié)果表明5對(duì)干擾靶序列均能夠在不同程度上降低RyR-2基因的表達(dá)，其中shRyR-2_1007靶序列的干擾作用最明顯，為最佳靶序列，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。未來(lái)實(shí)驗(yàn)將把shRyR-2慢病毒感染到SD大鼠中，觀察在體內(nèi)shRyR-2慢病毒質(zhì)粒是否也擁有較高的干擾效率。

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[本文編輯]葉婷， 賈澤軍

[收稿日期]2016-03-22[接受日期]2016-06-08

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81200085).Supported by National Natural Science Foundation of China(81200085).

[作者簡(jiǎn)介]楊春杰，技師. E-mail: yang.chunjie@zs-hospital.sh.cn *通信作者(Corresponding author). Tel: 021-54237969, E-mail: zou.yunzeng@zs-hospital.sh.cn

[中圖分類號(hào)]R 393

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Screening of effective target sequence of lentivirus-mediated RyR-2 RNA interference

YANG Chun-jie1, DING Zhi-wen2, GONG Hui1, ZOU Yun-zeng1*

1. Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai200032, China 2. Institute of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai200032, China

[Abstract]Objective： To screen the effective target sequence of lentivirus-mediated RyR-2 RNA interference. Methods： We designed five RyR-2 interference candidate target sequences, cloned them into lentiviral vectors, packaged into lentivirus in HEK-293T cells, and infected cardiomyocytes. We identified the effeciency of target sequences by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. Results： We got 5 RyR-2 interference target sequences through databases, and successfully cloned them into lentivirus vectors, and later harvested lentivirus and infected cardiomyocytes. Real-time PCR and Western blotting results showed that RyR-2 in cardiomyocytes was downregulated significantly by shRyR-2_1007 (P<0.05). Conclusions： Lentivirus-mediated RyR-2 RNA interference could downregulate RyR-2 in cardiomyocytes.

[Key Words]RyR-2; Lentivirus; RNA interference