miR-21對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原分泌及細(xì)胞增殖的影響

周仁鵬　王琛　王丹茹

·論著·

miR-21對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原分泌及細(xì)胞增殖的影響

周仁鵬王琛王丹茹

【摘要】目的探討miR-21（microRNA-21）在瘢痕疙瘩中的表達(dá)及其生物學(xué)作用，為瘢痕疙瘩的防治提供新的思路。方法收集臨床患者正常皮膚及瘢痕疙瘩標(biāo)本，部分進(jìn)行組織學(xué)檢測；部分進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，Real-time PCR檢測體外培養(yǎng)的正常皮膚來源和瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞中，miR-21、Smad7（miR-21靶基因）、Col 1 A1、Col 3 A1（纖維化相關(guān)基因）的表達(dá)；應(yīng)用miRNA-21的模擬物和抑制劑，以Western-Blot和Real-time PCR分別檢測Col 1 A1、Col 3 A1 及Smad7的蛋白和核酸水平表達(dá)變化，結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果瘢痕疙瘩標(biāo)本組織學(xué)檢測，其膠原的含量明顯高于正常皮膚；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-21、Col 1 A1、Col 3 A1表達(dá)高于正常皮膚組織，Smad7表達(dá)低于正常皮膚組織；正常皮膚來源成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后，Smad7表達(dá)降低，纖維化相關(guān)基因的表達(dá)、細(xì)胞增殖能力增加；瘢痕疙瘩組織來源成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑后，Smad7表達(dá)增加，纖維化相關(guān)基因的表達(dá)、細(xì)胞增殖能力降低。結(jié)論瘢痕疙瘩中miR-21表達(dá)升高，促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)中纖維化相關(guān)膠原基因的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的體外增殖能力，可能是導(dǎo)致瘢痕疙瘩形成的重要原因。

【關(guān)鍵詞】小分子核糖核酸瘢痕疙瘩細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞增殖纖維化

瘢痕疙瘩是繼發(fā)于真皮損傷后，以成纖維細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積為特征的疾病[1-3]。瘢痕疙瘩的形成機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為遺傳、免疫、張

MicroRNA（微小RNA，miR）是內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，含21～23個(gè)堿基，主要通過靶基因轉(zhuǎn)錄RNA的3’UTR（非翻譯區(qū)）互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA降解或翻譯抑制，最終抑制靶基因的表達(dá)[7]。目前已有多個(gè)miR被發(fā)現(xiàn)與組織的纖維化有關(guān)。其中與TGF-β通路相關(guān)的miR中，miR-21在纖維化的心肌、腎、肺組織中表達(dá)顯著增加，抑制靶基因Smad7轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生[8-11]。與瘢痕疙瘩一樣，有纖維化特征的增生性瘢痕中，高表達(dá)的miR-21可促進(jìn)增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞的增殖[12]。

因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討瘢痕疙瘩來源成纖維細(xì)胞與正常皮膚成纖維細(xì)胞的miR-21是否存在差異性表達(dá)，并進(jìn)一步探討miR-21對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生物學(xué)影響。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本收集

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 （8例瘢痕疙瘩組織和8例正常皮膚組織）來源于2014年2月到2014年12月我科收治的瘢痕疙瘩患者，均獲患者知情同意。

1.2主要材料與儀器

0.2%Ⅰ型膠原酶 （Worthington，美國）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco，美國）；磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶 （上海思吉生物制品有限公司）；miR-21 mimics、miR-21 inhibitor設(shè)計(jì)合成（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；人Col1A1、Col3A1、Smad7、β-actin基因引物設(shè)計(jì)合成（上海生工公司）；鼠抗人抗體：Col1A1、Col3A1、β-actin（Santa Cruz，美國）；鼠抗人抗體：Smad7（Abcam，美國）；結(jié)晶紫染色液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；熒光定量PCR儀 （BIO-rad IQ5多色實(shí)時(shí)PCR儀，美國BIO-rad公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1組織學(xué)研究

新鮮手術(shù)切除的瘢痕疙瘩和正常皮膚標(biāo)本用無菌濕紗布包裹，在無菌條件下切取部分組織進(jìn)行組織冰凍切片，部分組織進(jìn)行成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)。組織樣本4%多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液中過夜脫水，OCT包埋，以5 μm層厚進(jìn)行冰凍切片。切片分別進(jìn)行HE和Masson染色，鏡下觀察。

1.3.2成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

用于成纖維細(xì)胞分離的組織，以PBS沖洗3遍，剪碎，0.2%Ⅰ型膠原酶溶液37℃振蕩（120 r/min）下消化3 h。以等體積的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，200目篩網(wǎng)過濾，將濾液收集到離心管離心，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按4×104 cells/cm2的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。取第2、3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4Real-time PCR檢測成纖維細(xì)胞的纖維化指標(biāo)與miR-21及Smad7的表達(dá)

為確認(rèn)分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞仍有原組織中的生物學(xué)特性，將體外培養(yǎng)的融合至80%左右的第2代成纖維細(xì)胞消化后離心，用qPCR檢測成纖維細(xì)胞中col1A1和col3A1的表達(dá)水平。引物序列：βactin（F：5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'；R：5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'）；COL1α1（F：5'-CGAAGACATCCCACCAATCAC-3'；R：5'-GATCGCACAACACCTTGCC-3'）；COL3A1（F：5'-CCTGGTCCTTGCTGTGGTGGTGT-3'；R：5'-GCAGTTTCTAGC GGGGTTTTTACG-3'）；Smad7（F：5'-TGCTGTGCAAAGTGTTCAGGTG-3'；R：5'-CCATC GGGTAT CTGGAGTAAGGA-3'）。

其他RNA用GoScript反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒采用莖環(huán)法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以U6為內(nèi)參檢測miR-21的表達(dá)，引物序列：miR-21（RT primer：5'-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGGTATTTCGCACTGGATACGACTCAACA；F：5'-TGCGGTAGCTTATCAGACTGATG）；U6（RT primer：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT；F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA；Universal reverse primer：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT）。

1.5miR-21 mimics（模擬物）與inhibitor（抑制物）的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h，在6孔板中以每孔1×105個(gè)的密度接種正常皮膚及瘢痕疙瘩組織來源的成纖維細(xì)胞，加入2 mL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別配置混合液A（200 μL的DMEM加2 μL的Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻靜置5 min），混合液B1（200 μL的DMEM加1 μL的miR-21 mimic，充分混勻靜置5 min），混合液B2（200 μL的DMEM加1 μL的miR-21 mimic control，即NC，模擬物陰性對(duì)照，充分混勻靜置5 min），混合液C1（200 μL的DMEM加1.25 μL 的miR-21 inhibitor，充分混勻靜置5 min），混合液C2（200 μL的DMEM加1 μL的miR-21 inhibitor control，即NC，抑制劑陰性對(duì)照，充分混勻靜置5 min）。分別將混合液A與B1、B2、C1、C2混合，分別記為AB1、AB2、AC1和AC2，靜置20 min。吸出6孔板中培養(yǎng)液，加入1 600 μL DMEM，然后在正常皮膚的成纖維細(xì)胞組中分別加入AB1、AB2混合液，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞組中分別加入AC1、AC2混合液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后換成全培養(yǎng)液，48 h后提取細(xì)胞RNA行Real-time PCR檢測，72 h后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western-blot檢測。

1.6Western-blot檢測

上述不同組培養(yǎng)細(xì)胞用RIPA裂解液充分裂解離心取上清，蛋白定量，以10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳蛋白分離，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜后，用5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次（每次10 min），二抗室溫孵育1×，TBST洗3次（每次10 min），用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色。分別檢測Col1A1、Col3A1和Smad7的蛋白表達(dá)水平。

1.7細(xì)胞增殖檢測

將第2、3代成纖維細(xì)胞分組接種入12孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，結(jié)晶紫溶液行細(xì)胞數(shù)目檢測。細(xì)胞用PBS清洗后，在不同時(shí)間點(diǎn)用0.1%結(jié)晶紫溶液固定30 min，用PBS清洗干燥后掃描，再加10%乙酸，于搖床上洗脫，所得溶液檢測590 nm處吸光度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1瘢痕疙瘩組織學(xué)觀測

HE與Masson染色顯示，與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩組織中真皮乳頭減少，真皮網(wǎng)狀層中膠原增粗增厚，排列紊亂并異常沉積（圖1）。

2.2成纖維細(xì)胞的纖維化標(biāo)記物、miR-21及Smad7表達(dá)檢測

與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Col1A1、Col3A1和miR-21的表達(dá)顯著增加，Smad7表達(dá)降低（圖2）。

2.3miR-21模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)的影響

三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，正常皮膚成纖維細(xì)胞應(yīng)用miR-21模擬物后，相比對(duì)照組，miR-21靶基因Smad7的核酸及蛋白水平表達(dá)降低，Col1A1、Col3A1核酸及蛋白水平表達(dá)增加；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞應(yīng)用miR-21抑制劑后，相比對(duì)照組，miR-21靶基因 Smad7的核酸及蛋白水平增加，col1A1、col3A1核酸及蛋白水平表達(dá)降低（圖3-4）。

2.4miR-21模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染對(duì)成纖維細(xì)胞增殖能力的影響

在不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)晶紫染色法測定細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示，正常皮膚成纖維細(xì)胞應(yīng)用miR-21模擬物后，與對(duì)照組相比，在48及72 h，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞應(yīng)用miR-21抑制劑后，與對(duì)照組相比，在24、48及72 h成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組（圖5）。

圖1　正常皮膚和瘢痕疙瘩組織的組織學(xué)觀察Fig.1　Histological observation of normal skin tissue and keloids by HE staining and Masson trichrome staining

圖2　Real-time PCR檢測正常皮膚（NF）及瘢痕疙瘩（CF）成纖維細(xì)胞中Col1A1、Col3A1以及miR-21的表達(dá)（*：P<0.01）Fig.2　The relative expression of Col1A1,Col3A1and miR-21 in normal(NF)and keloid fibroblasts(KF)detected by Realtime PCR.(*:P<0.01)

圖3　成纖維細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-21模擬物和抑制劑后，Realtime PCR檢測Col1A1、Col3A1以及Smad7的表達(dá)Fig.3　The expression of Col1A1,Col3A1 and Smad7 detected by Real-time PCR in fibroblasts transfected with miR-21 mimics and inhibitor respectively NC:Negative control

圖4　成纖維細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-21的模擬物和抑制劑后，Western-blot檢測Col1A1、Col3A1以及Smad7的表達(dá)Fig.4　The expression of Col1A1,Col3A1 and Smad7 detected by Western-blot in fibroblasts transfected with miR-21 mimics and inhibitor respectively

圖5　成纖維細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-21模擬物和抑制劑后的增殖能力變化（P<0.01）Fig.5　The change of cell proliferation in fibroblasts transfected with miR-21 mimics and inhibitor respectively(P<0.01)

3　討論

瘢痕疙瘩是創(chuàng)口異常愈合過程中膠原合成和降解的失衡，引起以Ⅰ型膠原增粗增厚，排列紊亂為主要病理特點(diǎn)的疾病[13]。本研究中，我們首先確認(rèn)了標(biāo)本組織學(xué)上的病理學(xué)表型，然后檢測組織分離的細(xì)胞中Col1A1和Col3A1的表達(dá)，進(jìn)一步確認(rèn)分離的成纖維細(xì)胞具有組織中的生物學(xué)特性。

miR與多種病理疾病相關(guān)，且其中miR-196，miR-21等都有參與纖維化疾病的過程[14-15]。研究表明，在TGF-β1誘導(dǎo)的CAF轉(zhuǎn)化過程中，miR-21/ Smad7途徑發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[16]。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確認(rèn)，miR-21能直接調(diào)控smad7的mRNA 的3'-UTR，證實(shí)了smad7為miR-21的直接靶基因。既往研究表明，miR-21能通過TGF-β通路促進(jìn)增生性瘢痕形成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成[16]。miR芯片篩選結(jié)果顯示，miR-21在瘢痕疙瘩中同樣表達(dá)上調(diào)，本實(shí)驗(yàn)通過莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄和qPCR定量實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)顯著高于對(duì)照組。

為研究miR-21是否通過Smad7調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)分泌。本實(shí)驗(yàn)分別在瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞和正常皮膚來源的成纖維細(xì)胞中加入miR-21的抑制物和模擬物，發(fā)現(xiàn)miR-21模擬物能降低靶基因Smad7的表達(dá)，導(dǎo)致下游Col1A1及Col3A1的表達(dá)增加；而miR-21抑制物則起相反的作用。說明miR-21能直接降低Smad7的蛋白表達(dá)水平，從而增加細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。

為研究miR-21對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖能力的影響，我們分別在正常皮膚及瘢痕疙瘩組織來源的成纖維細(xì)胞中加入miR-21的模擬物和抑制物，發(fā)現(xiàn)miR-21模擬物組的細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，而抑制物組則相反。說明miR-21能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖能力。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-21能通過調(diào)節(jié)Smad7的表達(dá)促進(jìn)瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞的纖維化，不過Smad7是 TGF-β通路中的一個(gè)環(huán)節(jié)，miR-21與TGF-β1的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。此外，miR-21在體內(nèi)對(duì)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用也有待更為深入地探索。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)上調(diào)，一方面通過靶基因Smad7的表達(dá)下調(diào)，從而增加成纖維細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)分泌；另一方面，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖能力，說明miR-21在瘢痕疙瘩的形成過程中發(fā)揮了重要的作用。

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·論著·

【中圖分類號(hào)】R619+.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）03－0167－05

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.006

基金項(xiàng)目：上海市科委項(xiàng)目（12140904100）。

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

通訊作者：王丹茹（E-mail：wangdanru1776@163.com）。力等因素在瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，有報(bào)道認(rèn)為TGF-β信號(hào)通路與瘢痕疙瘩形成有密切聯(lián)系。TGF-β有三個(gè)亞型：TGF-β1，TGF-β2與TGF-β3。其中，TGF-β1主要參與Ⅰ型膠原的沉積和細(xì)胞的增殖，目前已知若干編碼細(xì)胞外基質(zhì)蛋白導(dǎo)致纖維化的基因被TGFβ-SMAD信號(hào)通路調(diào)節(jié)[4-6]。

收稿日期：（2016年5月4日；修回日期：2016年5月20日）

The Effect of miR-21 on Collagen Synthesis and Cell Proliferation of Fibroblasts in Keloid

ZHOU Renpeng,WANG Chen,WANG Danru.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:WANG Danru(E-mail:wangdanru1776@163.com).

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and function of miR-21(microRNA-21)in the formation of the keloid,and provide a new direction for the prevention and treatment of the scar.MethodsNormal skin tissue and keloid were harvested for histological detection and cell culture in vitro.Real-time PCR was used to detect the expression of mir21, Smad7,Col 1 A1 and Col 3 A1 in normal and keloid fibroblasts.The expression of Smad7,Col 1 A1 and Col 3 A1 with miR-21 mimics and anti-miR-21 oligonucleotides were also detected by Western-Blot and Real-time PCR.The cell proliferation was also detected by crystal violet assay.ResultsThe content of collagen was significantly higher in keloid tissue than that of normal skin.The expression of miR-21,Col 1 A1 and Col 3 A1 were higher in keloid fibroblasts than that of normal fibroblasts,while the expression of Smad7 was lower.After transfection,the expression of Smad7 was decreased,the expression of scar related genes and cell proliferation were increased in normal fibroblasts.And the contrast results were observed in keloid fibroblasts after transfection.ConclusionThe high expression of miR-21 can increase the expression of scar related genes and promote the proliferation of fibroblasts in vitro,which may be an important cause of the formation of the scar.

【Key words】microRNA;Keloid;Extracellular matrix;Cell proliferation;Fibrosis