多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)重慶不同產(chǎn)區(qū)桔梗藥材的質(zhì)量

黃嬌++姜登軍

摘要：對(duì)重慶不同產(chǎn)區(qū)桔梗多個(gè)指標(biāo)成分的含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。按照《中國(guó)藥典》方法測(cè)定水分、總灰分、醇浸出物，采用UV法測(cè)定總黃酮、總皂苷、總多糖的含量，采用HPLC-ELSD法測(cè)定桔梗皂苷D的含量，并運(yùn)用主成分分析法和相關(guān)性分析法對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。相關(guān)性分析表明，不同指標(biāo)間有一定的相關(guān)性。對(duì)多個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，運(yùn)用主成分得分得出開(kāi)縣產(chǎn)桔梗質(zhì)量最優(yōu)。通過(guò)主成分分析法和相關(guān)性分析法對(duì)不同產(chǎn)區(qū)桔梗藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，可為重慶產(chǎn)桔梗資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桔梗；綜合評(píng)價(jià)；相關(guān)性分析；主成分分析

中圖分類號(hào)： S567.02文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0301-05-0389-04

收稿日期：2015-04-15

基金項(xiàng)目：重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：K131801）。

通信作者：黃嬌（1982—），女，海南?？谌耍T士，講師，主要從事中藥質(zhì)量分析研究。E-mail：huangjiao1108@126.com。中藥材桔梗為桔?？浦参锝酃Platycodon grandiflorum （Jacq.） A. DC.]的干燥根[1]，是藥食兩用的藥材品種，主要用于治療咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛、音啞、肺癰吐痰、瘡瘍膿成不潰等癥[2]。桔梗的化學(xué)成分主要含有皂苷類、黃酮類、酚類化合物、聚炔類化合物、甾醇類、多聚糖、揮發(fā)油、脂肪油及脂肪酸、維生素、氨基酸及微量元素[3]。相關(guān)學(xué)者對(duì)桔梗中多種成分，特別是三萜皂苷類成分的藥理活性進(jìn)行了較多研究[4-6]，目前，藥典單以桔梗皂苷D含量來(lái)判斷桔梗藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣并不能反映真實(shí)情況，因?yàn)橹兴幆熜嵌喾N成分協(xié)同作用的結(jié)果。已有關(guān)于不同產(chǎn)地桔梗有效成分含量方面的研究報(bào)道[7-9]，但多指標(biāo)應(yīng)用于桔梗藥材質(zhì)量綜合的評(píng)價(jià)尚未見(jiàn)報(bào)道。

桔梗在中國(guó)主產(chǎn)于安徽、河南、湖北、遼寧、吉林、河北及內(nèi)蒙古等省（區(qū)），以東北、華北產(chǎn)量較大，稱為北桔梗，華東地區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量最佳，稱為南桔梗，南北皆適于種植[10]。重慶地處西南，地形垂直高差大，生態(tài)環(huán)境呈現(xiàn)多樣性，生態(tài)類型豐富多樣，生物物種非常豐富。由于其得天獨(dú)厚的地理氣候條件，中藥資源非常豐富，素有中草藥王國(guó)和天然藥庫(kù)之稱。重慶有不少區(qū)縣種植桔梗，為了進(jìn)一步擴(kuò)大重慶產(chǎn)桔梗資源的開(kāi)發(fā)，保證商品藥材及相應(yīng)制劑的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)擬對(duì)收集的桔梗藥材進(jìn)行多指標(biāo)成分的測(cè)定，為重慶產(chǎn)桔梗藥材資源的合理使用及GAP種植提供借鑒和參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：MusT-13082211），購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈，色譜純；甲醇、乙醇、正丁醇、甲酸、冰醋酸、高氯酸、香草醛，分析純，川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠；超純水，自制。

本試驗(yàn)桔梗藥材樣品采自2013年重慶8個(gè)區(qū)縣（表1）共20批，藥材采集后清洗去除泥沙，刮去根皮后干燥，即得桔梗樣品，并經(jīng)重慶萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所鑒定為桔?？平酃僦参锝酃Platycodon grandiflorum （Jacq. ） A. DC.]的根。

1.2儀器與設(shè)備

島津LC-20A高效液相色譜儀；ELSD-LTII檢測(cè)器；島津工作站；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；梅特勒ME215S十萬(wàn)分之一電子天平；梅特勒CP224S萬(wàn)分之一電子天平；紫外UV-2550，日本島津公司；超聲波清洗儀SD3200，昆山市超聲儀器有限公司；LK-COOA搖擺式高速中藥粉碎機(jī)。

1.3方法

1.3.1水分測(cè)定按照《中國(guó)藥典》2010版1部附錄ⅨH第1法，取不同批次的桔梗樣品（過(guò)2號(hào)篩）2.0 g測(cè)定。

1.3.2總灰分測(cè)定精確稱取桔梗粉末（過(guò)2號(hào)篩）3.0 g，按照《中國(guó)藥典》2010版1部附錄ⅨK灰分測(cè)定法測(cè)定。

1.3.3浸出物測(cè)定精確稱取桔梗粉末（過(guò)2號(hào)篩）2.0 g，置于150 mL錐形瓶中，精確加水100 mL，按照《中國(guó)藥典》2010版1部附錄XA項(xiàng)下醇溶性浸出物測(cè)定法的熱浸法測(cè)定。

1.3.4桔梗總皂苷含量測(cè)定[11]精確稱取桔梗皂苷D 5.65 mg，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為0.565 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確稱取干燥桔梗藥材粉末2.0 g，加入11倍90%乙醇，超聲提取30 min，超聲溫度為45 ℃進(jìn)行提取，殘留物加甲醇溶解定容于容量瓶中備用。分別吸取200 μL，在473 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算出總皂苷的含量。

1.3.5桔梗總黃酮含量測(cè)定[11]精確稱取蕓香苷對(duì)照品15.70 mg，加甲醇溶解并稀釋制成濃度為0.157 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精確稱取1.0 g桔梗粗粉，置于100 mL錐形瓶中，加入90%甲醇溶液50 mL，超聲提取45 min，放冷過(guò)濾定容于100 mL容量瓶中，作為供試品溶液。在510 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算出總黃酮的含量。

1.3.6桔?？偠嗵呛繙y(cè)定[7]精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品15.23 mg，加蒸餾水溶解并稀釋制成0.152 3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確稱取桔梗樣品1.0 g，置于100 mL容量瓶中，超聲提取45 min。精確量取續(xù)濾液20 mL蒸干，加水溶解，加10 mL無(wú)水乙醇放置12 h，抽濾，沉淀用90%乙醇洗滌，沉淀用水溶解定容至50 mL量瓶，搖勻，即得供試品溶液。在486 nm 處測(cè)定吸收度，計(jì)算出總多糖的含量。

1.3.7桔梗皂苷D含量測(cè)定

1.3.7.1色譜條件色譜柱：phenomenex-C18色譜柱；流動(dòng)相：流動(dòng)相乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序：0.01～10 min，20%A；10～54 min，33%A；54～66min，4%A。

1.3.7.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精確稱取桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品4.93 mg置于10 mL量瓶中，加90%甲醇稀釋至刻度，過(guò) 0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)即得，進(jìn)樣20 μL。

1.3.7.3供試品溶液的制備[12]取各桔梗藥材粉末（過(guò)2號(hào)篩），精確稱取2 g，置錐形瓶中，精確加入90%甲醇50 mL，超聲提取30 min，放冷，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)即得。

2結(jié)果與分析

2.1桔梗皂苷D含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系的考察分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、5、10、15、20、25 μL注入液相色譜儀。按“1.3.7.1”節(jié)下色譜條件，測(cè)得桔梗皂苷D峰面積積分值，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（x），峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸，得到桔梗皂苷D的線性回歸方程為：y=0985x+11.886，r=0.999 2；表明桔梗皂苷D在0.491～12276 μg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2精密度試驗(yàn)取1號(hào)供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算桔梗皂苷D的峰面積RSD為1.26%，表明方法精密度良好。

2.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)分別取1號(hào)供試品溶液0、2、4、8、12、24 μL，進(jìn)樣20 μL，桔梗皂苷D的峰面積RSD為093%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一批藥材（1號(hào)），按照“1.3.7.3”節(jié)下制備6份供試品溶液，依照同樣色譜條件測(cè)定桔梗皂苷D含量平均值為0.56%，RSD為2.83%，表明此方法符合方法學(xué)要求。

2.1.5加樣回收率試驗(yàn)精確稱取2 g 1號(hào)桔梗藥材粉末5份（桔梗皂苷D含量為0.56%），分別精確加入桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品1 mL（含桔梗皂苷D 0.491 mg），按供試品的制備方法處理，計(jì)算回收率，桔梗皂苷D 5份樣品的平均回收率為9958%，RSD為1.09%，表明此法的回收率較高。

2.2系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在“1.3.7.1”節(jié)下色譜條件對(duì)對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）。

2.3桔梗皂苷D的含量測(cè)定

分別取不同產(chǎn)區(qū)的桔梗藥材，按照“1.3.7.3”節(jié)下方法制成樣品溶液，精確吸取供試品溶液20 μL，注入色譜儀（圖2），桔梗皂苷D含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4不同產(chǎn)地桔梗各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果分析

從表1可以看出，20批桔梗樣品水分和總灰分均符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》的規(guī)定，醇浸出物的含量在17.84%～35.62%，

總多糖的含量在13.06%～58.70%，總皂苷的含量在6.99%～12.47%，總黃酮的含量在0.26%～0.53%，桔梗皂苷D的含量在0.41%～0.77%，不同產(chǎn)區(qū)的桔梗指標(biāo)性成分含量有明顯差異。

2.5相關(guān)性分析

采用SPSS 19.0對(duì)上述指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），從表2可以看出，桔梗藥材的水分和總灰分與其他指標(biāo)之間的相關(guān)不顯著；總多糖和浸出物之間呈極顯著相關(guān)；總皂苷和浸出物之間呈極顯著相關(guān)；總黃酮和浸出物之間呈顯著相關(guān)；桔梗皂苷D和浸出物之間呈顯著相關(guān)；總多糖和總黃酮之間呈極顯著相關(guān)，總皂苷和總黃酮之間呈極顯著相關(guān)；總皂苷和桔梗皂苷D之間呈極顯著相關(guān)；總黃酮和桔梗皂苷D間呈極顯著相關(guān)。

2.6主成分分析

大量研究表明，應(yīng)用主成分分析和模糊數(shù)學(xué)方法建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行的[13-16]。本研究采用SPSS 19.0對(duì)20批桔梗藥材的水分、總灰分、醇浸出物、總黃酮、總皂苷、總多糖以及桔梗皂苷D的含量等測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。成分1、2的特征值占總方差的百分比為 74.927%，選取了前2個(gè)因子作為主成分，代表主要的桔梗質(zhì)量指標(biāo)。第1主成分以醇浸出物、總黃酮、總皂苷、總多糖以及桔梗皂苷D的含量貢獻(xiàn)較大；第2主成分以水分含量貢獻(xiàn)較大。從圖3可以看出，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的幾個(gè)點(diǎn)就是主成分1和2中權(quán)重值大的成分，表明其在決定產(chǎn)地差異中的重大作用。

綜合主成分得分越高，相應(yīng)的評(píng)價(jià)樣本質(zhì)量就越優(yōu)。由得分圖可見(jiàn)不同產(chǎn)地的桔梗藥材得分不同，提示桔梗藥材的質(zhì)量與地域分布有關(guān)，不同產(chǎn)地桔梗藥材的質(zhì)量之間存在著明顯的差異。綜合得分11號(hào)開(kāi)縣關(guān)面鄉(xiāng)產(chǎn)的桔梗藥材質(zhì)量最優(yōu)，15號(hào)樣品質(zhì)量最差（圖4）。

2.7聚類分析驗(yàn)證

為了驗(yàn)證綜合主成分分析結(jié)果的可靠性及客觀性，采用系統(tǒng)聚類法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)20批桔梗藥材的水分、總灰分、醇浸出物、總黃酮、總皂苷、總多糖以及桔梗皂苷D原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，本試驗(yàn)的綜合主成分分析結(jié)果與原始數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果呈現(xiàn)相似規(guī)律，20批桔梗樣品可以分為2類，其中 10、11、19號(hào)樣品聚為一類，在綜合排名中排名前3，得分比其他樣品略高，質(zhì)量最優(yōu)；在剩下的樣品中，綜合排名較后，質(zhì)量較差（圖5）。

3結(jié)論與討論

本研究對(duì)桔梗的水分、總灰分及醇溶性浸出物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)總黃酮、總皂苷、總多糖以及桔梗皂苷D的含量測(cè)定，建立全面的桔梗藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，并通過(guò)此體系綜合分析不同產(chǎn)區(qū)桔梗藥材的質(zhì)量差異。通過(guò)對(duì)此體系進(jìn)行分析，不同產(chǎn)區(qū)桔梗醇溶性浸出物都在17%以上，水分不超過(guò)15%，總灰分不超過(guò)5%，桔梗皂苷D的含量都大于0.1%，所有樣品都能符合《中國(guó)藥典》2010 版標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量較好。

運(yùn)用相關(guān)性分析對(duì)20批桔梗藥材進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，20批桔梗中水分、總灰分、浸出物以及指標(biāo)性成分都有明顯差異。相關(guān)性分析中可以得到桔梗藥材的水分和總灰分與其他指標(biāo)之間的相關(guān)性不顯著；總多糖和浸出物之間呈極顯著相關(guān)；總皂苷和浸出物之間呈極顯著相關(guān)；總黃酮和浸出物之間呈顯著相關(guān)；桔梗皂苷D和浸出物之間呈顯著相關(guān)；總多糖和總黃酮之間呈極顯著相關(guān)，總皂苷和總黃酮之間呈極顯著相關(guān)；總皂苷和桔梗皂苷D之間呈極顯著相關(guān)。三萜皂苷類是桔梗的主要活性成分與特征性成分[3]，不同產(chǎn)區(qū)的桔?？傇碥蘸蛦误w皂苷的含量有差異，符合藥用植物體內(nèi)總皂苷含量的積累和皂苷的組成與植物生長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān)，藥用

植物體內(nèi)的皂苷是動(dòng)態(tài)變化的，來(lái)源不同產(chǎn)區(qū)的同種中藥材，含有的特定的藥效成分皂苷含量就有可能不同，包括皂苷總含量和皂苷的組成[17]。黃酮類化合物具有降血壓、抑制血小板聚集、抗骨質(zhì)疏松、抗心律失常、抗過(guò)敏、抗缺氧等多種藥理及保健作用[18]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桔梗多糖具有很好的抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫活性的作用[19-20]，多糖含量直接影響其藥效的發(fā)揮，多糖也是桔梗食用品質(zhì)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)得到的總多糖、總黃酮、總皂苷之間呈極顯著相關(guān)性，可能和桔梗體內(nèi)代謝的生物合成過(guò)程有關(guān)。影響桔梗體內(nèi)多種成分積累的因素比較復(fù)雜，可能是多種生態(tài)因子如溫度、土壤等協(xié)同作用的結(jié)果。

采用主成分分析法能夠篩選出共有的特征成分，指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)決定性要素，較以往單一評(píng)價(jià)指標(biāo)得到的結(jié)果更為系統(tǒng)，能較為全面地反映桔梗藥材的質(zhì)量狀況，各主成分的貢獻(xiàn)率是通過(guò)分析原始數(shù)據(jù)計(jì)算得到，克服了其他綜合評(píng)價(jià)方法中人為確定各指標(biāo)權(quán)重的問(wèn)題，結(jié)果客觀公正[13]。從評(píng)價(jià)結(jié)果看，11號(hào)樣品綜合主成分F值最高，質(zhì)量最好；15號(hào)樣品綜合主成分F值最低，質(zhì)量最差。本試驗(yàn)中運(yùn)用 PCA-CA模式識(shí)別分析方法，能更全面地判別桔梗藥材的優(yōu)劣，為桔梗藥材的進(jìn)一步利用提供了可靠的理論依據(jù)。

植物生存環(huán)境中的生態(tài)因子可分為生物因子和非生物因子。皂苷類和黃酮類化合物都是植物體內(nèi)重要的次生代謝物，其量和組成隨著植物的遺傳背景、組織類型、生長(zhǎng)年齡、生理狀況以及環(huán)境因子的變化而發(fā)生顯著變化，而其量和組成的變化又取決于合成途徑中的一些關(guān)鍵酶及其在細(xì)胞中的表達(dá)水平[21-24]。植物的次生代謝產(chǎn)物，在植物體內(nèi)的積累很大程度上受生長(zhǎng)環(huán)境各因素的直接或間接影響。后續(xù)將對(duì)影響桔梗次生代謝物積累的關(guān)鍵生態(tài)因子進(jìn)行深入研究。

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)桔梗藥材的多指標(biāo)含量之間存在不同程度的差異，相同產(chǎn)區(qū)也存在一定差異，可能與氣候、土壤、海拔、采集時(shí)間、生長(zhǎng)年限等有一定的關(guān)系，在一定程度上反映了桔梗藥材的質(zhì)量特性。通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)的樣品綜合主成分值存在較大差異，相同產(chǎn)區(qū)也存在一定差異，可能與產(chǎn)區(qū)栽培水平參差不齊有關(guān)，所以規(guī)范化栽培技術(shù)是確保中國(guó)藥材質(zhì)量的重要舉措[21]。擴(kuò)大重慶桔梗資源的開(kāi)發(fā)，就必須加強(qiáng)各產(chǎn)區(qū)規(guī)范化種植技術(shù)和管理。中藥材的品種具有“一脈相承”“沿革變遷”的特點(diǎn)，產(chǎn)地是影響中藥材質(zhì)量的重要因素[25]。桔梗在我國(guó)許多地區(qū)均有分布，而不同產(chǎn)地環(huán)境因子均有較大差異，這勢(shì)必會(huì)對(duì)桔梗的生長(zhǎng)及藥材品質(zhì)造成影響。加大收集代表性桔梗樣品，采用質(zhì)譜等先進(jìn)方法，進(jìn)一步對(duì)桔梗體內(nèi)代謝產(chǎn)物成分篩選，并結(jié)合藥效、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行綜合比較研究，可使桔梗質(zhì)量評(píng)價(jià)體系更加完善。

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